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人参中主要活性成分治疗帕金森病的机制探究及验证

申报人:刘晋中 申报日期:2025-03-21

基本情况

2025创新项目
人参中主要活性成分治疗帕金森病的机制探究及验证 学生申报
创新训练项目
医学
中药学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
帕金森病(PD)是发病率仅次于阿尔兹海默的慢性神经系统退行性疾病,以其在老年人群中的高发性和对社会的危害性而备受关注。目前PD因及发病机制尚未完全明确,多数学者认为与环境因素改变、神经系统老化、遗传因素等相关。PD的治疗通常采用手术治疗和药物治疗,已经证实单胺氧化酶B型抑制剂对神经系统的损害具有保护改善作用,然而一些患者使用治疗PD的金标准药物左旋多巴效果微乎其微。因此,寻找针对性药物治疗PD尤为重要。已有诸多研究证实人参中皂苷类成分如Rg1、Rg3、Re等具有良好的神经保护作用,然而多成分、多靶点、多途径的协同治疗作用是中药“整体观”的内在本质。目前鲜有针对人参整体在PD治疗过程中作用机制的系统阐释,而网络药理学多靶点药物分子与生物系统网络分析的研究策略可有效探索多活性成分与疾病间的相关性,同时,分子对接作为一种计算机辅助药物设计方法,可基于物质结构预测潜在的配体-蛋白质结合,侧面验证网络药理学的预测。基于此,本研究利用网络药理学结合分子对接,探索人参抗PD的作用机制,同时利用动物模型进行体内验证,旨在探讨人参对PD小鼠的神经保护作用和作用机制。
参与2024年省级大创比赛并立项
主持厅局级1项,参与省部级2项,厅局级2项。指导大学生创新创业项目3项。
帮助团队明确项目目标、制定研究计划及实验方案,为学生提供专业知识的指导,帮助学生理解项目的理论基础,解答学术疑惑,同时协调时间管理及任务分配。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
刘晋中 药学院 中药学(3+4贯通培养) 2023 撰写项目书,文献查询
董雯昕 药学院 中药学(本科) 2023 WB实验验证
张博德 药学院 中药学(本科) 2024 网络药理学分析
武思雨 药学院 中药学(3+4贯通培养) 2024 对实验资料进行整理
高延欣 药学院 中药学(本科) 2024 分子对接分析
王潇睿 药学院 中药学(本科) 2023 ELISA实验验证

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
庞博 药学院
唐英栋 药学院

立项依据

基于先前实验结果,利用网络药理学及分子对接继续深入探究人参治疗PD的潜在机制,并结合实验验证预测结果的准确性。
一、网络药理学及分子对接
1.1 人参有效成分的筛选及靶点预测
通过TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索人参中的活性成分,以药物口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(Drug-likeness,DL)≥0.18作为参考标准进行筛选。同时于TCMSP数据库与PharmMapper数据库(https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)中检索每个活性成分对应的靶点,将所得靶点去重后即得活性成分相关靶点。借助Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)数据库查询靶标蛋白对应的基因名。
1.2 PD的靶点筛选
以“Parkinson’s disease”作为关键词,使用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)进行疾病靶点基因的检索及筛选,并删除检索结果中重复的靶点,得到PD的靶点。
1.3 人参治疗PD的潜在靶点预测
将人参和PD的靶点上传至在线作图工具Venny 2.1,将药物靶点与疾病靶点进行映射,绘制韦恩图,得到两者的交集靶点,作为人参治疗PD的潜在作用靶点。
1.4 活性成分-靶点网络及蛋白质相互作用(PPI)网络构建
将化合物、交集靶点分别导入到Cytoscape 3.7.1软件,构建活性成分-交集靶点网络,并对网络进行拓扑属性分析;将交集靶点上传至STRING v11.0数据库,物种限定为“Homo Sapiens”,置信度为0.9,删除游离节点,构建蛋白质相互作用(PPI)网络图。
1.5 GO富集分析和KEGG通路分析
利用Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index)对人参治疗PD的靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,利用微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)对生物功能、通路进行可视化分析,依据p-value<0.01筛选人参治疗PD的生物功能及信号通路。
1.6 成分-靶点分子对接
利用分子对接技术研究人参的活性成分及其治疗PD的相关靶点,能够在一定程度上说明活性成分与靶点蛋白的作用机制与结合活性。从pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载SDF格式的化合物结构并利用Chem 3D软件将SDF格式转化为mol2格式文件,从RCSB 数据库(https: // www.rcsb.org/)下载蛋白AKT1(PDB ID: 4GV1)、ALB(PDB ID: 1N5U)、EGFR(PDB ID: 4I24)、HSP90AA1A(PDB ID: 4BQG)、MMP-9(PDB ID: 4JIJ)的 PDB格式结构,使用Pymol软件去除溶剂分子与配体,使用AutoDock Tools 1.5.6 软件加氢、计算电荷、分配原子类型等,保存为pdbqt格式。最后运行Autodock vina 1.1.2进行分子对接,采用Discovery Studio 2020可视化分析对接构象[18]。
二、实验验证
2.1实验动物分组及给药
将32只雄性C57BL/6小鼠随机分成4组,分别为空白对照组(Control)、模型对照组(Model)、阳性对照组(P.C.)和人参组(Ginseng)。当中除空白对照组外,其余3组小鼠分别每日腹腔注射35 mg/kg MPTP,连续给药两周。空白对照组给予相同方式相同体积的生理盐水。两周后,P.C.组、Ginseng组分别灌胃给药以0.5%羧甲基纤维素钠为溶剂的70 mg/kg的卡左双多巴和0.78 g/kg的人参超微粉,连续给药两周。空白对照组和模型对照组按相同给药方式给予相同体积的空白溶剂。
2.2 ELISA检测血清中相关指标含量
行为学实验结束后,小鼠戊巴比妥钠麻醉,眼眶取血,离心冻存血清。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒分别检测小鼠血清中相关指标的含量。
2.3 Western blot检测相关蛋白表达
各组剩余小鼠取0.02 g脑组织,按试剂盒说明书要求加入裂解液对组织进行裂解,提取总蛋白,利用BCA试剂盒进行蛋白含量测定。配制10%分离胶、5%浓缩胶,上样,连接电泳装置,设置电压80V开始电泳,待样品电泳至分离胶时,再用120V电压继续电泳。之后以200 mA的电流,恒流电转50 min将胶片转至PVDF膜。转膜完成后,用TBST溶液漂洗3次。后将PVDF膜放进封闭液中,于摇床上室温封闭90 min。分别加入抗体,抗体浓度均为1:1000,4℃摇床孵育过夜,TBST漂洗,二抗室温孵育1.5 h,同法洗涤。取出 PVDF膜滴加显色液,在凝胶成像仪上进行曝光与图像采集。
三、统计方法
所有数据采用GraphPad Prism 5.0软件进行作图;SPSS 20.0统计软件进行统计分析处理,数据以均值±标准差(x̄±s)表示,两两比较采用LSD-t检验,多组比较采用单因素方差分析。P<0.05具有统计学差异。
PD是常见的中枢神经系统退行性疾病之一,PD的发病率仅次于阿尔茨海默病,尤其是中老年人患有PD的概率较高[1]。其临床症状多样而复杂,主要表现为患者在静止状态下出现不自主的震颤,严重影响日常生活和工作能力。此外,患者还会经历肌肉逐渐强直,这使得动作变得缓慢而笨拙,甚至难以完成日常活动。这些运动功能障碍不仅给患者带来身体上的痛苦,还可能导致心理压力增大。此外还会出现嗅觉功能减退、睡眠失眠、心理情感障碍、抑郁症等非运动功能障碍的情况[2]。病理特征为中脑黑质致密部(SNpc)多巴胺(Dopamine,DA)能神经元进行性变性缺失,导致黑质-纹状体通路DA水平降低[3]。
1.人参对帕金森病症的研究概括
现如今,中医药在PD预防与治疗中的应用越来越受重视,研究表明人参和三七等中药对神经系统疾病有很好的防治作用[2]。人参和三七中都含有多种皂苷成分,人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb1、三七皂苷Rh2、三七皂苷Rg1、三七皂苷Rg3等。其中人参皂苷能够抑制氧化应激反应以及炎症反应,减少神经细胞的死亡从而改善PD患者的运动障碍症状[4]。人参皂苷还能通过促进脑内DA的合成和释放,增加DA能神经元的数量和功能提高PD患者运动控制能力[5]。现着重总结了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb1对于PD症状的作用机制。
2.人参皂苷Rg1
人参皂苷Rg1是人参主要的活性成分之一,人参皂苷Rg1具有抗衰老,抗凋亡,营养等作用[6]。研究表明,人参皂苷Rg1可以通过抑制氧化应激来减轻DA诱导的细胞凋亡,并通过抑制细胞中的核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)活化来防止H2O2诱导的细胞凋亡[7]。还可以通过调节铁转运蛋白来降低铁含量,并且抑制脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞生长,起到MPTP诱导的SN多巴胺凋亡的保护作用[8]。有研究还揭示了中枢神经系统的抗炎活性,这被认为在抗击帕金森病方面发挥了有利作用[9],人参皂苷Rg1可抑制MPTP诱导的PD小鼠体内环氧化酶(COX-2)表达,这降低减少了炎症反应以及诱导的细胞凋亡,使SN多巴胺能神经元免于MPTP诱导的损伤,使运动障碍得到改善[10]。所以人参皂苷Rg1可以视为用作防治PD的药物之一。
3.人参皂苷Rg3
人参皂苷Rg3是人参主要的活性成分之一,研究发现,人参皂苷Rg3具有多种药理活性,包括抗肿瘤、抗炎、抗病毒与神经保护等[11]。研究表明,人参皂苷Rg3对非小细胞肺癌以及新冠病毒引发的部分症状都有较好的治疗效果[12]。人参皂苷Rg3能降低自由基水平,维持正常线粒体膜电位,改善受损线粒体氧化磷酸化功能,减少神经细胞凋亡[13]。据报道,人参皂苷Rg3能使脑脊液中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)产生减少,从而对脑缺血损伤具有保护作用[14]。经过候教授等人研究证实表明,人参皂苷Rg3在体外能够抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡,并能减轻鱼藤酮纳米脂质载体(R-NLC)诱导的PD模型大鼠运动障碍,减轻SN多巴胺神经元凋亡[15]。因此人参皂苷Rg3可以作为用作防治PD的药物之一。
4.人参皂苷Rb1
人参皂苷Rb1是人参主要的活性成分之一,研究发现人参皂苷Rb1,对α-突触核蛋白可以起到保护作用,人参皂苷Rb1可以改善PD小鼠的运动障碍,防止DA神经元死亡,并抑制α-突触核蛋白表达和星形胶质细胞增生[16]。还有报道发现人参皂苷Rb1可通过上调谷氨酸转运体GLT-1,改善MPTP诱导PD模型小鼠的运动障碍,防止DA神经元死亡[17]。此外,研究发现人参皂苷Rb1可以通过调控GABA能信号通路、GLT-1的表达以及α-synuclein/PSD-95等通路,来改善其运动失调、记忆能力和认知障碍[18]。因此人参皂苷Rb1可以视为治PD的药物之一。
5.人参皂苷Re
人参皂苷Re是人参主要的活性成分之一,具有突出的神经保护作用。据报道[19],人参皂苷Re对MPTP阳离子诱导的人骨髓神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤具有明显的保护作用,人参皂苷Re也可以挽救PINK1特异性缺失导致的线粒体电子传递链复合物Ⅳ活力改变[20]。此外人参皂苷Re还能抑制DA能神经元凋亡[2]。经过人参皂苷Re对PD果蝇模型的研究表明,人参皂苷Re通过改善线粒体膜的通透性,抑制线粒体内CytC的释放,进而维护线粒体功能稳态,激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高神经元抗氧化应激的能力,抑制线粒体介导的caspase-3凋亡通路,抑制神经元细胞的凋亡,对果蝇脑内神经元具有显著的保护作用[21]。因此人参皂苷Re可以作为用作防治PD的药物之一。
综上所述,通过检索和分析相关文献表明,通过对PD模型研究,人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re已被证明具有多种抗PD的活性(通过提高氧自由基清除能力对抗氧化损伤、降低脑细胞摄取减少脑内铁离子超负荷及铁诱导的氧化应激治疗PD、对神经细胞DNA产生保护作用、改善凋亡细胞膜流动性发挥抗凋亡作用、促进神经干细胞的增殖和迁移、减少DA神经元损失和DA损耗、降低Cav-1蛋白质的表达保护和修复DA能神经元等等)。为预防和缓解治疗PD病症提供了宝贵的科学依据,也为后续针对PD症状的药物研究打下良好的基础。
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利用多维度研究方法将网络药理学的系统分析与传统实验验证相结合。网络药理学可从整体层面预测人参活性成分与帕金森病相关靶点的复杂网络关系,而实验验证则能精准验证预测结果,二者相辅相成,突破单一研究方法的局限。通过深入挖掘人参这一传统中药在治疗帕金森病方面的潜在活性成分。打破对人参固有认知,探寻其治疗神经退行性疾病的新机制,为人参药用价值开拓新方向。​
运用网络药理学技术构建“药物 - 靶点 - 疾病”网络,借助大数据分析筛选关键靶点与信号通路,使研究更具系统性与前瞻性。以现代科学技术阐释传统中药的作用机制,促进中西医在帕金森病治疗研究领域的深度融合,为中医药现代化研究提供范例 。
1.技术路线:
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2.拟解决的问题:
(1)当前帕金森病的治疗主要是缓解症状,无法有效阻止或逆转疾病进展,且存在药物副作用等问题。本项目旨在探究人参活性成分是否能提供新的治疗途径,改善现有治疗的局限性,寻找更有效、低毒副作用且可能延缓疾病进程的治疗方法。​
(2)虽然人参在传统医学中应用广泛,但对于其治疗帕金森病的活性成分及其作用机制,缺乏深入的科学研究和清晰的阐释。本项目致力于通过网络药理学和实验验证,明确人参中具体发挥作用的活性成分,以及这些成分如何作用于帕金森病相关靶点和信号通路,填补这一领域的理论空白。​
(3)在帕金森病治疗领域,中西医结合治疗尚未形成完善体系,传统中药与现代医学理论的融合存在困难。本项目通过对人参治疗帕金森病作用机制的研究,探索中西医结合治疗帕金森病的有效模式,为临床应用提供理论依据,促进中西医在该领域的深度融合。
3.预期成果:
(1)通过网络药理学预测与实验验证,精准鉴定出人参中对帕金森病起关键治疗作用的活性成分,详细阐明这些成分作用于帕金森病相关靶点及信号通路的分子机制,形成完整的作用机制理论体系,填补该领域在人参治疗帕金森病机制研究的空白。​
(2)基于研究成果,提出以人参活性成分为核心的帕金森病新治疗方案,该方案有望改善现有治疗仅缓解症状、无法阻止疾病进展的现状,且能降低药物副作用,为临床治疗提供更有效、更安全的选择,推动帕金森病治疗领域的技术革新。​
(3)建立起传统人参药用理论与现代医学关于帕金森病研究相结合的桥梁,探索出中西医结合治疗帕金森病的有效模式,为临床实践提供理论指导,助力中西医在帕金森病治疗领域的深度融合,为后续更多中西医联合治疗方案的开发提供范例。​
1)2025年5月—2025年10月
a.收集相关文献,了解研究现状和趋势
b.设计实验方案,采购实验材料与器材,实验员培训
2)2025年11月一2026年4月
a.进行网络药理学分析
b.进行分子对接分析
3)2026年5月—2026年10月
a.Elisa实验验证
b.WB实验验证
4)2026年11月一2027年4月
a.整理实验数据
b.形成报告,完成结题
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
(1)先前已发表与本项目相关SCI一篇、收录中文核心期刊一篇。
(2)实验基础
a. 已证实人参水提液对MPTP构建的PD模型小鼠具有行为学改善作用:
通过多种行为学实验验证了MTTP对小鼠的行为功能障碍作用以及阳性药与人参对PD损伤的改善,结果见下图。根据实验结果可知,MPTP使得小鼠出现明显的类PD样行为功能障碍,而人参能有效改善这种负面影响。
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图 1 旷场实验小鼠休息时间
(与空白对照组比较,###P<0.001;与模型对照组比较,***P<0.001,n=8)
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图 2 定位航行活动轨迹图
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图 3 定位巡航距离
(与空白对照组比较,##P<0.01;与模型对照组比较,*P<0.05,n=8)
(与空白对照组比较,###P<0.001;与模型对照组比较,**P < 0.01,***P<0.001,n=8)
b. 已证实人参水提液对PD小鼠体内抗炎因子具有积极影响
人参水提液对MPTP诱导PD小鼠体内各炎症因子的水平变化,与空白对照组相比,模型组中各炎症指标均有显著性差异性变化,其中提升了促进炎症因子IL-1β和TNF-α的水平,降低了抗抑制炎因子IL-2的表达。
表1 人参水提液对MPTP诱导亚急性PD小鼠体内各炎症因子的水平(n=8)
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(与空白对照组比较, ###P<0.001;与模型对照组比较,***P<0.001)

a.具备条件
项目团队已完成人参提取及动物饲养等关联领域的文献系统梳理与深度研析,目前正有序推进实验室操作规范的前期研习与实务准备。
b.缺少的条件
项目团队在实验技术积淀方面尚存实践履历的空白亟待填补;同步面临科研经费的结构性缺口问题,因后续研究涉及关键性试剂的系统化采购,现有经费架构尚无法完全匹配项目全周期需求。
c.解决办法
建议项目组在科研实践层面建立创新性探索机制,深度介入实验场域开展系统性实证研究,同步构建问题导向的协同攻关体系,通过组内多维度知识共享平台化解技术障碍,并梯度化激活导师智库的定向支援机制。
在科研管理维度,需前置构建科学化预算编列规程,针对关键实验硬件的战略性配置需求开展精细化成本仿真建模,同步启动校方资助申报通路与多源资金筹措预案,形成覆盖项目全周期的弹性化资金保障架构。  

经费预算

开支科目 预算经费(元) 主要用途 阶段下达经费计划(元)
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 5000.00 2500.00 2500.00
1. 业务费 1500.00 500.00 1000.00
(1)计算、分析、测试费 0.00 0.00 0.00
(2)能源动力费 0.00 0.00 0.00
(3)会议、差旅费 0.00 0.00 0.00
(4)文献检索费 500.00 500.00 0.00
(5)论文出版费 1000.00 0.00 1000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 1000.00 500.00 500.00
4. 材料费 2500.00 1500.00 1000.00
结束