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山茱萸新苷调控铁死亡改善药物性肝损伤的机制研究

申报人：仲昭明 申报日期：2025-03-21

基本情况

2025创新项目
山茱萸新苷调控铁死亡改善药物性肝损伤的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
药物性肝损伤（DILI）是临床上常见的肝病类型，尤其是对乙酰氨基酚（APAP）过量引起的肝损伤，目前治疗手段有限且存在副作用。铁死亡（ferroptosis）是一种新型的铁依赖性程序性细胞死亡形式，在药物性肝损伤中的作用机制尚未完全阐明。山茱萸新苷是从山茱萸中提取的一种天然双环烯醚萜葡萄糖苷，具有抗炎、抗氧化和肝保护作用，但其在药物性肝损伤中的具体作用机制，尤其是对铁死亡的调控作用，尚未被深入研究。我们前期研究结果表明山茱萸新苷可显著缓解APAP诱导的药物性肝损伤，降低血清转氨酶水平，改善肝组织病理损伤。同时肝细胞的铁死亡指标也显著降低，提示山茱萸新苷可能通过调控铁死亡改善药物性肝损伤。因此我们拟结合体内（小鼠模型）和体外（HepG2细胞）实验深入研究山茱萸新苷对药物性肝损伤的保护作用及其对铁死亡的调控效果及具体机制，为肝损伤的治疗提供新的思路和实验依据，推动天然产物的药物开发。
       负责人作为主要成员参加2024年省级大学生创新训练项目1项，参与发表项目相关SCI论文1篇。已具备一定的科研思维，已经掌握动物饲养、蛋白免疫印记、氧化应激指标测定、ELISA等相关实验技术。
1.山东省自然科学基金，干扰素调节因8通过RIP3调控LPS介导的巨噬细胞程序性坏死参与急性肝衰竭发病及机制研究（ZR2021MH287），2022.1-2024.12，10万元，主持。（张惠）
2.济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金，白术内酯-I（ART-I）调控M1型巨噬细胞极化对急性肝衰竭保护作用及其机制研究（JYHL2021ZD01），2022.01-2024.12，20万，主持。（张惠）
3.济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金，山茱萸新苷调控髓源抑制性细胞对免疫相关肝损伤的保护作用及机制研究（JYHL2022MS21），2023.01-2025.12，10万元，主持。（闫风连）
4.山东省卫生健康委员会，Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对炎症性肠病发病的影响及机制研究（202202070388），2023.01-2024.12，2万元，主持。（闫风连）
       指导教师长期从事肝脏疾病发病机制及治疗策略研究，具有丰富的科学研究经验，在课题设计、实验技术等方面可以给予专业的指导。指导教师所在团队隶属于济宁医学院免疫学“泰山学者”实验室，依托于山东省细胞生物医疗技术重点实验室，济宁市免疫学重点实验室，具有完善的基础设施、实验设备及充足的科研经费，可为课题顺利开展提供保障。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
仲昭明 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2023 动物模型构建及组织病理学检测
孙滋旋 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2024 ELISA 检测
于骐瑞 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 氧化应激指标检测
张婷 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 Q-PCR 和流式细胞术检测
徐鹏飞 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 Western blot 检测
李雨晴 临床医学院（附属医院） 临床医学（圣地卓越医师班） 2022 细胞培养及凋亡检测

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张惠 基础医学院 否
闫风连 基础医学院 否

立项依据

1. 构建APAP诱导的药物性肝损伤体内、体外模型，明确山茱萸新苷对APAP诱导的药物性肝损伤的保护效应‌。
2. 通过流式细胞术、免疫荧光、Western blot等技术，揭示肝细胞铁死亡在山茱萸新苷保护APAP诱导的药物性肝损伤中的关键作用。
3. 阐明山茱萸新苷调控铁死亡相关靶点（如Keap1-Nrf2轴）保护APAP诱导的药物性肝损伤的具体分子机制，为药物性肝损伤的临床治疗提供新的思路及实验依据‌。
 1. 明确山茱萸新苷在APAP诱导的药物性肝损伤中的作用。
（1）构建APAP诱导的药物性肝损伤模型，摸索山茱萸新苷的用药浓度及给药时间。
（2）检测山茱萸新苷处理对APAP诱导的药物性肝损伤生存率的影响。
（3）检测山茱萸新苷处理对APAP诱导的药物性肝损伤相关指标的影响。
      a. 检测血清中转氨酶ALT、AST含量。
      b. HE染色观察肝脏组织学变化。
      c. TUNEL检测肝脏细胞凋亡。
      d. Q-PCR检测肝脏、脾脏中炎症相关因子表达水平。
      e. ELISA检测血清中炎症细胞因子的表达情况。
      f. 肝脏组织检测LDH、SOD以及GSH等氧化应激相关指标。
（4）体外培养HepG2细胞，构建APAP或 Erastin诱导的细胞死亡模型，加入不同浓度的山茱萸新苷处理，体外验证山茱萸新苷对APAP诱导的肝损伤的保护作用。
      a. CCK8法检测山茱萸新苷对APAP或 Erastin诱导的肝细胞死亡模型细胞活性的影响，摸索山茱萸新苷合适的用药浓度。
      b. 流式细胞术检测不同浓度的山茱萸新苷处理对APAP或 Erastin诱导的肝细胞死亡模型细胞凋亡情况影响。
      c.检测不同浓度山茱萸新苷处理的APAP或 Erastin诱导的肝细胞死亡模型细胞中氧化应激相关指标LDH、GSH、SOD等表达情况。
      d. 通过流式细胞术检测JC-1评估线粒体损伤，反应山茱萸新苷对APAP或 Erastin诱导的肝细胞死亡模型细胞的氧化应激影响。

2. 证明肝细胞铁死亡在山茱萸新苷保护APAP诱导的药物性肝损伤中的重要作用。
（1）体内实验：构建APAP诱导的药物性肝损伤模型，用不同浓度浓度的山茱萸新苷处理，Ferrostatin-1（Fer-1）为阳性对照。
      a. 检测肝脏组织中铁死亡关键指标MDA、LPO、Fe2+的含量。
      b. Western blot检测肝细胞铁死亡关键因子Nrf2、GPX4、xCT等的表达情况。
      c. 免疫组化检测Nrf2、4-HNE（LPO 标志物）表达
（2）体外实验：体外培养HepG2细胞，构建APAP或 Erastin诱导的肝细胞死亡模型，加入不同浓度的山茱萸新苷处理，检测山茱萸新苷对肝细胞铁死亡指标的影响。
      a. FerroOrange探针、C11-BODIPY染色、流式细胞术以及MDA试剂盒，分别检测细胞铁死亡关键分子中Fe2+、LPO、ROS及MDA的表达。
      b. Western blot检测铁死亡关键蛋白Nrf2、GPX4、xCT、铁蛋白（ferritin）、转铁蛋白受体（TfR）等的表达。

3. 山茱萸新苷调控肝细胞铁死亡保护APAP诱导的药物性肝损伤的具体分子机制。
（1）众所周知，Keap1-Nrf2信号通路对于保护肝细胞免受铁死亡至关重要。大量证据表明，许多天然化合物通过激活Keap1-Nrf2通路发挥其保肝作用。体外培养HepG2细胞，构建APAP或 Erastin诱导的肝细胞死亡模型，加入合适浓度的山茱萸新苷处理后，验证 Keap1-Nrf2信号通路在山茱萸新苷通过铁死亡保护肝损伤的作用。
      a．构建Nrf2荧光素酶基因报告系统，验证山茱萸新苷对Nrf2的调控作用。
      b．分离不同处理组细胞的细胞质和细胞核蛋白，Western blot检测山茱萸新苷对Nrf2入核过程调控作用。
      c．Western blot检测不同处理组细胞中山茱萸新苷对Keap1以及Nrf2下游蛋白NQO1表达的影响。
      d．加入ML385(Keap1-Nrf2信号通路抑制剂)，验证山茱萸新苷对 Keap1-Nrf2信号通路影响
      e．已知Keap1是Cul3依赖性Nrf2泛素化的关键调节因子，它通过泛素化和蛋白酶体依赖途径调控Nrf2的降解速率。检测Nrf2 mRNA表达水平，同时利用CHX或MG132处理细胞，验证山茱萸新苷对Nrf2的调控是发生在转录水平，还是蛋白合成或蛋白降解的过程。
      f．分子对接技术检测山茱萸新苷是否能够直接作用于 Keap1-Nrf2 复合体。
（2）体外培养HepG2细胞，构建APAP或 Erastin诱导的肝细胞死亡模型，加入合适浓度的山茱萸新苷处理后，收集样品，进行RNA-seq，分析不同处理组转录组表达差异，KEGG富集后筛选出可能影响肝细胞铁死亡的其他关键信号通路。然后通过Western blot技术检测关键信号通路的关键蛋白。利用RNAi技术敲低筛选到的关键蛋白的表达，确定山茱萸新苷调控肝细胞铁死亡的关键蛋白及信号通路。
       肝脏是人体重要的代谢、解毒及免疫器官，具有高度异质性。世界卫生组织统计，全球肝脏疾病已达到13亿，是全球主要的公共卫生问题之一，严重影响人类健康。药物性肝损伤（DILI）是由药物本身和/或其代谢产物对肝脏产生的直接性损伤，或使机体发生免疫反应而引起的肝脏损伤，是临床常见的肝脏疾病类型。目前，全球已上市的药物中可能引起DILI的药物有1100种以上，主要包括抗结核药类、中药、抗肿瘤药物、抗生素类、解热镇痛剂类等。全球每年每千人中就有2人发生DILI，在我国每10万人中就有约23.8人发生DILI，因此DILI具有较高的发病率，已成为重要的世界医疗安全问题[1]。但由于DILI缺乏特异性诊断指标，且发病机制复杂，目前可选择的治疗方式还非常有限[2, 3]，亟需寻找更有效的诊断标志物、治疗靶点及药物。
       对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）是临床常用的非甾体解热镇痛药，在常规剂量下是安全有效的，而超剂量使用则会引起急性肝损伤，是许多国家引起DILI和急性肝衰竭的常见原因[4]。APAP诱导的肝损伤（APAP‑induced liver injury，AILI）小鼠模型能高度模拟人类病理生理过程，是最常用的药物性肝损伤研究模型[5]。随着现代医学和微生物学领域研究设备和方法的持续改进，人们对AILI的作用机制有了更深入的认识。目前认为，毒性代谢物的产生、蛋白质加合物的形成（导致线粒体功能障碍和过氧亚硝酸盐生成）、氧化应激、DNA链断裂引发的细胞死亡等，是AILI发生的主要机制（图1）[6, 7]。涉及的主要信号通路包括：丝裂原活化蛋白激酶（ＭAPＫ）激活、线粒体膜通透性转变（MPT）、Keap1-Nrf2-ARE、瞬时受体电位阳离子通道亚家族 M成员２（TRPM2）等。其中Keap1-Nrf2通路是肝细胞对抗APAP诱导的氧化应激的核心防御机制，Keap1可通过与Nrf2结合介导Nrf2泛素化降解，调控其下游靶基因GPX4、GCLC、HO-1等关键酶，直接减轻氧化应激。因此破坏Nrf2与Keap1之间的蛋白相互作用，已成为激活Nrf2以治疗多种氧化应激相关疾病的重要策略[8]。
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                                                                图1.APAP致肝毒性的主要机制[6]

       细胞死亡是 DILI的重要特征，药物可通过诱导内质网应激和激活死亡受体等方式激活凋亡通路，诱导肝细胞凋亡或坏死，诱发肝损伤。此外，DILI 过程中还伴随着自噬、焦亡和铁死亡。其中铁死亡是一种近期发现的铁依赖性的细胞死亡方式，与脂质过氧化积累有关[9]，其发生依赖于谷胱甘肽（GSH）耗竭和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性抑制。GPX4负责利用GSH还原脂质氢过氧化物以中断自由基链反应。在AILI中铁死亡也扮演着重要角色[10]。过量的APAP经细胞色素 p4502E1（CYP2E1）转化为高活性有毒的中间代谢产物N-乙酰-对苯醌亚胺（NAPQI）。过多的NAPQI超出与谷胱甘肽（GSH）结合的能力，未结合的 NAPQI会共价结合到线粒体蛋白上，生成APAP-蛋白加合物，导致氧化应激增强和线粒体功能障碍。持续的氧化应激促使铁死亡发生，其特征为铁依赖性脂质过氧化，最终造成肝细胞死亡，引发肝损伤（图2）。在 AILI中铁死亡相关蛋白和基因表达也发生了显著变化。前列腺素-内过氧化物合酶2（Ptgs2）在APAP处理的小鼠中表达上调，而铁死亡调节蛋白GPX4和xCT的表达则因APAP刺激而下调。GPX4是维持细胞抗氧化防御、抑制铁死亡的关键蛋白，它能利用GSH消除膜磷脂氢过氧化物，其表达降低会使细胞对铁死亡的敏感性增加。xCT作为胱氨酸/谷氨酸逆向转运体，参与细胞内GSH的合成，其表达下调会减少GSH的合成，进一步加重氧化应激和铁死亡。同时APAP处理导致肝内亚铁离子积累，过多的游离铁通过Fenton反应产生大量活性氧（ROS），加剧脂质过氧化，推动铁死亡进程（图2）[11,12]。已有研究表明，铁死亡的特异性抑制剂Ferrostatin- 1可以增加APAP处理的原代肝细胞活性。敲低铁死亡的关键酶ACSL4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)可以减轻APAP诱导的肝细胞毒性和脂质过氧化 。此外，激活 Nrf2 通路调节肝细胞氧化还原稳态可通过抑制铁死亡来保护AILI[10]。
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                                                                     图2 APAP肝毒性模型[12]

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                                               图3 铁在APAP诱导的线粒体损伤中氧化应激的作用[12]

       目前唯一获批用于治疗AILI的药物是 N-乙酰半胱氨酸（NAC）。尽管其疗效有限，且补充制剂的口服生物利用度较低，但及时使用 NAC 对于AILI患者至关重要。传统中药及其化学提取物与合成药物相比，具有副作用少、毒性低、成本低的优势。因此自发现APAP的肝毒性以来，研究者们一直利用动物模型和细胞实验来研究各种植物化学物质或植物提取物是否具有保肝作用。研究表明，多种植物化学物质或植物提取物对APAP诱导的肝毒性模型具有保护作用[13]。水飞蓟素、姜黄素和小檗碱能够通过减轻氧化应激和炎症缓解APAP诱导的肝毒性。丹参能够通过调节抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化等方式减轻 APAP 诱导的氧化应激。五味子素B和五味子素C能够调节 CYP450 酶的活性，减少 NAPQI 的产生，从而减轻肝损伤。人参和黄芪具有免疫调节作用，能够调节免疫细胞的功能，减少炎症因子的释放，减轻肝损伤[13]。铁死亡作为APAP发生发展的关键因素，研究表明，也有多种植物提取物通过抑制铁死亡缓解APAP诱导的肝损伤。山奈酚是一种天然黄酮类化合物，可通过激活Nrf2信号通路，上调xCT和GPX4的表达，抑制AILI中的铁死亡[9, 14]。黄腐酚是源自啤酒花的天然成分，可通过共价修饰Keap1蛋白的三个关键半胱氨酸残基，激活Nrf2/xCT/GPX4信号通路，调节铁死亡相关蛋白（如GPX4、SLC7A11）的表达，减少脂质过氧化和铁积累，抑制铁死亡，从而缓解AILI[14]。樱花素也可通过激活Nrf2通路，上调GPX4和SLC7A11的表达，减少MDA和ACSL4（脂质代谢相关蛋白）水平，抑制ROS和脂质过氧化，从而缓解铁死亡。
       山茱萸是一种常用的中药，在我国有着悠久的使用历史，具有抗肿瘤、保护心肌、降血糖、调节骨代谢、保护神经元、抗氧化、保护肝脏、调控视黄醇、抗衰老、抗炎等多种药理作用。目前有 20 多种含有山茱萸的处方被用于治疗各种疾病[15]，其活性成分包括环烯醚萜及其苷、三萜、黄酮、鞣质、有机酸、多糖等。山茱萸新苷是从山茱萸果实中提取的一种天然双环烯醚萜葡萄糖苷, 具有有抗炎、抗氧化及免疫调节作用，对银屑病、阿尔兹海默症（AD）、缺血性脑卒中、肺损伤、脓毒症、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）等多种疾病均具有调节作用[16-18]。例如，在银屑病中，山茱萸新苷可通过ERK和JNK信号通路抑制M1型巨噬细胞极化，同时可减少Th1、Th17等炎性细胞的浸润以及炎性细胞因子的分泌，从而保护IMQ诱导的小鼠银屑病进展[19]。在阿尔茨海默病中，山茱萸新苷能减轻神经元损伤，减少淀粉样斑块病理、抑制 Tau蛋白磷酸化和修复突触损伤，促进胆碱能突触传递，抑制氧化应激和神经炎症，也可改善AD小鼠在Morris水迷宫、穿梭实验和避暗实验中的认知功能[19-21]。在缺血性脑卒中中，山茱萸新苷可通过调节肠道菌群，抑制 IL-17F/TRAF6/NF-κB通路改善大鼠的运动和神经功能，减少脑梗死体积，减轻神经炎症和肠道炎症[22]。在PM2.5诱导的肺损伤中，山茱萸新苷能够通过减轻炎症反应和血管通透性，调节炎症和自噬信号通路缓解肺组织损伤[18]。在脓毒血症中，山茱萸新苷能够通过抑制内皮细胞分泌高迁移率族蛋白B1（HMGB1）改善血管壁稳定性，并抑制HMGB1诱导的血管结构破坏，能提高盲肠结扎和穿刺（CLP）小鼠的存活率[23]。在EAE中，山茱萸新苷可降低EAE大鼠血液和病变处Th17细胞的数量和血清中IL-17A的水平，改善EAE大鼠脊髓的神经功能，抑制炎症浸润和脱髓鞘[24]。
       山茱萸新苷在肝保护作用方面的研究目前还较少，在Con A诱导的小鼠自身免疫性肝炎模型中，山茱萸新苷可通过抑制ERK/JNK信号通路，减少炎症因子（IL-6、TNF-α等）释放，并促进髓源性抑制细胞（MDSCs）募集，从而缓解肝损伤[16]。在四氯化碳诱导的急性肝损伤中，山茱萸新苷可通过恢复 CYP2E1 功能、抑制炎症反应和减轻氧化应激发挥保护作用[25]。但山茱萸新苷在APAP诱导的药物性肝损伤中的作用还未见报导。
       我们预实验研究发现，山茱萸苷预处理可显著降低APAP诱导的药物性肝损伤小鼠血清 ALT、AST 水平，减轻肝脏充血、组织损伤，减少肝细胞凋亡以及血清中炎性细胞因子含量。LPO是药物性肝损伤中铁死亡发生的典型特征，我们前期研究还发现，山茱萸新苷可降低肝脏中LPO的标志分子MDA的含量。同时，体外实验发现，山茱萸新苷可显著缓解APAP诱导的肝细胞铁死亡，铁死亡标志分子LPO、MDA以及Fe2+的含量显著降低。说明山茱萸新苷可能通过抑制肝细胞铁死亡保护APAP诱导的药物性肝损伤。鉴于Keap1-Nrf2通路是肝细胞对抗APAP诱导的氧化应激的核心防御机制，我们拟以Keap1-Nrf2通路为靶点深入研究山茱萸新苷通过抑制肝细胞铁死亡保护APAP诱导的药物性肝损伤的机制，并通过RNA-seq技术探索可能的新机制。

参考文献：

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创新点：
1. 创新性发现山茱萸新苷对药物性肝损伤具有保护作用，填补了该天然产物在药物性肝损伤治疗领域的研究空白。
2. 提出山茱萸新苷通过Keap1/ Nrf2/xCT/GPX4信号通路抑制铁死亡的新机制，创新性地发现其通过抑制 Nrf2 泛素化降解、促进核转位及抗氧化基因表达，抑制脂质过氧化和铁过载，为天然产物通过铁死亡通路干预药物性肝损伤提供实验依据和靶点。
项目特色:
1. 研究采用多层次实验设计（体内外结合），运用基因报告系统、Western blot 等技术，系统验证山茱萸新苷通过抑制铁死亡通路减轻药物性肝损伤的保护作用，为天然产物的肝保护应用提供实验依据。
2. 项目深入解析分子机制，揭示山茱萸新苷通过 Keap1/Nrf2/xCT/GPX4 信号轴调控铁死亡的关键作用，既阐明铁死亡在肝损伤中的病理意义，又为靶向药物开发提供理论支撑。
3. 该研究创新性地将天然产物活性与铁死亡调控相结合，通过多维度实验证实山茱萸新苷的低毒高效特性，为开发基于铁死亡通路的新型肝保护药物奠定理论基础。
技术路线
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拟解决的问题：
1. 探究山茱萸新苷在药物性肝损伤中的肝保护作用：
铁死亡（ferroptosis）作为一种新型的程序性细胞死亡形式，在药物性肝损伤中的作用机制尚未完全阐明。尽管山茱萸新苷已被证明具有抗炎、抗氧化和肝保护作用，但其在药物性肝损伤中的具体作用机制，尤其是对铁死亡的调控作用，尚未被深入研究。
2. 揭示山茱萸新苷通过调控铁死亡发挥肝保护作用的具体机制：
Keap1-Nrf2信号通路在抗氧化和细胞保护中起关键作用，但山茱萸新苷如何通过调控该通路发挥肝保护作用的具体机制尚不明确。
预期成果：
1. 研究将通过体内外实验证实山茱萸新苷对APAP诱导的药物性肝损伤具有显著保护作用，可显著改善ALT/AST等肝功能指标及肝组织病理损伤，并首次阐明其通过抑制铁死亡关键特征（铁过载、脂质过氧化及GSH耗竭）发挥作用的分子机制，为临床应用提供实验依据。
2. 项目预期揭示山茱萸新苷通过"Keap1-Nrf2-xCT/GPX4"信号轴调控铁死亡的级联机制，为铁死亡相关疾病（如癌症、神经退行性疾病）提供治疗靶点。
3. 研究成果将通过系统的机制解析和多维度技术验证，在国内外权威期刊发表1-2篇学术论文，为天然产物的精准药物开发提供理论模型。
2025.07-2025.12
开展体内和体外实验，检测山茱萸新苷预处理对APAP诱导的药物性肝损伤生存率以及肝损伤相关指标的影响。
2026.01-2026.06
开展体内和体外实验，检测肝细胞铁死亡在山茱萸新苷保护APAP诱导的药物性肝损伤中的作用，包括检测肝脏组织中铁死亡关键指标MDA、LPO、Fe2+的含量，以及肝细胞铁死亡关键因子Nrf2、GPX4、xCT等的表达情况。
2026.07-2026.12
体外培养HepG2细胞，构建APAP或 Erastin诱导的肝细胞死亡模型，加入合适浓度的山茱萸新苷处理后，验证 Keap1-Nrf2/xCT/GPX4信号通路在山茱萸新苷通过铁死亡保护肝损伤中的重要作用。此外同样处理，收集细胞后进行RNA-seq，分析不同处理组转录组表达差异，筛选出可能影响肝细胞铁死亡的其他关键信号通路并进行验证。
2027.01-2027.06
整理实验结果，并撰写论文、投稿，准备结题相关事项。
1. 与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
1.1 与本项目有关的研究积累
       
       本项目指导教师及其所在团队长期进行肝损伤相关研究，申请了多项相关研究课题，并且发表了多篇相关研究成果，能够给予相应的指导。近几年在肝损伤方面的相关研究成果如下：
（1）Zhang H#, Gao M#, Wang H#, Zhang J, Wang L, Dong G, Ma Q, Li C, Dai J, Li Z, Yan F*, Xiong H*. Atractylenolide I prevents acute liver failure in mouse by regulating M1 macrophage polarization. Sci Rep. 2025 Feb 1;15(1):4015.
（2）Yan F#, Li W#, Sun X, Wang L, Liu Z, Zhong Z, Guo Z, Liu Z, Gao M, Zhang J, Wang C, Dong G, Li C, Chen S*, Xiong H*, Zhang H*. Sappanone A Ameliorates Concanavalin A-induced Immune-Mediated Liver Injury by Regulating M1 Macrophage Polarization. Inflammation. 2024 Nov 26.
（3）Wang L#, Yan F#, Zhang J, Xiao Y, Wang C, Zhu Y, Li C, Liu Z, Li W, Wang C, Liu J, Zhang H*, Xiong H, Shi D. Cornuside improves murine autoimmune hepatitis through inhibition of inflammatory responses. Phytomedicine. 2023 Nov;120:155077.
（4）Yan, F., Cheng, D., Wang, H., Gao, M., Zhang, J., Cheng, H., Wang, C., Zhang, H*.,Xiong, H*., Corilagin Ameliorates Con A-Induced Hepatic Injury by Restricting M1 Macrophage Polarization[J]. Front Immunol, 2021. 12:807509.
（5）Wang H, Li X, Dong G, Yan F, Zhang J, Shi H, Ning Z, Gao M, Cheng D, Ma Q, Wang C, Zhao M, Dai J, Li C, Li Z, Zhang H*, Xiong, H*, Toll-like Receptor 4 Inhibitor TAK-242 Improves Fulminant Hepatitis by Regulating Accumulation of Myeloid-Derived Suppressor Cell[J]. Inflammation, 2021. 44(2):671-681
（6）Zhang H, Bai Y, Gao M, Zhang J, Dong G, Yan F, Ma Q, Fu X, Zhang Q, Li C, Shi H, Ning Z, Dai J, Li Z, Ming J, Xue Q, Si C*, Xiang H*, Hepatoprotective effect of capsaicin against concanavalin A-induced hepatic injury via inhibiting oxidative stress and inflammation[J]. American Journal of Translational Research, 2019. 11(5):3029-3038.
（7）Liu Z, Gao M, Yan F, Zhang H, Wang L, Zhao Y, Zhao H, Xie X, Li C, Dai J, Xiong H*, Zhang J*. Cucurbitacin IIb mitigates concanavalin A-induced acute liver injury by suppressing M1 macrophage polarization. Int Immunopharmacol. 2025 Feb 6;147:113964.
（8）Liu Z, Yan F, Zhang H, Wang L, Zhao Y, Zhao H, Li C, Dai J, Yu B, Xiong H*, Zhang J*. Zingerone attenuates concanavalin A-induced acute liver injury by restricting inflammatory responses. Int Immunopharmacol. 2024 Dec 5;142(Pt B):113198.
（9）Zhang J, Cheng D, Zhang H, Liu Z, Gao M, Wei L, Yan F, Li C, Wang L, Dong G, Wang C, Zhao M, Zhu Y, Xiong H. Interleukin 28A aggravates Con A-induced acute liver injury by promoting the recruitment of M1 macrophages. FASEB J. 2024 Jan 31;38(2):e23443.
（10）Yao X, Jin G, Liu D, Zhang X, Yang Y, chen Y, Duan Z, Bi Y, Yan F, Yang Y, Zhang H, Dong G, Li S, Cheng S, Tang H, Hong F*, Si C*, Inducible nitric oxide synthase regulates macrophage polarization via the MAPK signals in concanavalin A‐induced hepatitis[J]. Immunity, Inflammation and Disease, 2022. 10(7).
1.2 本项目的前期工作基础
1.2.1 确定APAP诱导的药物性肝损伤模型造模方法。
       有研究表明在构建APAP诱导的肝损伤模型时，是否提前饥饿至关重要。且在不同研究中使用的APAP的浓度也各有差异。因此在我们的实验条件下，我们设计实验对造模条件进行了重新探索。将小鼠分为5组：分别是对照组（无饥饿，无APAP）、300 mg/kg APAP 无饥饿组、300 mg/kg APAP 饥饿组、400 mg/kg APAP 饥饿组、500 mg/kg APAP 饥饿组。结果表明：在用300 mg/kg APAP造模时，饥饿组与不饥饿组相比，ALT、AST显著提高，说明模型成功的构建需要将小鼠提前饥饿。且随着APAP浓度的升高，ALT、AST逐渐升高，但是当APAP浓度升高至500 mg/kg时，出现部分小鼠死亡的现象，且其ALT、AST的含量与400 mg/kg APAP处理的小鼠并没有差异。因此我们后续的实验条件确定为，小鼠饥饿过夜后，使用400 mg/kg APAP腹腔注射造模，24 h后收集样品进行检测。
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图1 探索APAP诱导的药物性肝损伤模型的合适造模浓度和方式。与300 mg/kg APAP 饥饿组比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与300 mg/kg APAP 无饥饿组比###P<0.001

1.2.2 明确山茱萸新苷在APAP诱导的药物性肝损伤中的作用。
       为了初步验证山茱萸新苷在APAP诱导的药物性肝损伤中的作用，我们根据摸索后的造模浓度和方法将实验设计如下：购买6周雄性C57BL/6小鼠，于本实验室动物房内适应1周，分为4组：对照组（Control）；山茱萸新苷单独用药对照组（Corn）；模型组（APAP）；山茱萸新苷实验组（APAP + Corn）。具体过程如下：所有小鼠饥饿21 h后，将Corn组和APAP + Corn组小鼠尾静脉注射山茱萸新苷（10 mg/kg），3 h后APAP组和APAP + Corn组小鼠经腹腔注射APAP（400 mg/kg），24 h后收集血清及肝脏组织。研究结果表明山茱萸新苷可以保护APAP诱导的药物性肝损伤。具体实验结果如下：
（1）山茱萸新苷可显著降低APAP诱导的药物性肝损伤小鼠血清转氨酶的升高。
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                                                                       图2 小鼠血清中ALT、AST水平。**P<0.01，***P<0.001。

（2）山茱萸新苷可显著改善APAP诱导的药物性肝损伤小鼠肝脏的充血情况。
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                                                                                                 图3 小鼠肝脏组织照片。

（3）HE结果显示，山茱萸新苷可显著改善APAP诱导的药物性肝损伤小鼠肝脏组织病理损伤，肝脏组织充血显著减少。
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                                                                              图4 小鼠肝脏组织HE染色结果，放大倍数分别为100倍和200倍。

（4）Tunel染色结果显示，山茱萸新苷可显著减少APAP诱导的药物性肝损伤小鼠肝脏细胞的凋亡。
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                                                                               图5 小鼠肝脏组织Tunel染色结果，放大倍数分别为100倍和200倍。

（5）ELISA结果表明，山茱萸新苷可显著降低APAP诱导的药物性肝损伤小鼠血清中炎性细胞因子的表达。
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                                                                              图6 小鼠血清中炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-12/p40的表达。*P<0.05。

1.2.3 探索铁死亡在山茱萸新苷保护APAP诱导的药物性肝损伤中的作用
       近年来，越来越多的研究表明铁死亡在APAP诱导的药物性肝损伤中起重要作用，其机制主要涉及铁代谢紊乱、线粒体功能障碍及氧化应激网络失衡，但具体机制仍需深入探索。且有多项研究显示，一些天然产物可以通过抑制铁超载和脂质过氧化，减少肝细胞铁死亡发挥肝保护作用，例如松香酸、山柰酚、虾青素等。但山茱萸新苷是否可以通过调控铁死亡保护APAP诱导的药物性肝损伤还未有报导。众所周知LPO是药物性肝损伤中铁死亡发生的典型特征，我们前期研究结果发现，山茱萸新苷可以降低肝脏中LPO的标志分子MDA的含量（图7），说明山茱萸新苷有可能通过调控铁死亡保护APAP诱导的药物性肝损伤。
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                                                                                  图7 肝脏组织中MDA的含量。*P<0.05。

       我们体外培养HepG2细胞，体外检测了山茱萸新苷对APAP诱导的肝细胞铁死亡的影响。发现山茱萸新苷可以显著降低铁死亡标志分子LPO、MDA以及Fe2+的含量（图8）。进一步说明，山茱萸新苷可能通过抑制肝细胞铁死亡保护APAP诱导的药物性肝损伤。
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                                                       图8 山茱萸新苷对APAP诱导的肝细胞铁死亡标志分子LPO、MDA以及Fe2+含量的影响。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

       在这些前期结果的基础上我们提出假说：山茱萸新苷可通过抑制肝细胞铁死亡从而缓解APAP诱导的药物性肝损伤。因此我们后续拟以肝细胞铁死亡为靶点，深入研究山茱萸新苷调控肝细胞铁死亡保护APAP诱导的药物性肝损伤的具体机制。该假说还建立在国内外大量文献分析和推理的基础上，具有充分的理论依据，确保了研究目标切实可行。

       项目组成员已经熟练掌握构建APAP诱导的药物性肝损伤模型的方法，且也已熟练掌握完成本项目所需要的常用实验方法，例如QPCR、ELISA、免疫荧光、免疫组化、Western blot等，满足了体内和体外实验的技术需求。本项目组指导教师所在的实验室为济宁医学院“泰山学者”海外特聘专家实验室，依托于山东省细胞生物医疗技术重点实验室，山东省教育厅批准成立的免疫学和分子医学研究所，以及济宁市免疫学重点实验室，具有免疫学、细胞生物学、分子生物学相关研究必备的仪器和设备，例如流式细胞仪、倒置荧光显微镜、荧光定量PCR仪、化学发光仪、全波长酶标仪、高速冷冻离心机、超低温冰箱以及细胞培养间等，学校具备SPF动物房，因此现有的设备和实验条件已能满足本项目的实验需求，具备承担和完成本项目的实验条件。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 出版论文，购买ELISA试剂盒，Western Blot抗体、细胞培养等实验试剂、耗材及购买实验动物 12000.00 8000.00
1. 业务费 3000.00 无 0.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 出版论文 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 17000.00 购买ELISA试剂盒，Western Blot抗体、细胞培养等实验试剂、耗材及购买实验动物 12000.00 5000.00
结束

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