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间充质干细胞来源外泌体对骨组织修复的作用机制

申报人：梁如 申报日期：2025-03-21

基本情况

2025创新项目
间充质干细胞来源外泌体对骨组织修复的作用机制 学生申报
创新训练项目
医学
口腔医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目聚焦于探索间充质干细胞（MSCs）来源外泌体在骨折愈合中的修复机制及其临床应用潜力。外泌体作为细胞间通讯的重要递质，具有促进成骨分化、血管生成和软骨生成等功能，从而可用于骨组织修复重建，为骨折治疗提供了新型无细胞治疗策略。研究拟通过提取间充质干细胞外泌体，构建SD大鼠股骨骨折模型，并分梯度注射外泌体，通过影像学、组织学及分子生物学手段，观察分析外泌体在血管重建和骨痂形成中的作用效果，探索MSCs对骨组织修复的作用机制。项目创新性在于从促血管生成和成骨两个维度探究外泌体对骨组织的协同修复机制，为开发高效、安全的骨折治疗手段提供理论依据，有望缩短骨折愈合周期、降低并发症风险，推动再生医学的临床转化。
山东省科技创新大赛获得校级三等奖
1.刘伟伟老师承担并参与多项省级及校级科研课题，多次指导省级及校级大创项目
2.闫锐老师承担牙周病与心血管疾病的关系、牙周病与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系的机制研究
指导团队优化外泌体提取技术路线（如差速超速离心法参数调整），确保提取效率与纯度。协助改良SD大鼠股骨钻孔法骨折模型，提升模型与临床骨不连病理特征的吻合度。对项目组成员进行细胞培养（hucMSCs传代与无血清诱导）、外泌体鉴定及免疫组化的实操培训。每两周召开一次组会，审查实验进度，解决技术难题（如外泌体注射剂量优化、骨痂量化标准）。 针对阶段性成果（如模型验证数据、外泌体功能分析）提供专业反馈，调整研究方向。  
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
梁如 口腔医学院 口腔医学（本科） 2023 总体统筹与项目管理，撰写结题报告
陈乐 口腔医学院 口腔医学（本科） 2023 负责Micro-CT扫描、组织切片染色及图像采集
杨梅 口腔医学院 口腔医学（本科） 2023 负责实验操作与文献资料整理

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
刘伟伟 口腔医学院 否
闫锐 口腔医学院 否

立项依据

探究间充质干细胞来源外泌体对骨折修复的作用机制。
       1.采用组织块培养法提取人脐带间充质干细胞及超速离心法提取人脐带间充质干细胞来源外泌体并进行鉴定。30只12周龄SD大鼠随机分为假手术组(6只)和钻孔法骨折模型组(24只)。钻孔法骨折模型组采用改良的钻孔法构建骨折模型，术后12周随机选取改良钻孔法骨折模型组6只大鼠与假手术组6只大鼠进行Micro-CT及苏木精-伊红染色模型验证。验证骨折模型构建成功后，将钻孔法骨折模型组剩余18只大鼠随机分为3组，骨折端分别注射PBS(PBS组)、1.5×1011 particles/mL(低浓度外泌体组)、3×1011 particles/mL(高浓度外泌体组)外泌体。骨折术后4周进行影像学及组织学观察评估骨折愈合和骨组织血管生成情况。间充质干细胞分离培养及MSCs-exo提取：
(1)脐带间充质干细胞分离与原代培养：无菌条件下取新鲜脐带，去除动静脉，清洗后剪碎为小组织块，将组织块平铺于培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，隔日更换培养基。原代细胞扩增，当细胞融合度达约90%时，按1:2比例传代。
(2)传代培养与无血清诱导：选取第3-5代生长状态良好的人脐带间充质干细胞（hucMSCs）更换为无血清DMEM培养基，继续培养48小时以诱导外泌体分泌。
(3)外泌体提取（差速超速离心法）：收集细胞培养上清液，分步离心去除杂质： 1,500×g，4℃，5分钟，去除死细胞；2,000×g，10分钟，清除大颗粒碎片；10,000×g，30分钟，去除细胞器和微泡；最终100,000×g，4℃，1小时，超速离心，保留沉淀得到外泌体。
(4)外泌体鉴定与保存：纳米粒度分析仪验证外泌体粒径，透射电子显微镜观察外泌体形态，将鉴定及定量后的外泌体于-80℃保存，实验前用PBS稀释至所需浓度，用于后续实验。
2.构建动物骨折模型
(1)动物分组：30只12周龄雌性SD大鼠随机分为假手术组(6只)和钻孔法骨折模型组(24只)，钻孔法骨折模型组采用改良的钻孔法构建骨折模型，假手术组进行相同手术步骤。术后12周，钻孔法骨折模型组随机选取6只大鼠与假手术组大鼠进行Micro-CT 检查及苏木精-伊红染色，进行模型验证。 模型验证后钻孔法骨折模型组剩余18只大鼠骨折模型，然后随机分为3组(n=6)，对骨折端进行不同处理。
(2)模型构建：将大鼠麻醉后，在外科环境下，于胫骨结节上2 mm处，沿胫骨脊做纵向切口（切口大小1.5 cm）；充分显露胫骨后，用低速电钻（钻头0.3 mm）于胫骨结节下2 mm处，由胫骨外骨面向髓腔沿横截面钻3个等间距的孔（孔间距2 mm），可钻达髓腔但不破坏内侧骨外皮质；最后缝合切口，制成此模型。
3.外泌体注射
模型验证后将钻孔法骨折模型组剩余的18只大鼠骨折模型随机分为3组(n=6):PBS组骨折端注射100 µL PBS；低浓度外 泌体组骨折端注射100 µL浓度为 1.5×10¹¹ pariticles/mL的MSCs-Exos；高浓度外泌体组骨折端注射100 µL浓度为 3.0×10¹¹ pariticles/mL的MSCs-Exos，均为造模后即刻注射。
4.观察骨折愈合效果
(1)影像学评估：骨折术后4周，通过骨折愈合X射线片观察骨折线清晰度、骨折线连续性、骨痂形成量、骨痂成熟度、骨折端稳定性对骨折愈合情况进行影像学量化评估。
(2)Micro-CT三维扫描重建计算骨体积分数 ：骨折术后 4 周，股骨远端感兴趣区域用高分辨率Micro-CT(Nemo NMC-100，中国)进行扫描(参数设置：管电压90 kV，管 电流 60 μA)，使用Avatar 1.6.3 软件重建扫描图像，计算 骨体积分数(BV/TV)。
(3)苏木精-伊红染色及Masson三色染色：样本经EDTA脱钙、脱水包埋后切片，分别进行苏木精-伊红染色和Masson三色染色处理：HE染色通过梯度乙醇脱水复水，经苏木精-伊红双染及二甲苯透明后封片；Masson染色采用重铬酸钾媒染、铁苏木精染色，经丽春红-磷钼酸分化及苯胺蓝复染，最终脱水透明完成制片，两者均通过显微镜观察并记录图像。
免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡复水后，经胰蛋白酶抗原修复、过氧化氢封闭内源性酶及牛血清白蛋白封闭，依次孵育CD31和骨钙素一抗（4℃过夜）及对应二抗，DAB显色后苏木精复染，脱水透明封片观察。通过显微镜成像记录骨组织血管生成相关蛋白CD31及成骨标志物骨钙素的表达分布，DAB染色阳性区域呈棕黄色。利用Image J软件定量分析CD31与骨钙素阳性表达率，评估骨折愈合过程中血管生成与骨形成活性。
       目前因骨折的类型、部位以及严重程度的不同,骨折的治疗原则也截然不同,主要为手术治疗和采用石膏、夹板、外固定架等的保守治疗。但这两种常用治疗方法并不能完全解决患者的需求,可能出现骨折不愈合、骨折延迟愈合、骨折畸形愈合、骨折愈合慢、时间长、易错位等不良后果[1]。骨折愈合是一个复杂的过程,受成骨能力、生物力学环境、血液供应等多种因素影响，因此，各种促进成骨、血管生成的治疗方法被广泛应用于骨折修复研究。
外泌体作为一种无细胞治疗途径，近年来研究证实在促进骨折修复方面具有巨大的潜力。外泌体是大小30-100 nm的有双层脂膜分子结构的囊泡，可从多种类型细胞中释放，内含多种调节受体细胞行为的生物活性成分如mRNA、microRNA等，是细胞间信息通讯的重要递质[2]。外泌体与其母细胞生物学功能相似，具有良好的生物相容性、低免疫原性和低细胞毒性[3]。
       国内近年来深入研究发现,来源于间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)的外泌体可调控骨细胞、血管再生以及软骨骨痂从而促进骨折愈合,外泌体的研究为临床骨折的治疗提供了新的思路[4],从而可能减少骨折术后并发症,如治疗骨折不愈合、延迟愈合,缩短骨折愈合时间等。黄嘉燕等[5]研究发现外泌体能直接在转录水平调节其靶细胞，其中，miRNA在分化的各个阶段都是主要调节因子，通过降解mRNA或阻断翻译来调节生理和病理过程。陈瑞婧等[6]研究发现3D培养的hUC-MSCs来源的外泌体可上调成骨相关基因Runx2、Alp、Col1a1、Spp1的表达,表明外泌体具有的促成骨细胞分化的能力。马骢等[7]发现 huc-MSC-Exo可提高VEGFA表达水平，促进血管生成有关，可加快小鼠胫骨骨折修复。张鹤令[8]等研究发现hucMSC-Exos可能激活Wnt/β-catenin信号通路从而可进大鼠股骨干骨折愈合。王宪峰等[9]系统论证了高表达LncRNA H19 脐带间充质干细胞来源外泌体对软骨再生的促进作用,具体机制为LncRNA H19通过靶向miR-29b-3p/TGF-β1/Smad3通路促进软骨再生。
      国外Malekpour K综述了间充质干细胞和间充质干细胞外泌体在肌腱、软骨、无脊椎动物椎间盘、骨折和骨质疏松症治疗等致密结缔组织修复中的作用[10]，Zhang Y研究表明外泌体miR-21是通过上调NoTcH1/DLL4途径促进血管生成潜在细胞间信使，来修复大骨缺损[11]。Yahao G发现外泌体参与骨发育和分化，如破骨细胞分化[12]。Li P研究表明hUC-MSCs-Exos在促进软骨细胞增殖和迁移以及抑制软骨细胞凋亡方面具有很高的功效[13]。Hongxu Lu发现人脐带间充质干细胞外泌体模拟囊泡通过调节MAPK信号通路和ROS水平抑制DEX诱导的成骨细胞凋亡[14]。

参考文献
[1] RHINELANDER F W, BARAGRY R. Microangiography in bone healing. I. Undisplaced closed fractures[J]. J Bone Joint Surg Am, 1962,44-A:1273-1298.
[2] 李晓, 刘玲英, 柴家科. 外泌体的生物学特性及临床应用的研究进展[J]. 解放军医学院学报, 2015,36(10):1042-1044.
[3] 黄磊, 罗超, 宋嘉琪, 等. 间充质干细胞来源外泌体在骨关节炎治疗中的作用[J]. 生理科学进展, 2020,51(05):362-366.
[4] 朱欢, 赵军, 徐世红, 等. 人脐带间充质干细胞源性外泌体促进骨折愈合的研究进展[J]. 生理科学进展, 2024,55(06):590-595.
[5] 黄嘉燕, 梅钰婷, 胡春梅. 间充质干细胞来源外泌体在骨组织修复中的应用[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2024,44(11):1590-1598.
[6] 陈瑞婧, 冯韬锦, 程实, 等. 3D培养人脐带间充质干细胞来源的外泌体对成骨细胞分化的作用[J]. 解放军医学杂志, 2023,48(4):411-419.
[7] 马骢, 李刚, 马亮亮, 等. 人脐带间充质干细胞来源的外泌体调控血管内皮生长因子对小鼠胫骨骨折的修复作用研究[J]. 安徽医药, 2024,28(6):1092-1097.
[8] 张鹤令, 景青玲, 宗群川. 人脐带间充质干细胞外泌体对大鼠骨折愈合的影响及其作用机制研究[J]. 中国现代医学杂志, 2022,32(22):63-68.
[9] 王宪峰, 王锟, 孙晗, 等. 脐带间充质干细胞外泌体LncRNA H19修复软骨损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024,28(1):20-25.
[10] Malekpour K, Hazrati A, Zahar M, et al. The Potential Use of Mesenchymal Stem Cells and Their Derived Exosomes for Orthopedic Diseases Treatment[J]. Stem Cell Rev Rep, 2022,18(3):933-951.
[11] Zhang Y, Xie Y, Hao Z, et al. Umbilical Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosome-Encapsulated Hydrogels Accelerate Bone Repair by Enhancing Angiogenesis[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2021,13(16):18472-18487.
[12] Yahao G, Xinjia W. The Role and Mechanism of Exosomes from Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Inducing Osteogenesis and Preventing Osteoporosis[J]. Cell Transplant, 2021,30:83851975.
[13] Li P, Lv S, Jiang W, et al. Exosomes derived from umbilical cord mesenchymal stem cells protect cartilage and regulate the polarization of macrophages in osteoarthritis[J]. Ann Transl Med, 2022,10(18):976.
[14] Lu H, Zhang Z, Wang Z, et al. Human Mesenchymal Stem Cells-Derived Exosome Mimetic Vesicles Regulation of the MAPK Pathway and ROS Levels Inhibits Glucocorticoid-Induced Apoptosis in Osteoblasts[J]. Stem Cells Int, 2023,2023:5537610. 
外泌体的研究为临床骨折的治疗提供了新的思路,从而可能减少骨折术后并发症,如治疗骨折不愈合、延迟愈合,缩短骨折愈合时间等。近年研究发现外泌体因具有低致瘤性、 低免疫原性、便于获取、易于储存、促进肝再生以及 保护肾功能等优点,而在临床上得到广泛的应用。本课题从外泌体促血管生成和成骨两个维度探究外泌体对骨组织的协同修复机制。MSC-Exos 可以通过作用于成骨细胞、破骨细胞、血管内皮生长 因子以及软骨细胞4个方面促进成骨细胞分化、增殖和迁移,抑制破骨细胞分化,加快血管重建,促进 软骨修复,进而加速骨折修复：
1.MSC-Exos通过上调VEGF和缺氧诱导因子-1α、MSC-Exos的微小RNA(microRNA,miRNA)通过调控 MAPK信号通路显著 促进成骨细胞的分化与增殖的表达；另一方面，MSC-Exos通过促进骨形态发生蛋白2和Runt相关 转录因子2的表达，改善成骨细胞的分化能力。
2.MSC-Exos可以通过降低金属基质蛋白酶-9的表达而抑制破骨细胞的分化,其中,下调与破骨细胞分化相关基因和蛋白水平可能是发挥该功能的重要因素。
3.MSC-Exos通过加速VEGF和HIF-1α的表达；上调 NOTCH1/DLL4信号通路，促进血管内皮细胞增殖迁移；上调人类生长因子、血管性假血友病因子、血小板-内皮细胞黏附分子和血管内皮生长因子1，加速血管生成,恢复骨折断端周围血运情况,促进骨折的愈合。
4.MSC-Exos能增强软骨细胞的迁移和运动性，MSC-Exos通过减少软骨细胞中炎症细胞因子白介素6、白介素1β、γ干扰素和肿瘤坏死因子α的产生,增加软骨细 胞外基质成分的表达,可以显著影响炎症环境中的软骨细胞活性和基质重塑过程；MSC-Exos中的miR-92a-3p在 MSCs 中高表达可通过靶向信号通路WNT5a抗体促进软骨再生,亦可通过激活PTEN/AKT信号通路有效促进软骨细胞的增殖、迁移和合成代谢。

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拟解决的问题：
1.传统骨折治疗存在愈合周期长、手术创伤与风险、药物副作用显著、复杂骨折疗效不足等局限性，本课题旨在研究间充质干细胞外泌体从促血管生成和成骨两个维度，对骨组织缺损修复的作用影响。
2.本研究通过检测信号通路蛋白探究促进间充质干细胞来源的外泌体在促进血管内皮细胞增殖迁移，加速血管生成,促进软骨细胞的增殖、迁移和合成代谢的相关机制。

预期成果：
1.大体标本观察：与PBS组相比，外泌体组骨折愈合速度明显增快，骨折端骨痂生成量显著增加；
2.X射线片评分：外泌体组显著高于PBS组，差异有显著性意义(P < 0.05)；
3.Micro-CT三维成像：与PBS组相比，外泌体组骨折愈合加快，骨痂生成量显著增加；外 泌体组骨体积分数显著高于PBS组，差异有显著性意义(P < 0.01)；
4.苏木精-伊红染色和Masson染色：与PBS组相比，外泌体组有更多的骨小梁生成，有更多的新生骨组织生长；
5.免疫组织化学染色：与PBS组相比，外泌体组骨钙素与CD31的表达更加显著；高浓度外泌体组较低浓度外泌体组新生血管密度更大，骨痂生成量更多，骨折愈合增快，呈现浓度依赖性。
预期间充质干细胞来源外泌体可通过促进血管生成和成骨，最终促进骨折修复。

项目前期
2025年3月--4月 查阅文献并制定方案：系统检索国内外研究现状，明确创新方向，制定实验技术路线，明确动物模型构建、外泌体提取与鉴定标准。
2025年4月--6月 实验准备：采购人脐带样本、SD大鼠、DMEM培养基、胎牛血清、外泌体提取试剂盒等。校准超速离心机、Micro-CT等设备，完成实验室安全及伦理审批。
项目中期
2025年6月--9月 培养细胞与构建模型：分离原代人脐带间充质干细胞（hucMSCs），完成传代培养（P3-P5代）。构建多批次SD大鼠胫骨钻孔法骨折模型（假手术组6只，模型组24只），术后12周验证模型稳定性。
2025年9月--11月 外泌体注射：术后即刻局部注射外泌体，低浓度组注射100 µL浓度为1.5×10¹¹ pariticles/mL，高浓度组注射100 µL浓度为 3.0×10¹¹ pariticles/mL
2025年11月--2026年4月  等待骨折愈合：术后周常规饲养静置期，避免干预确保自然愈合进程。
项目后期
2026年4月--6月 骨折愈合效果观察:① 影像学评估②Micro-CT三维扫描重建计算骨体积分数③苏木精-伊红染色及Masson三色染色④免疫组织化学染色
2026年6月--2027年3月 数据整合与成果产出：① 统计分析：SPSS 26.0单因素方差分析（*P<0.05为显著），GraphPad绘制机制示意图；② 论文撰写：聚焦外泌体对骨折愈合的影响
（1）团队能力与经验
负责人曾参与山东省科技创新大赛获得校级三等奖，掌握细胞培养、普通动物模型构建及分子生物学实验技术（如分光光度计、PCR），具备独立设计实验方案及数据分析能力。
组员在生物技术实验中熟练掌握超速离心法提取外泌体、组织切片染色（HE、Masson）及显微成像技术。
（2）前期研究基础
已通过预实验成功分离人脐带间充质干细胞（hucMSCs），并通过透射电镜与纳米颗粒追踪分析（NTA）验证外泌体的形态与浓度（粒径30-150 nm，浓度≥1×10¹¹ particles/mL），技术路线可行性得到初步验证。初步建立SD大鼠胫骨钻孔法模型，Micro-CT显示术后4周骨缺损区域显著（骨体积分数下降约40%），表明模型构建方法可靠。
（3）文献与理论支持
团队系统梳理了近5年国内外关于间充质干细胞外泌体促进骨修复的文献如《Cell Stem Cell》《Biomaterials》等，明确了外泌体通过调控VEGF、BMP-2等信号通路的作用机制，为本项目提供理论框架。

（1）已具备条件：
实验设备：依托学院分子生物学实验室，配备超速离心机（Beckman Optima XPN-100）、CO₂培养箱、显微成像系统（Nikon Eclipse Ti）、Micro-CT（NEMO NMC-100）等核心设备。
技术支持：指导教师在骨再生领域发表可提供外泌体功能验证、动物模型优化关键技术指导。
（2）尚缺条件及解决方案
高分辨率透射电镜（TEM）：需外协至高校分析测试中心完成外泌体形态鉴定，已签订设备使用协议。
外泌体miRNA测序：计划申请校内“创新项目专项经费”覆盖测序成本，或与生物公司合作以优惠价格完成。
动物伦理审批：正在提交实验动物使用与管理委员会（IACUC）审核材料，预计2周内获批。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 16000.00 覆盖实验全流程开支，包括材料采购、数据分析及论文发表 4000.00 12000.00
1. 业务费 6000.00 无 0.00 6000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 依托实验室现有设备（超速离心机、Micro-CT）完成实验，无额外外包费用 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 实验室水电及设备能耗已由学院统一承担，无需单独列支 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 暂未规划学术会议及外出采购，后续根据实际需求调整 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 利用学校图书馆免费数据库资源，无额外文献下载费用 0.00 0.00
（5）论文出版费 6000.00 发表核心论文 0.00 6000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 依托实验室现有设备超速离心机、CO₂培养箱等，无新增设备需求 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无需特殊装置试制 0.00 0.00
4. 材料费 10000.00 细胞培养基、购置SD大鼠、试剂与耗材 4000.00 6000.00
结束

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