富含PTH mRNA工程化外泌体的水凝胶微球促进关节软骨再生修复的研究

申报人：刘蕾申报日期：2025-03-21

基本情况

所属批次:

2025创新项目

项目名称:

富含PTH mRNA工程化外泌体的水凝胶微球促进关节软骨再生修复的研究学生申报

项目类型:

创新训练项目

所属学科门类:

医学

所属专业类:

基础医学类

项目来源名称:

学生来源于教师科研项目选题

项目归属学院:

项目期限:

二年期

项目简介:

骨关节炎（OA）是以关节软骨退变为主要特征的退行性疾病，然而软骨再生修复仍面临巨大挑战。本项目前期研究发现特立帕肽（PTH）在软骨细胞增殖分化及软骨形成的诱导作用，但是关节腔局部药物注射治疗存在靶向性和利用度低诸多问题，为此我们前期开发一系列工程化细胞外囊泡，明显提高靶向治疗OA软骨病损的疗效。基于此，本项目拟利用化学生物学构建靶向递送PTH mRNA至软骨细胞的纳米载体递送体系，复合水凝胶微球构建缓释工程化外泌体PTH 的mRNA体系用于OA软骨再生修复。通过体外细胞、分子生物学及体内大小动物模型研究缓释的工程化外泌体mRNA对OA病理下的促成软骨分化、抑制软骨基质分解代谢及维持软骨细胞特性等作用及相关的生物学机制。研究结果将为OA软骨再生修复提供新的理论依据和实践方案。

负责人曾经参与科研的情况:

辅具大赛校级一等奖；积极参加挑战杯等赛事；

指导教师承担科研课题情况:

指导教师梁宇杰教授为济宁市关节与运动康复工程重点实验室主任，近年来主持4项省市厅级科研项目、参与多项国家级和粤港澳项目，入选2023年度及2024年度“全球前2%顶尖科学家榜单”。指导教授张元民教授为主任医师，济宁医学院康复学院院长，附属医院骨关节科主任，主持“医工融合智能康复医疗设备关键技术山东省工程研究中心”、“山东省智能康复工程研究中心” 及“平台类项目，项目导师的科研经费包括济宁医学院高层次人才科研启动经费总计 450万。

指导教师对本项目的支持情况:

指导项目整体设计、给予研发技术支持。

项目级别:

校级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	刘蕾	康复医学院	康复工程（本科）	2023	微球制备与表征	第一主持人
2	周玉洁	康复医学院	康复工程（本科）	2023	外泌体工程化改造	成员
3	张娜	康复医学院	康复工程（本科）	2024	干细胞靶向修饰	成员
4	时瑜婕	康复医学院	康复工程（本科）	2024	动物实验	成员
5	赵奕然	康复医学院	康复工程（本科）	2024	外泌体加载mRNA	成员

指导教师

序号	教师姓名	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	梁宇杰	康复医学院	否	第一指导教师
2	张元民	康复医学院	否	指导教师

立项依据

研究目的:

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种严重影响患者生活质量的关节退行性疾病。目前，全球OA患者数量高达5亿。随着人口老龄化，OA患病率将继续上升，给国家、家庭和个人带来沉重的经济负担。关节软骨发生退行性病变不仅是OA的主要病理特征，而且导致关节功能减退甚至丧失。目前，临床治疗仍然集中在缓解关节疼痛，改善症状以及人工关节置换术。迄今为止，尚无公认可阻止OA进展的治疗药物。因此，开发针对 OA 的修正性治疗方案，以抑制甚至逆转软骨的退行性病变，并恢复关节功能，是当前骨关节领域亟待攻克的重大难题。

本项目的前期研究发现特立帕肽（PTH）在软骨细胞增殖分化及软骨形成的诱导作用，但是关节腔局部药物注射治疗存在靶向性和利用度低诸多问题，为此我们前期开发一系列工程化细胞外囊泡，明显提高靶向治疗 OA软骨病损的疗效。基于此，本项目旨在开发一种创新的治疗策略，利用化学生物学构建靶向递送 PTH mRNA 至软骨细胞的纳米载体递送体系，从而促进OA（骨关节炎）关节软骨的再生修复。进一步通过缓释水凝胶微球和纳米载体体系实现靶向、持续释放PTH mRNA，从而在软骨细胞中诱导软骨分化、抑制软骨基质的分解代谢并维持软骨细胞特性，为OA软骨再生修复提供新的理论依据与治疗方法。利用水凝胶支架与外泌体的联合骨修复应用来促进软骨修复作用，通过对协同策略的深入了解，有助于开发更合适的软骨修复疗法。本项目的研究结果将为OA软骨再生修复提供新的理论依据和实践方案。

研究内容:

2.1 负载PTH mRNA的靶向外泌体的构建及功能验证

利用基因工程和化学修饰相结合的方法构建工程化外泌体负载PTH mRNA的体系。将外泌体膜蛋白CD63融合表达L7Ae促进含有C/D Box的PTH mRNA序列加载到外泌体腔内。对纯化获取的外泌体（PTH mRNA Exo）开展靶向间充质细胞的改造，将亲和肽E7展示于外泌体表面，产生具有SF-MSC靶向能力的E7外泌体（E7-Exo）。qRT-PCR检测外泌体包裹mRNA效率，荧光标记外泌体检测其递送到靶标细胞的效率。进一步评价靶向外泌体负载PTH mRNA诱导MSCs成软骨分化能力。前期我们已经完成载体的构建及外泌体稳定转染细胞株筛选相关实验工作。

2.2 负载mRNA药物的水凝胶微球制备和优化

将改性的明胶胶原蛋白和PTH mRNA的外泌体作为前驱体溶液，利用微流控技术制备制备单分散、粒径均一的水凝胶/外泌体微球。控制每一步的最佳反应配比、反应条件等，优化各参数对水凝胶微球制备影响。表征 GelMA 水凝胶微球的交联网状结构、孔径大小、降解性能，测试水凝胶微球的摩擦学、释药及细胞相容性等特性。并对水凝胶的组分、浓度及交联度进行设计，实现外泌体负载的mRNA药物的可控释放。

2.3关节液间充质干细胞(SF-MSCs) 靶向修饰及微团的制备

分离和培养关节液间充质干细胞，鉴定干细胞表面标志物和三系诱导分化能力。将SF-MSCs 与软骨基质亲和肽PIGF-2 进行点击化学反应，制备得到PIGF-2 修饰的靶向型MSCs(t-SF-MSCs)。考察t-SF-MSCs 的增殖能力、迁移能力能力，检验t-SF-MSCs与软骨基质的结合效果。将t-SF-MSCs与灭菌处理后水凝胶微球共培养，使t-SF-MSCs附着于水凝胶微球表面，检测水凝胶微球(三维)培养对t-SF-MSCs成软骨分化的影响。将t-SF-MSC形成的干细胞水凝胶微团与OA离体软骨共孵育一段时间后，收集并用清水冲洗离体软骨组织，考察软骨表面粘附结合的t-SF-MSCs 微团的数量。将近红外荧光标记 t-MSC s和t-MSCs水凝胶微团分别注射入大鼠关节，考察两组的荧光强度，从而确定 t-SF-MSCs 在关节腔内的驻留情况。探究干细胞微团对体外炎症诱导软骨细胞变性的保护潜力，采用免疫荧光染色和qRT-PCR方法检测4种OA相关基因的表达水平Agg和Col2α1，以及MMP13和ADAMTS5。考察t-MSCs微团的三维培养促软骨分化效果, 揭示三维培养体系促进 tMSCS定向分化及相关分子机制。

2.4 t-SF-MSCs 微团治疗 OA 的体内疗效评估

通过 DMM 手术，构建大鼠早、中期 OA模型。经关节分别注射生理盐水、t-SF-MSCs和 t- SF-MSCs 微团，获取大鼠膝关节标本，对膝关节进行组织病理学、影像学及特异分子的变化等检测，确定t- SF-MSCs 微团对软骨病损部位修复效果。对比传统高剂量、多次注射SF-MSCs治疗方案，考察单次及多次注射 t-SF-MSCs 微团治疗 OA 的疗效，通过多组学等检测干细胞微团靶向治疗 OA 的相关机制。

国、内外研究现状和发展动态:

3.1关节液间充质干细胞作为治疗OA的“新星”种子细胞备受关注

　虽然自体软骨细胞移植术（Autologous Chondrocyte Implantation, ACI）曾被视为治疗OA软骨病损的“金标准”，然而其存在“拆东墙补西墙”的不足，特别是体外扩增过程中软骨细胞容易去分化成纤维软骨细胞，从而影响软骨病损修复效果。随着间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）在OA治疗领域的应用日益广泛，尤其是OA患者关节液中含有大量的MSCs（SF-MSCs），来源于患者关节积液，属于医疗废弃物；同时具备很强的软骨分化能力，被视为治疗OA的“新星”种子细胞。本项目所在的实验室团队围绕“SF-MSCs治疗软骨缺损”已经进行了深入研究，并将研究成果发表在J TRANSL MED（2018）；Biomaterials（2021）等JCR一区期刊上。目前，如何诱导SF-MSCs定向分化成透明软骨细胞，成为OA治疗的研究热点。

3.2 PTH有望定向诱导MSCs成软骨分化，实现OA软骨病损的高效精准治疗

PTH是一种多肽化合物，可诱导MSCs 分化为软骨细胞，发挥保护关节软骨细胞的效应；在OA 小鼠模型中，通过多次注射PTH可促进软骨修复[6]。然而，PTH作为多肽存在容易降解、易被快速清除、生物相容性差、体内分布不理想和向细胞渗透能力低等缺陷，这些问题极大影响了小分子PTH多肽的效果。此外，反复进行关节腔注射PTH多肽会增加感染风险，从而加重OA 病情。蛋白质替代疗法是一种医疗手段，可以促进特定蛋白质或多肽的表达。传统的治疗方法通常涉及复杂的体外蛋白质生产和纯化过程，成本高昂。然而，随着mRNA药物技术的发展，尤其是在SARS-CoV-2疫情期间，mRNA药物的快速体内抗原生产能力得到了验证，为蛋白质替代疗法提供了新的治疗途径。这项技术的发展，包括体外转录mRNA和纳米脂质载体的应用，为临床前和临床应用中的mRNA作为治疗工具提供了新的可能性。因此，本项目将利用PTH mRNA在细胞内合成多肽，这样可高效诱导间充质干细胞成软骨分化。

3.3工程化外泌体为靶向递送至PTH mRNA提供新型载体

外泌体（Exosome）是一种由细胞分泌的膜性微囊小泡。作为细胞旁分泌的一种纳米级生物活性物质，外泌体广泛参与细胞之间的信息传递交换和相互调控，在纳米药物递送平台应用的领域越来越广泛。自2013年诺贝尔生理学和医学奖授予发现了“细胞的囊泡运输调控机制”的科学家，掀起了外泌体研究的热潮。由于外泌体不仅能穿过细胞膜，且不易引起免疫反应，为小分子药物的运输提供了新型生物相容性载体。然而，天然外泌体的靶向性较低，严重影响了外泌体的生物安全性和药物递送能力。因此，亟需提高外泌体对靶向组织的亲和力和药物的呈递效率。通过靶向性改造赋予外泌体对特定组织细胞的智能识别特性，提高外泌体的生物安全性和药物靶向递送能力。

3.4 胶原蛋白微球为提高MSCs归巢软骨基质能力，促进OA软骨病损修复与再生提供新的策略

在临床研究中，使用MSCs移植治疗OA时，常遇到的问题是大多数移植细胞无法靶向归巢到软骨损伤部位，影响软骨修复效果。如果能使移植的MSCs具备靶向结合软骨基质的能力，将有助于修复关节损伤。因此，本项目计划设计以胶原蛋白水凝胶为载体的MSCs微团，在胶原蛋白水凝胶微球中引入修饰了细胞外基质结合肽PIGF-2(123-144)的MSCs微团，赋予微球载体的MSCs微团具备靶向结合软骨缺损部位的能力。胶原蛋白是关节软骨的重要组成成分。人类软骨中主要的胶原蛋白类型是II型、IX型和XI型，以II型为主。然而，张兴栋院士的研究团队提供的证据表明，I型胶原蛋白水凝胶能促进MSCs向软骨分化。因此，作为干细胞微团的基质，究竟是I型胶原蛋白还是II型胶原蛋白更有利于修复软骨损伤尚无定论。重组胶原蛋白可成功解决了胶原蛋白来源的问题，并在烧伤治疗等医疗领域取得了巨大的成功。因此，本项目将分别构建重组I型和II型胶原蛋白干细胞微团，验证两种胶原蛋白在OA软骨修复中的效应，为明确软骨修复再生的胶原蛋白微球类型奠定理论基础和提供科学依据。

创新点与项目特色:

创新点：

创新点1. 创建新型的外泌体药物靶向递送体系，实现外泌体靶向递送至间充质干细胞，利用工程化外泌体提高所负载的PTH mRNA的生物学效应；

创新点2. 创建新型的间充质干细胞靶向体系，实现间充质干细胞特异归巢到病损软骨部位的能力；

创新点3. 研发复合工程化外泌体的胶原蛋白水凝胶，为利用工程化外泌体递送进行OA精准治疗提供有效的新型缓释载体。

项目特色：

多学科技术深度融合整合化学生物学（外泌体工程化修饰）、纳米技术（mRNA封装）与生物材料学（水凝胶微球设计），构建跨学科递送平台，兼具靶向性、缓释性和生物安全性，为基因疗法在OA治疗中的应用提供全新范式。全链条验证体系从体外细胞实验（基因表达、信号通路分析）到动物模型（，系统评估递送体系的短期疗效与长期安全性，并通过影像学（MRI）、组织病理学及分子生物学多维度验证修复机制，确保研究成果的临床转化可行性。临床转化潜力突出外泌体与水凝胶均为临床已应用材料，技术路线符合监管要求，且缓释系统可适配微创注射技术，未来可直接转化为关节腔注射疗法，为OA患者提供低成本、高依从性的治疗选择。

项目通过“工程化外泌体递送+水凝胶缓释”的双重创新，首次将PTH mRNA疗法与长效递送系统结合，填补了OA软骨修复领域靶向性差、疗效短暂的空白，兼具科学原创性与临床实用性。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

5.1技术路线

围绕构建靶向递送 PTH mRNA 至软骨细胞的纳米载体递送体系，复合水凝胶微球构建缓释工程化外泌体 PTH mRNA 体系，以实现 OA 软骨再生修复，具体如下：

图1.技术路线

5.1.1 构建靶向关节液间充质干细胞(SF-MSCs)的工程化外泌体及功能验证

利用DSPE-PEG将间充质干细胞靶向肽EPLQLKM (E7)结合到外泌体表面，获得具有间充质干细胞靶向性的工程化外泌体。通过实时荧光定量PCR和Western Blot检测成软骨分化相关指标（Col2A1、Aggrecan等）。

5.1.2 胶原蛋白水凝胶微球的制备及性能表征（图2）。

图 2. 胶原蛋白水凝胶化学合成示意图

5.1.3 采用微流控法制备复合工程化外泌体的胶原蛋白水凝胶微球 (图3)

图 3. 胶原蛋白水凝胶微球制备流程

5.1.3 SF-MSCs靶向软骨基质改造及验证

合成DSPE-PEG，利用所修饰的磷脂长链的疏水作用将PIGF-2多肽嵌入细胞膜中，实现间充质细胞特异性标记，利用Transwell 共培养体系验证其靶向性能（图3）。

图4.靶向软骨基质的间充质干细胞微团构建

利用胶原粘附试验静态检测SF-MSCs的靶向性；离体软骨组织检测间充质干细胞与软骨组织的结合力。

5.1.4 t-SF-MSCs微团与OA软骨外植体共培养研究（图5）

图 5.t-SF-MSCs微球与OA软骨外植体共培养

5.1.5 OA动物实验

建立大鼠OA 模型软骨缺损模型，工程化外泌体负载PTH MRNA靶向MSCs复合水凝胶微球注射到关节缺损处，通过X射线、micro-CT、组化和免疫组化等染色对病损部位修复效果进行评估，对动物的关节活动行为及生物力学等进行检测（图6）。

图 6.OA动物实验示意图

5.2拟解决的问题

1.外泌体递送问题：传统关节腔注射药物存在靶向性差、利用率低的问题，本项目拟通过将 PTH mRNA 与外泌体载体结合，利用外泌体的天然低免疫原性、高生物相容性和软骨细胞靶向性，实现 mRNA 的高效递送与精准调控，解决外泌体在 OA 软骨修复中递送效率低的问题。

2.基因疗法疗效短暂问题：现有基因疗法存在瞬时表达和重复给药的难题，本项目开发“外泌体 - 水凝胶微球”复合递送体系，通过可降解水凝胶微球的缓释特性，实现 PTH mRNA 在关节腔内的长期稳定释放（数周至数月），延长治疗效果，解决基因疗法疗效短暂的问题。

3.单一靶点治疗局限性问题：单一靶点治疗难以全面修复 OA 软骨损伤，本项目通过递送 PTH mRNA，在软骨细胞中同时激活促分化、抗分解代谢及维持细胞特性的多重信号通路（如 SOX9、COL2A1、ACAN 等），实现“诱导再生 - 抑制降解 - 维持稳态”三位一体的综合修复效果，突破单一靶点治疗的局限性。

5.3预期成果

1.学术成果

(1)在相关领域的学术期刊上发表高质量的研究论文，阐述本项目的研究方法、结果和创新点，为 OA 软骨再生修复领域提供新的理论依据和研究思路。

(2)参加国内外学术会议，分享研究成果，与同行进行交流和合作，提升项目的学术影响力。

2.技术成果

(1)成功构建靶向递送 PTH mRNA 至软骨细胞的纳米载体递送体系和缓释工程化外泌体 PTH mRNA 体系，优化外泌体工程化和水凝胶微球缓释体系的制备工艺，为 OA 软骨再生修复提供有效的技术手段。

(2)建立一套完善的外泌体和水凝胶微球的质量控制体系，确保其安全性和有效性，为临床应用奠定基础。

项目研究进度安排:

项目阶段项目时间项目目标

第一阶段 2025年1-6月外泌体载体系统的构建；

水凝胶微球的设计与制备；

根据策略制定实验计划并进行研究与评估。

第二阶段 2025年7-12月完善外泌体和水凝胶微球复合体系的优化；

进行实验制备微团并研究其性能，总结其分化机制并研究新策略。

开展动物模型中的初步实验，评估治疗效果。

第三阶段 2026年1-6月完成动物模型中的长期疗效研究；

分析体内外实验结果，优化治疗策略；

撰写并发布阶段性成果。

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

7）已有基础

1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩：

项目团队整体水平优良，任务分配合理，课题组成员均积极、热情，态度认真，成绩优异，在专业知识方面，如康复工程、系统解剖、生物力学等知识储备丰厚。并且具有科研能力和科研热情，积极参与文献调研。

指导老师梁宇杰作为高层次人才全职引进到济宁医学院，担任特聘教授，深圳市海外高层次人才，长期致力于骨与软骨组织工程学和再生医学、工程化外泌体靶向药物递送开发，以解决临床问题。近年来主持4项省市厅级科研项目，参与多项国家级和粤港澳项目。项目指导老师课题组已累积在国际权威杂志PNAS, Nature Communications, Biomaterials, Journal of the American Chemical Society,J Control Release, Theranostics，Molecular therapy，ACS Appl Mater Interfaces等发表SCI收录论文130篇，其中中科院一区论文15篇，论文被引用3,700余次，其中5篇文章列入ESI全球Top 1%高被引论文（Highly Cited Papers）,入选2023年度“全球前2%顶尖科学家榜单”。本课题组通过在外泌体表面修饰软骨靶向多肽或间充质干细胞靶向多肽，成功构建了针对软骨组织和间充质干细胞的药物递送系统（ACS Appl. Mater. Interfaces, 2020；Biomaterials, 2021；Theranostics, 2022），并系统性地阐述了外泌体递送平台的技术优势，相关研究成果已发表于多篇高水平学术论文（图7）。

图7.项目团队指导老师在工程化外泌体靶向药物递送领域的论文（第一/共一/通讯）

项目组前期工作如下

1.基因工程外泌体靶向递送核酸小分子miR-140抑制OA（图8）。

图8. 用于软骨修复的工程外泌体

图9. 工程外泌体修复软骨缺损

2.基因工程外泌体-脂质体杂交NPs靶向递送基因编辑治疗OA（图10-11）

图10.杂交外泌体靶向递送CRISPR-Cas9-sgRNA MMP-13治疗OA的示意图

图11. 杂交外泌体修复软骨缺损

3.基因工程改造外泌体靶向间充质干细胞递送KGN增强关节液间充质干细胞治疗OA （图12）。

图12. E7外泌体靶向关节液间充质干细胞递送KGN治疗OA示意图

图13.外泌体递送KGN靶向间充质干细胞(MSCs)治疗OA

4.化学改造红细胞来源外泌体治疗骨质疏松症(图14，15）。

图14.靶向破骨细胞的红细胞来源胞外囊泡（OT-RBCEVs）的分离、表面功能化和表征

图15. 靶向破骨细胞的红细胞来源胞外囊泡（OT-RBCEVs）递送anti-miR-214治疗骨质疏松

本项目实验方案设计合理，技术路线切实可行。指导教师在实验动物膝关节软骨缺损造模并植入水凝胶材料修复软骨缺损研究中有丰富的实战经验，为完成本课题研究打下了坚实的基础。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法：

本项目依托单位为济宁医学院，项目依托平台拥有“山东省智能康复工程研究中心”、 “山东省细胞生物医疗技术重点实验室”、济宁医学院公共科研平台、济宁医学院附属医院医学研究中心等实验平台总面积2500多平方米，拥有近9000余万元的科研设备，包括项目所需的FEI 120KV透射电镜、蔡司Elyra 7超高分辨显微成像系统、蔡司PALM MicroBeam激光显微切割系统、超高速冷冻离心机、Cell Discover 7活细胞工作站、蔡司LSM810激光共聚焦显微镜、化学发光和荧光扫描仪、流式细胞分选仪、荧光定量PCR 仪、冰冻切片机、病理图像分析系统等大型设备，以及各种电泳设备、旋转蒸发仪、离心机、冰箱、细胞培养和细菌培养等常规细胞与分子生物学设备。所依托的济宁医学院实验动物中心拥有SPF级动物饲养室，能够进行相关的动物实验以及动物实验样品分析的各种实验条件和设备，包括小动物吸入麻醉机、台式动物手术显微镜、小动物手术操作台、组织包埋机、全密封式组织脱水机、石蜡切片机、冰冻切片机、小动物Micro CT及小动物活体成像系统等，能够完全满足本项目小型动物实验需求。近期，学校及医院就筹建国家转化医学科学中心（上海）日照分中心和“济宁医学院转化医学研究院”与转化医学国家重大科技基础设施（上海）、上海交通大学转化医学研究院达成合作。

尚缺少的条件：

缓释系统的优化和长期效果的评估；

解决方法：

通过进一步的技术优化与多学科合作解决技术难点，确保研究的顺利推进。

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	20000.00	发表论文版面和订购实验室动物及水凝胶等	6000.00	14000.00
1. 业务费	8000.00	发表论文版面费	0.00	8000.00
（1）计算、分析、测试费	0.00	无相关计划	0.00	0.00
（2）能源动力费	0.00	无相关设备运营消耗能源计划	0.00	0.00
（3）会议、差旅费	0.00	无相关安排	0.00	0.00
（4）文献检索费	0.00	无特殊检索需求	0.00	0.00
（5）论文出版费	8000.00	发表论文版面费	0.00	8000.00
2. 仪器设备购置费	0.00	无	0.00	0.00
3. 实验装置试制费	0.00	无	0.00	0.00
4. 材料费	12000.00	订购实验室动物及水凝胶制备材料等	6000.00	6000.00

结束

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