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嵌合型组织血型抗原ALewisy的酶法合成及其功能研究

申报人：张佳乐 申报日期：2025-03-21

基本情况

2025创新项目
嵌合型组织血型抗原ALewisy的酶法合成及其功能研究 学生申报
创新训练项目
医学
药学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
嵌合型组织血型抗原其抗原决定簇以糖蛋白或糖脂等糖复合物或以游离寡糖或聚糖的形式存在，细胞间、细胞与细胞外环境通过其介导或调节，许多生理过程得到正常运行。有研究发现其能与幽门螺杆菌和诺如病毒等病原微生物竞争性结合。鉴于其重要的生物学意义，嵌合型组织血型抗原的合成近年来受到广泛关注。由于嵌合型组织血型抗原结构上的复杂性，其合成具有极大的挑战。本项目通过对糖链组装模块的重新编程，利用细菌来源的糖基转移酶精准控制复杂嵌合型组织血型抗原糖链骨架的定点岩藻糖基化修饰，从而实现嵌合型组织血型抗原ALewisy的大量高效制备。通过糖芯片技术高通量筛选出于嵌合型组织血型抗原ALewisy相互作用的糖蛋白、抗体、病毒和细胞等，为在分子水平揭示其作用机制以及发展相关疾病的新的诊断与治疗方法提供理论依据。
负责人利用周末和假期时间帮助老师进行一些科研课题与项目，并开展了一些与本课题相关的实验研究，目前已完成本课题酶法模块的构建工作，正在进行目标化合物的合成，这些工作为本课题的完成打下了坚实的前期基础。
指导教师现主持山东省自然科学基金青年基金项目 1 项（ZR2023QB265）、参与山东省青创团队 1 项、2023 和 2024 年指导学生获大学生创新训练计划校级重点项目 2 项（cx2023156z、cx2024173z ） ， 前 期 参 与 国 际 ( 地 区 ) 合 作 与 交 流 项 目（21961142016）、国基金面上项目（21877073），在酶的克隆表达及纯化、酶法模块的构建、寡糖的合成及糖肽的合成方面进行了系统研究，为本课题的顺利进行奠定了坚实的基础。
指导教师前期的科研项目均是关于寡糖酶法合成及分离纯化方面的研究，与本课题有很大的相关性和延续性，为本课题的顺利开展奠定了良好的基础并提供有力的理论和实验支持。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
张佳乐 药学院 药物制剂（本科） 2023 总体设计与实施
李响 药学院 药物制剂（本科） 2023 糖基受体的合成
贾丹宁 药学院 药学（本科） 2024 酶法模块的构建
翟俊杰 药学院 药学（本科） 2024 酶的表达与纯化
闵维昊 药学院 药物制剂（本科） 2023 ALewisy的酶法合成

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
方文元 药学院 否
刘静 药学院 否

立项依据

本项目的研究目的主要包括以下几个方面：
（1）通过对糖链组装模块的重新编程，实现嵌合型组织血型抗原ALewisy的快速高效合成。
（2）利用糖芯片技术高通量筛选出嵌合型组织血型抗原ALewisy相互作用的糖蛋白、抗体、病毒和细胞等，为在分子水平揭示其作用机制以及发展相关疾病的新的诊断与治疗方法提供理论依据。
本项目利用化学方法合成含烯基的糖基受体，通过对糖链组装模块的重新编程，实现嵌合型组织血型抗原ALewisy的快速高效合成，利用糖芯片技术高通量筛选出嵌合型组织血型抗原ALewisy相互作用的糖蛋白、抗体、病毒和细胞等，为在分子水平揭示其作用机制以及发展相关疾病的新的诊断与治疗方法提供理论依据。详细内容下：
（1）化学法合成含烯基的糖基受体
糖基受体的制备，如图1所示，我们以廉价易得的乳糖为受体底物，经过全乙酰化反应、脱异头位、imidate反应、糖苷化、脱保护五步简单的化学反应制备含有烯基的糖基受体，制备的含烯基的糖基受体可以作嵌合型组织血型抗原ALewisy的酶法合成的起始底物。

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                        图1. 含烯基的糖基受体化学合成
（2）酶法模块的构建
我们选取了5种酶法模块（Enzymatic modulars, EMs），用于嵌合型组织血型抗原ALewisy的酶法合成。每个酶法模块包含了相应的糖核苷酸合成酶和糖基转移酶专一性负责一种糖苷键的构建，通过利用简单的单糖作为供体的前体，避免了昂贵糖核苷酸的使用。通过对5个酶法模块的重新编程，成功将Gal、GlcNAc、GalNAc、Fuc四个单糖用于寡糖的快速制备。5个酶法模块的具体反应过程如下：
酶法模块1（EM1）：β1,3 GlcNAc糖苷化反应
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糖核苷酸合成酶BiNahK-EcGlmU在UTP、ATP及20 mmol/L Mg2+，100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲体系中，将GlcNAc转化为UDP-GlcNAc。GlcNAc在BiNahK的作用下先转化为GlcNAc-1-P，然后在EcGlmU的催化下转化为糖基供体UDP-GlcNAc。随后经HpLgtA催化，最后GlcNAc单元以β1,3-糖苷键的形式与受体Gal的C3位相连，获得糖苷键GlcNAcβ1,3Gal。

酶法模块2（EM2）：β1,4 Gal糖苷化反应
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在UTP、ATP及20 mmol/L Mg2+，100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲体系中，EcGalK催化半乳糖转化为Gal-1-P，随后BLUSP进一步将其转化为UDP-Gal，随后糖基供体经NmLgtB的催化，将半乳糖以β1,4-糖苷键的形式与受体GlcNAc的C4位相连，获得糖苷键Galβ1,4GlcNAc。

酶法模块3（EM3）：α1,2-Fuc糖苷化反应
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在GTP、ATP及20 mmol/L Mg2+，100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲体系中，BfFKP催化岩藻糖转化为Fuc-1-P，继续进一步将Fuc-1-P转化为GDP-Fuc，其在Hmα1,2FucT作用下，将岩藻糖以α1,2-糖苷键的形式与受体Gal的C2位相连，获得糖苷键Fucα1,2Gal。

酶法模块4（EM4）：α1,3 GalNAc糖苷化反应
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糖核苷酸合成酶BiNahK-EcGlmU在UTP、ATP及20 mmol/L Mg2+，100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲体系中，将GalNAc转化为UDP-GalNAc。GalNAc在BiNahK的作用下先转化为GalNAc-1-P，然后在EcGlmU的催化下转化为糖基供体UDP-GalNAc。随后经HmBgtA的催化，将GalNAc以α1,3-糖苷键的形式与受体Fucα1,2Gal的半乳糖的C3位相连，获得糖苷键GalNAcα1,3(Fucα1,2)Gal。

酶法模块5（EM5）：α1,3 Fuc糖苷化反应
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在GTP、ATP及20 mmol/L Mg2+，100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲体系中，BfFKP催化岩藻糖转化为Fuc-1-P，继续进一步将Fuc-1-P转化为GDP-Fuc，其在Hpα1,3FucT的催化下，将岩藻糖以α1,3-糖苷键的形式与受体LacNAc的GlcNAc的C3位相连，获得糖苷键Galα1,4(Fucα1,3)GlcNAc。

（3）嵌合型组织血型抗原ALewisy的酶法合成
嵌合型组织血型抗原对细胞间、细胞与细胞外环境进行介导或调节，使许多生理过程得到正常运行，因此对嵌合型组织血型抗原的科学研究具有重要的生物学意义。采用本实验室重新编程的酶法模块组装策略实现嵌合型组织血型抗原ALewisy的快速高效合成。具体的过程如图2所示，
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图2. 嵌合型组织血型抗原ALewisy的制备过程

化合物1的合成是以含烯基的乳糖为受体，经过EM1在1,3 N-乙酰氨基葡萄糖胺转移酶的催化下，在Gal的3位引入N-乙酰氨基葡萄糖，经过P2分离获得化合物1；接着在EM2 1,4半乳糖基转移酶的催化下，可以在化合物1的N-乙酰氨基葡萄糖的4位引入Gal，P2分离获得化合物2。化合物2在EM3 1,2岩藻糖转移酶的催化下，在末端Gal的2位引入岩藻糖，经过P2分离分别获得化合物3；接着在EM4 α1,3 N-乙酰氨基半乳糖基转移酶的催化下，可在末端Gal的3位引入N-乙酰氨基半乳糖，经过P2分离分别获得化合物4，最后在EM5 α1,3岩藻糖转移酶的催化下，在N-乙酰氨基葡萄糖的3位引入Fuc，P2分离获得嵌合型血型抗原ALewisy 5。

（4）嵌合型血型抗原ALewisy的生物学活性研究
在进行糖芯片筛选时，将嵌合型组织血型抗原ALewisy同时作为对照，并用糖蛋白、抗体、病毒和细胞进行高通量筛选。根据相互作用结果在分子水平揭示其作用机制以及发展相关疾病的新的诊断与治疗方法，同时为其他嵌合型组织血型抗原的功能研究提供理论依据。
   1950年，Leloir因首次发现了生物体内糖缀合物的合成需要活化的高能量糖核苷酸（例如UDP-Glc）作为供体而获得诺贝尔化学奖。上世纪末，Rademacher、Parekh、Dwek三人对于“糖生物学”学科的开辟，使人们对糖生物学和糖化学领域愈发重视1。迄今为止，人类对糖链结构的生源合成已有较为清楚的认识。糖类物质同核酸和蛋白质一样，也是一种信息分子，参与机体内的信号传递、蛋白质的折叠和组装，对于蛋白质功能的发挥起到至关重要的作用2。血型是对血液分类的方法，通常是指基于红细胞的分型，其依据是红细胞表面是否存在某些可遗传的抗原物质3。决定血型的抗原物质从组成成份上可以分为蛋白质抗原和糖抗原。红细胞上常见的含有岩藻糖的组织血型糖抗原主要包括三大类，即ABO(H)血型抗原4-7、Lewis血型抗原8-10和嵌合型血型抗原11, 12。
   嵌合型组织血型抗原，是由ABO(H)血型抗原和Lewis血型抗原嵌合而成，抗原表位决定簇为特定的五糖链，即ALewisy、BLewisy、ALewisb、BLewisb特征性糖链11, 12。从化学结构上分析，即在ABO(H)血型抗原A/B特征性糖链的基础上，进行α1,3/4岩藻糖基化修饰、或在Lewis血型抗原Lewisy、Lewisb的非还原端，分别引入α1,3-半乳糖或α1,3-N-乙酰氨基半乳糖；从生源合成上分析13，嵌合型组织血型抗原在生物体内的合成是在Type 1或Type 2二糖单元6的基础上，首先在FUT 2（α1,2-岩藻糖糖基转移酶）的作用下，生成H抗原特征性三糖结构即化合物8，之后在α1,3-N-乙酰氨基半乳糖或α1,3-半乳糖糖基转移酶的作用下，生成A或B特征性四糖结构化合物10或12。最后通过生物体内FUT 3（α1,3/4-岩藻糖糖基转移酶）的作用，合成复杂的嵌合型血型抗原11、13，如图3所示。

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        图 3 基于Type 1或Type 2二糖前体的嵌合型组织血型抗原的生物合成途径13

    嵌合型组织血型抗原其抗原决定簇可与蛋白质或脂质共价结合形成糖复合物或以游离寡糖或聚糖形式存在，能够介导或调节细胞间、细胞与细胞外环境的相互作用，在许多生理和病理过程中均发挥着至关重要的作用。有研究发现其能与幽门螺杆菌和诺如病毒等病原微生物竞争性结合，从而抑制病毒的侵染。诺如病毒是人类杯状病毒科诺如病毒属的一种圆形病毒，在过去十年中，利用分子诊断学研究表明，诺如病毒是除轮状病毒外，导致小儿急性肠胃炎爆发的首要元凶之一，诺如病毒能与肠道黏膜、分泌性组织等相结合，对人类的组织血型抗原具有结合竞争性13-16。研究表明，母乳喂养的婴儿感染诺如病毒的概率较低，主要是因为乳汁中含有较多的可溶性组织血型抗原，它们能够竞争性结合肠道黏膜表面的受体，从而降低婴儿感染病毒的可能性17。嵌合型组织血型抗原作为较复杂的组织血型抗原，在炎症反应和病毒感染等生物学过程中具有十分重要的生物学意义，在降低诺如病毒感染的可能性方面，已有不少文献报道。但是由于其分子结构复杂且糖苷键类型多样，嵌合型组织血型抗原的均一复杂糖链不能大量制备，目前对其全合成仍具有较大的挑战，这也严重影响了嵌合型组织血型抗原的生物学研究进展，阻碍了血清学的完善与发展。确定的糖链结构作为诸多研究的分子学工具，已被较多实验室通过不同的方法合成。目前常用的糖链合成策略包括化学法合成，酶法合成和化学酶法合成。
    糖链的化学合成具有较高的灵活性，为多种糖链的组装提供了可能，是糖链合成的主要方式。近年来，国际上多个课题组运用不同的化学法组装策略完成了许多复杂糖链结构的合成。2016年，俄罗斯科学院的Bovin课题组通过化学模块化组装策略，首次通过化学法完成ALewisy、BLewisy的合成12。同年9月，Bovin小组运用上述相似的方法首次实现了嵌合型组织血型抗原ALewisb、BLewisb的化学全合成11。但是，该方法需进行多步的保护、脱保护和糖苷化操作，目标化合物的总产率较低。
    糖链的酶法合成与化学的各自优点和不足之处都很明显。酶法合成虽然具有高效性、高立体和区域选择性，但是由于酶的来源有限，且具有严格的底物专一性，所以并不能实现所有糖链的组装。化学合成虽然合成效率低，但是通过不同保护基团的引入，可以得到一些酶法不能合成的糖链。由此可见，化学合成与酶法合成的结合应用能极大的增加糖链合成的多样性和复杂性。近年来，许多课题组通过化学酶法合成策略在糖链的合成方面做出了很多优秀的工作18, 19。2016年，曹鸿志课题组运用化学酶法合成策略，首次实现了全部15种天然ABO(H)血型抗原的系统性合成18。
    鉴于嵌合型组织血型抗原结构的复杂性，目前尚未有高效的合成策略对其进行快速合成，本项目发展了一种创新性的合成策略，通过对本实验室已有糖链组装模块的重新编程，达到精确控制复杂糖链骨架定点岩藻糖基化修饰的目的，继而实现嵌合型组织血型抗原ALewisy的快速高效合成并利用糖芯片技术对其功能进行研究。

主要参考文献
1. Rademacher, T. W., Parekh, R. B. and Dwek, R. A. Glycobiology[J]. Ann. Rev. Biochem. 1988, 57: 785-838.
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18. Ye, J., Liu, X. et al. Diversity-oriented enzymatic modular assembly of ABO Histo-blood Group Antigens[J]. ACS. Catal. 2016, 6(12): 8140-8144.
19. Meng, C., Sasmal, A. et al. Chemoenzymatic assembly of mammalian O-Mannose glycans[J]. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57(29): 9003-9007.
本项目的特色与创新点主要在于以下两个方面：
（1）本项目针对嵌合型组织血型抗原ALewisy获得性难的技术瓶颈问题，通过对糖链模块重新编程实现嵌合型组织血型抗原ALewisy的快速大量制备，为其他嵌合型组织血型抗原的快速、高效制备提供解决途径。
（2）利用糖芯片技术高通量筛选出嵌合型组织血型抗原ALewisy生物活性，为在分子水平揭示其作用机制以及发展相关疾病的新的诊断与治疗方法提供理论依据。
一、技术路线

本项目的技术路线如下：
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               图4. 本项目的技术路线

二、拟解决的问题
（1）针对嵌合型组织血型抗原ALewisy获得性问题，通过体外酶的表达纯化、糖链模块的重新编程，建立简便、高效的嵌合型组织血型抗原合成新方法，为其他嵌合型组织血型抗原的快速规模化制备提供新的解决途径。
（2）通过糖芯片技术高通量筛选嵌合型组织血型抗原ALewisy的生物活性并为其他生物活性寡糖功能的研究奠定基础。
三、预期成果
发表高质量论文1篇。
1. 2025年6月-2025年12月，采用化学方法制备含烯基的糖基受体，构建五个酶法模块。
2. 2026年1月-2026年12月，嵌合型组织血型抗原ALewisy的制备，糖芯片的高通量筛选。
3. 2027年1月-2027年6月，查缺补漏，整理结果，书写结题报告并发表相关论文，课题结题。
申报组指导教师一直从事多种复杂寡糖的化学酶法合成及糖肽的制备工作，在寡糖的化学酶法合成和糖肽制备方面打下了坚实的基础，同时也系统学习了寡糖合成相关酶类的克隆、表达与纯化等，在糖生物学方面积累了丰富经验。在济宁医学院人才引进政策给予的科研启动经费和山东省自然科学基金青年基金项目支持下，对复杂寡糖的化学酶法合成开展了系统的研究，具有丰富的开展科学研究及指导学生进行科研实验的经验，为本项目的顺利实施提供了有力的保障。
申请人所在实验室具备基本的化学合成、工程菌发酵、酶的分离纯化等实验条件和常规实验设备。单位还配有红外光谱仪、核磁、酶标仪、HPLC等仪器，基本的设施完全可以满足糖肽合成的需要。目前本项目组已经制备含烯基的糖基受体。基于以上说明，如果本项目获得资助，课题组基本不缺少其他实验条件，现有的实验条件可以保证及时顺利的完成任务。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 12200.00 7800.00
1. 业务费 10000.00 无 3200.00 6800.00
（1）计算、分析、测试费 4000.00 用于化合物的结构表征与分析 3000.00 1000.00
（2）能源动力费 200.00 购买实验相关材料的交通工具费 200.00 0.00
（3）会议、差旅费 2300.00 无 0.00 2300.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3500.00 用于发表论文的版面费 0.00 3500.00
2. 仪器设备购置费 2000.00 购买少量本实验必须的实验设备 2000.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 8000.00 用于购置合成所需的药品、试剂、低值易耗品 7000.00 1000.00
结束

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