济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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解码PAQR3—结肠癌抑制的分子开关

申报人：谢润东 申报日期：2025-03-21

基本情况

2025创新项目
解码PAQR3—结肠癌抑制的分子开关 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
结肠癌是全球高发的恶性肿瘤，本项目的开展将阐明PAQR3通过多通路调控抑制CRC进展的机制，并验证功能肽P6-55激活PAQR3、实现多通路同步调控的抗肿瘤潜力。
负责人曾参加过第十四届“挑战杯”济宁医学院大学生创业计划竞赛，有过相关的参赛经验，熟练掌握参赛流程。
主持山东省自然基金青年项目和山东省医药卫生科技发展计划面上项目各一项。
对本项目提供平台和技术支持，监督课题的实施情况及方案设计，促进课题的顺利实施。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
谢润东 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 检测P6-55对HCT116细胞增殖与迁移的影响、数据分析、文章撰写
张孜怡 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 构建HCT116细胞 PAQR3过表达和敲低稳定株
刘锦鹏 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 肿瘤组织分析，评估各信号通路关键蛋白表达
王伊凡 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 CCK-8、克隆形成实验、Transwell 实验分析增殖和迁移能力
王智慧 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 RNA-seq及数据分析靶标

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
尤雪 科研处 否

立项依据

结直肠癌（CRC）是全球高发的恶性肿瘤，肿瘤细胞的侵袭、转移和耐药性是导致治疗失败和预后不良的重要原因。PI3K-AKT、MAPK和Wnt信号通路在CRC的发生发展中具有核心作用，而其交叉激活是靶向治疗失败和耐药的重要机制。PAQR3作为高尔基体定位的抑癌分子，已被证实可通过调控多条通路参与肿瘤抑制，但其在结直肠癌中的多通路调控作用尚不明确，且功能肽P6-55在CRC中的作用和应用价值也未得到验证。项目前期通过细胞功能实验和RNA-Seq分析发现，PAQR3在HCT15细胞中具有抑制增殖和迁移的作用，敲低PAQR3促进HCT15细胞生长，而过表达和PAQR3功能肽P6-55处理可明显抑制细胞生长和迁移，并提示其作用可能与PI3K-AKT、MAPK和Wnt通路调控密切相关。
因此，本研究旨在进一步阐明PAQR3通过多通路调控抑制CRC进展的机制，并验证功能肽P6-55激活PAQR3、实现多通路同步调控的抗肿瘤潜力。同时，评估其在移植瘤和自发性肠癌模型中的抗肿瘤效果与安全性，为PAQR3靶向药物的开发及多靶点协同干预策略提供理论基础和实验支持，具有重要的科学意义和临床转化价值。
2.1 PAQR3及P6-55对结肠癌细胞增殖与迁移能力的调控作用
1）PAQR3在结肠癌细胞中的功能研究：分别在HCT15和HCT116细胞中构建PAQR3稳定敲低及过表达模型，采用CCK8法、克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验验证PAOR3对细胞增殖与迁移能力的影响；
P6-55对结肠癌细胞的生物学行为影响：通过同样的方法验证P6-55在HCT15和HCT116细胞中的功能，初步验证PAQR3和P6-55的肿瘤调控作用。
2.2 结合RNA-seq分析揭示PAQR3和P6-55调控结肠癌发生发展的分子机制
1）RNA-seq差异基因分析：完成PAQR3敲低及P6-55处理的HCT15细胞进行RNA-seq分析，筛选差异基因，绘制火山图和热图。
2）信号通路富集分析：利用GO、KEGG和GSEA富集分析筛选差异基因，聚焦主要信号通路（前期研究基础中已筛选PI3K-AKT、MAPK、Wnt三条通路）。
3）差异基因与通路的验证：在HCT15与HCT116细胞中通过qPCR和Western blot验证差异通路基因表达。
4）蛋白相互作用验证：通过Co-IP实验探索PAQR3及P6-55与PI3K、MAPK、Wnt关键蛋白的相互作用关系。
2.3 P6-55在小鼠皮下成瘤模型中的作用与机制验证
1）成瘤模型构建与肿瘤生长观察：构建HCT15细胞裸鼠皮下成瘤模型，评估P6-55干预对肿瘤生长速度、体积和裸鼠生存期的影响。
2）肿瘤组织病理和增殖/凋亡检测：收集瘤组织，HE染色、Ki67和TUNEL检测评估肿瘤细胞增殖与凋亡情况。
3）信号通路蛋白水平验证：Western blot及IHC分析肿瘤组织中PI3K-AKT、MAPK、Wnt信号通路关键蛋白表达水平，确认体内通路变化与体外实验结果一致性。
2.4 P6-55在APCmin自发性结肠癌模型中的作用及人体组织样本初步验证
1）自发性结肠癌模型的构建与监测：建立APCmin自发性结肠癌小鼠模型，长期给与P6-55处理，监测体重、结节数目和生存期，评价其长期疗效。
2）组织水平功能与机制研究：取肿瘤组织进行HE、Ki67、TUNEL及EMT相关蛋白检测，评估肿瘤组织增殖和凋亡情况及肿瘤转移相关生物学特征。
3）人结肠癌肿瘤组织样本验证:同步收集30例经伦理批准的人结肠癌组织及癌旁组织，检测PAQR3及PI3K-AKT/MAPK/Wnt通路关键分子表达水平，结合动物和细胞实验形成完整闭环。
本项目旨在通过系统研究，探索PAQR3及功能肽P6-55对结肠癌生物学行为的调控作用及潜在机制，结合细胞模型、动物模型及人体组织样本验证，最终为结肠癌的创新治疗手段提供理论基础和临床应用前景分析。
3.1结直肠癌的信号通路异常及多靶点干预需求
结直肠癌（CRC）是全球范围内高发的恶性肿瘤，2022年全球结直肠癌发病约192.6万例，标化发病率18.4/10万，死亡率达8.1/10万，严重威胁人类健康和生命安全。肿瘤细胞的侵袭转移与化疗耐药性突变是导致治疗失败的重要原因。目前临床上针对CRC的靶向治疗策略存在通路干预单一、长期疗效不足及易产生耐药等局限，迫切需要探索多靶点、协同调控的新型治疗策略。
近年来研究发现，结直肠癌的发生和发展离不开多个信号通路的持续激活和复杂交互作用。其中，PI3K-AKT、MAPK 和 Wnt/β-catenin 通路被认为是肿瘤进展中的三条关键信号通路，不仅在肿瘤发生早期便参与细胞恶性转化过程，而且贯穿肿瘤增殖、迁移、血管生成、免疫逃逸及耐药性形成等多环节，是驱动癌症恶化的重要分子基础。PI3K-AKT通路的持续激活已被证实与结肠癌细胞增殖、侵袭、转移及化疗耐药密切相关，例如奥沙利铂与天然产物10-HD组合能够抑制该通路活性，诱导细胞凋亡[1]。MAPK通路则通过Ras-Raf-MEK-ERK级联反应调控细胞周期与迁移能力，而在PAQR3缺失模型中ERK活性明显增强，说明其异常激活在肿瘤进展中具有重要作用[2]。Wnt/β-catenin通路被认为是CRC发生的“始动通路”，同时在维持肿瘤干细胞状态、促进血管新生与转移中起核心作用，例如大黄素通过下调Wnt/β-catenin通路相关基因表达显著抑制CRC移植瘤生长并减少肿瘤血管密度[3]。这些通路在肿瘤微环境调控和化疗耐药中同样扮演着关键角色，其交叉激活往往是单一靶点治疗失败的重要原因。
3.2 PAQR3在结肠癌中的潜在抑癌功能
PAQR（Progestin and AdipoQ Receptor)家族是一类孕酮和脂联素受体相关的蛋白质家族，广泛参与细胞信号转导、能量代谢、细胞增殖与分化等生物学过程。PAQR3作为该家族关键成员，主要定位于高尔基体，是近年来被鉴定为具有重要肿瘤调控功能的基因。大量研究表明，PAQR3在乳腺癌、胃癌、食管癌及肝癌中表现为抑癌分子，其通过调控多条关键信号通路发挥生物学效应[2，6，7]。PAQR3可以通过与Raf蛋白相互作用抑制MAPK通路，影响Ras-Raf-MEK-ERK轴的信号传递；同时，PAQR3还能负向调控PI3K-AKT信号，在非小细胞肺癌细胞中已经被证实具有重要的抑癌作用[4]。此外，它还通过将GPCR Gβγ亚基锚定在高尔基体，削弱其信号活性并阻断与下游蛋白的结合，从而对GPCR相关信号产生抑制[2]。PAQR3功能性多肽段P6-55（其N末端第6-55个氨基酸残基）在动物实验中已被证实能够显著抑制胃癌生长[5]，为靶向PAQR3的药物开发奠定了基础。目前关于PAQR3在结肠癌中的研究仍显不足，缺乏系统性机制解析、动物模型和临床样本验证，且其多通路调控作用及P6-55的应用价值仍需进一步探明。
基于此，前期研究结果显示，PAQR3在HCT15细胞中具有显著的抑制增殖和迁移作用，PAQR3敲低促进HCT15细胞生长与迁移，而过表达则明显抑制这一过程。同时，PAQR3功能肽段P6-55同样表现出抑制细胞增殖和迁移的潜力。RNA-Seq及富集分析提示，PAQR3可能通过调控PI3K-AKT、MAPK和Wnt等关键信号通路发挥作用，为深入揭示其分子机制提供了坚实基础。
然而，PAQR3在结直肠癌中的表达谱、功能作用及其分子调控网络尚未明确，其是否通过协调PI3K-AKT、MAPK和Wnt通路发挥多通路综合调节效应仍缺乏系统研究。同时，PAQR3功能肽P6-55在CRC中的潜在抗肿瘤活性及临床应用前景尚未得到验证。因此，本研究旨在聚焦PAQR3及P6-55在结肠癌中的生物学作用，深入探索其对关键通路的调控作用及其抗肿瘤潜力。通过构建从细胞、动物到人体组织的多层次验证体系，揭示“PAQR3-多通路调控轴”在CRC进展中的功能机制，为突破单一通路治疗瓶颈，提出多靶点协同干预策略，推动创新抗肿瘤药物的转化应用提供科学依据。
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参考文献
[1]安昱,李辉,刘雅鑫,等. 基于PI3K/Akt/GSK-3β通路探讨王浆酸联合奥沙利铂对结肠癌CT26细胞增殖、迁移及凋亡的作用机制 [J/OL]. 中国医院药学杂志, 1-11[2025-03-16].http://kns.cnki.net/kcms/detail/42.1204.r.20241028.1112.002.html.
[2]吴水梅, 郑燕, 刘茂生, 李腾政, 万倩, 张吉翔. PAQR3及与其相关疾病关系研究进展[J]. 中国老年学杂志, 2016, 36 (11): 2784-2786.
[3]孙嘉玲,韩克起,方慧琪,等. 中药治疗结肠癌药理机制研究进展 [J]. 环球中医药, 2024, 17 (02): 352-358.
[4]Li X, Li M, Chen D, Shi G, Zhao H. PAQR3 inhibits proliferation via suppressing PI3K/AKT signaling pathway in non-small cell lung cancer. Arch Med Sci. 2018;14(6):1289-1297. doi:10.5114/aoms.2017.72220
[5]Guo W, You X, Wang X, Wang L, Chen Y. A synthetic peptide hijacks the catalytic subunit of class I PI3K to suppress the growth of cancer cells. Cancer Lett. 2017;405:1-9. doi:10.1016/j.canlet.2017.07.015
[6]代晓强,张海亮,李红梅. 孕酮及脂联素受体家族成员3在乳腺癌中的表达和临床意义 [J]. 海南医学院学报, 2016, 22 (14): 1604-1606+1610. DOI:10.13210/j.cnki.jhmu.20160513.021.
[7]白鸽. PAQR3与食管鳞癌临床病理特征、生存预后的相关性及其功能研究[D]. 新疆医科大学, 2018.

4.1 理论创新
突破单靶点局限，本研究首次揭示PAQR3可能协同调控PI3K-AKT、MAPK及Wnt三大核心通路，进而抑制结直肠癌进展。创新性构建了“单分子靶点-多通路网络”协同干预理论，为应对肿瘤耐药性和靶向治疗局限性提供全新思路。同时，本研究设计通过后续Co-IP实验，计划验证PAQR3对MAPK通路中RAF/MEK、RAF/RAS复合物以及PI3K通路中PI3K亚基P110α/P85α结合的调控作用，并结合β-catenin核质转位研究，系统探究其多通路交叉调控枢纽功能，力求从机制层面实现深度突破。
4.2 临床导向特色：
本研究设计了从体外机制探索到动物模型再到人源组织验证的多层次研究体系。拟通过细胞实验揭示PAQR3及P6-55的作用机制，进一步在裸鼠移植瘤及APC^min/+小鼠自发性肠癌模型中验证体内效应，最终结合人源结肠癌组织进行临床相关性分析，形成完整的研究链条，为后续创新抗肿瘤药物开发奠定临床转化基础。
5.1 技术路线
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5.2 拟解决问题
本研究拟阐明PAQR3在结直肠癌进展中的多通路调控机制，重点探索其在协调PI3K-AKT、MAPK和Wnt信号通路中的作用，及其通过干预RAF/MEK复合物形成、调节PI3K亚基相互作用和影响β-catenin核转位的潜在机制。
拟进一步验证PAQR3功能肽P6-55通过激活PAQR3实现多通路同时抑制的可能性，评估其在移植瘤模型和自发性肠癌模型中的抗肿瘤效果和安全性，为PAQR3靶向药物的开发提供理论依据和实验支持。
5.3 预期成果
本研究旨在揭示PAQR3通过调控PI3K-AKT、MAPK和Wnt通路在结直肠癌中的抑癌机制，进一步探索其功能肽P6-55的多通路协同抑制作用。通过动物模型验证P6-55的抗肿瘤效果和安全性，为PAQR3靶向药物开发及多靶点治疗策略提供理论和实验基础。
在国内外发表研究论文一篇。
第一年 HCT116/HCT15 细胞实验
第一年 P6-55 体外机制研究（Co-IP, 核质分离）
第二年 裸鼠皮下瘤实验
第二年 APCmin/+ 自发性肠癌模型
7.1与本项目有关的研究积累
7.1.1项目负责人和成员均接受过高水平科研训练和学科竞赛锻炼，具备扎实的科研素养、创新能力和独立思考能力。团队整体专业知识过硬，实验操作熟练，掌握分子生物学及相关实验技术，能够胜任本项目的文献调研、实验设计及各项科研工作，保障项目高质量推进。同时，本项目指导老师在《Oncology Letters》《Heliyon》《Advanced Science》《eLife》等国际权威期刊以第一作者或通讯作者发表多篇高水平论文，具备深厚的科研积累和丰富的指导经验，为本项目的顺利实施提供坚实支持。
7.1.2已有研究基础：
为了研究PAQR3敲低对结肠癌细胞功能的影响，我们成功建立了稳定的PAQR3敲低模型，通过qRT-PCR监测敲低效率（图1A）。CCK8实验表明，下调PAQR3表达可显著增强HCT15细胞的活力（图1B）。此外，集落形成实验证实了这些结果，表明在PAQR3敲低后，HCT15细胞系中形成的集落数量有所增加（图1C）。此外，Transwell迁移实验显示，PAQR3的敲低也提高了HCT15细胞的迁移能力（图1D）。
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图1:PAQR3敲低刺激结肠癌细胞的增殖和迁移
(A-B)用慢病毒感染HCT15细胞实现PAQR3敲低（PAQR3- kd），并建立对照组进行比较。(C)采用CCK8法评估PAQR3-kd和对照HCT15细胞在指定时间内生长活力的变化。（D）Transwell室迁移
实验比较PAQR3敲低的HCT15细胞和对照组HCT15细胞的迁移能力。晶体紫染色细胞的代表性图像显示，迁移细胞数量的统计数据显示在右侧。

为了进一步研究PAQR3的功能特性，我们通过构建HCT15细胞中PAQR3过表达模型来探索其潜在的肿瘤抑制作用。具体而言，我们选择了使用qRT-PCR评估PAQR3在HCT15细胞的过表达效率（图2A）。CCK8实验随后证实了PAQR3过表达对HCT15细胞活力的显著抑制作用（图2B）。此外，我们的实验结果表明，PAQR3过表达显著降低了HCT15的集落形成能力（图2C），突出了其在抑制肿瘤生长中的重要作用。此外，我们观察到PAQR3的过表达有效地抑制了HCT15细胞的迁移能力，进一步支持其在抑制癌症进展中的潜在作用（图2D）。summernote-img
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图2:PAQR3过表达抑制结肠癌细胞的增殖和迁移
(A-B)通过慢病毒感染在HCT15细胞中实现了PAQR3过表达（PAQR3-ov），并建立了相应的对照组。采用qRT-PCR评价PAQR3过表达效率。(C)PAQR3在HCT15细胞中稳定过表达后，采用CCK8法评估和分析细胞活力。（D）通过Transwell法测定PAQR3在HCT15 细胞中稳定过表达后，从上腔向下腔迁移的细胞数量。所示为代表性图像，以及右侧显示的迁移细胞数量的统计数据。

鉴于P6-55可以替代PAQR3发挥特定功能，有效抑制胃癌细胞的生长，我们旨在研究P6-55是否同样可以抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。实验结果表明，在4 μg/mL浓度下，P6-55对HCT15的增殖有抑制作用。值得注意的是，当浓度增加到20 μg/mL时，抑制作用更加明显（图3A）。此外，在浓度为20 μg/mL时，细胞的集落形成能力明显降低（图3B）。重要的是，P6-55还表现出对细胞迁移的抑制作用（图3C），加强了其在对抗结肠癌进展中的潜在作用。
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图3:P6-55抑制结肠癌细胞的增殖和迁移
(A-B)HCT15细胞用对照肽或P6-55处理指定的时间，并使用CCK8法评估细胞活力，用对照肽或P6-55处理HCT15 细胞10天后，通过结晶紫染色评估集落形成。(C)使用对照肽或P6-55处理后，使用Transwell实验检测细胞的迁移能力。图中显示了迁移细胞的代表性图像，并在右侧显示了迁移细胞数量的统计数据。

为了探索PAQR3在结肠癌中的抑瘤机制，我们对PAQR3敲低HCT15稳定细胞系与相应对照细胞系进行了RNA-sequencing比较。测序结果显示，PAQR3敲低后，火山图显示1119个基因上调，1289个基因下调（图4A）。此外，热图直观地表示了三个对照组和实验组差异基因的表达分布，红色区域表示高表达水平，蓝色区域表示低表达水平（图4B）。随后，我们利用KEGG分类图谱对差异基因进行功能标注，发现PAQR3敲低后，PI3K-AKT、MAPK和Wnt等关键信号通路上的差异基因显著富集。此外，81个基因与肿瘤相关途径密切相关，38个基因与产热途径相关（图4C）。KEGG气泡图进一步表明，PAQR3敲低后，差异基因主要集中在蛋白质加工、胆固醇生物合成和氨基酸代谢等过程中（图4D）。最后，GSEA分析表明，PAQR3敲低后，生长和肿瘤相关通路呈现上调趋势，为理解PAQR3在结肠癌中的抑瘤作用提供了新的见解和基础（图4E）。
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图4:RNA-seq和差异基因富集分析
(A)火山图显示了与对照组相比，PAQR3稳定敲低的HCT15细胞中RNA测序后的差异基因表达。(B)为PAQR3敲低组与对照组差异基因表达谱的热图比较。(C) KEGG分类图，总结了受PAQR3敲低影响的差异基因相关通路。(D) KEGG气泡图突出PAQR3敲低影响的差异基因的富集。(E) GSEA分析图显示PAQR3敲低影响的生物学功能。

鉴于KEGG分类图显示PAQR3敲低后PI3K-AKT信号通路显著富集，我们进一步探讨PAQR3敲低是否调控该通路，从而影响肿瘤生长。为此，我们选择了11个与PI3K-AKT信号通路密切相关的基因进行详细分析（图5A）。通过qRT-PCR比较正常和PAQR3敲低HCT15稳定细胞系，我们发现PI3K-AKT通路核心组分AKT1以及致癌基因IKBKB和STAT3的表达均显著升高。相反，肿瘤抑制因子PIK3R1和转录调节因子TSC22D3的表达被抑制。值得注意的是，TSC22D3不仅调节细胞生长、分化和免疫反应，还可能部分抑制抗肿瘤免疫反应。PIK3R1作为PI3K-AKT通路的关键组分，对细胞生长、分裂等重要功能至关重要，在PAQR3下调后，其表达也呈下降趋势。此外，我们观察到PAQR3敲低后，细胞粘附相关基因FN1和LAMB1的表达上调，这与PAQR3作为肿瘤抑制基因的生物学功能一致。在细胞存活和DNA损伤反应中起关键作用的抗凋亡蛋白BCL2L1和促凋亡蛋白CASP4出现了预期的变化，BCL2L1的升高和CASP4的降低与PAQR3敲低相关。细胞周期相关基因CCNE2的表达也如预期的那样增加。此外，ERBB3是一种酪氨酸激酶受体，在各种肿瘤中经常过表达，并参与细胞增殖和迁移，在PAQR3敲低后，ERBB3的表达增加。重要的是，我们的定量结果与测序数据高度一致，进一步验证了研究结果（图5B）。为了证实这些结果，我们随后分别在HCT15过表达和敲低稳定细胞系中检测了PI3K-AKT信号通路的抑制（图5C）和激活（图5D）。发现PI3K-AKT信号通路在结肠癌细胞生长调控中的作用，为了解PAQR3在结肠癌中的功能机制提供了重要的见解。
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图5:PAQR3在结肠癌中调控PI3K-AKT信号通路
(B)比较RNA测序和qRT-PCR分析结果的相关散点图，（C-D） Western blot （WB）分析显示HCT15细胞中PAQR3过表达(C)和敲低(D)后蛋白表达水平的变化，如图所示。
7.2.1已具备条件：
本项目已具备良好的研究基础和实施条件。团队成员具备扎实的专业知识、系统的科研训练和丰富的实验操作经验，能够熟练掌握分子生物学、细胞生物学及动物实验相关技术。实验室配备完善，拥有细胞培养平台、分子生物学实验设备和动物实验条件，能够满足本课题所需实验工作的顺利开展。同时，团队具备较强的文献检索、资料整理和课题撰写能力，能够为项目推进提供坚实保障。此外，学校高度重视科研工作，为学生创新能力培养和高水平科研项目开展提供了良好的学术氛围和政策支持，为本项目顺利实施创造了优越条件。
7.2.2尚缺少条件：
本研究尚缺少的条件主要是动物实验所需的动物房笼位资源。但这一问题可以通过实验进度合理调整实验批次，确保动物实验顺利开展。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 购买材料、测序及论文出版 17000.00 3000.00
1. 业务费 9000.00 测序及文章润色 6000.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 6000.00 RNA-seq 6000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 润色 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 11000.00 耗材、试剂及小鼠购买 11000.00 0.00
结束

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