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基于网络药理学和实验验证研究侧柏叶水提物对衰老心脏的影响

申报人：郭家慧 申报日期：2025-03-20

基本情况

2025创新项目
基于网络药理学和实验验证研究侧柏叶水提物对衰老心脏的影响 学生申报
创新训练项目
医学
药学类
学生自主选题
二年期
《中国心血管健康与疾病报告2022概要》揭示了我国人口老龄化的加速趋势，在这一背景下，心血管疾病对公众健康的威胁日益凸显，其发病率居高不下，甚至呈现出增长态势。目前，心血管病（CVD）已跃升为最主要的致死原因之一，而心脏衰老更是推动心血管疾病发作的关键因素。心血管病的危害日益加剧，已上升为公共卫生领域亟待解决的重要问题。衰老的发生与细胞凋亡、氧化应激、慢性炎症等多种因素有关。因中药具有多层次、多靶点的特点，尤其兼有抗凋亡、抗氧化、抗炎、抗肿瘤的中药可能具有对抗衰老的作用。研究表明侧柏叶具有抗凋亡、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管系统等作用，因此我们推测侧柏叶可能具有对抗心脏衰老的作用。 在本研究中，先通过网络药理学及分子对接技术筛选侧柏叶作用于衰老的活性成分及核心靶点，结合核心靶点，选择信号通路，再通过实验验证侧柏叶是否具有对抗心脏衰老的作用，然后再对选出的信号通路进行验证。以期为心脏衰老的防治提供更多的可能，亦为侧柏叶防治心脏衰老的作用及其机制提供更多的参考。
学习并参与校级大学生创新创业项目侧柏叶水提物改善血管钙化及其相关机制的研究（cx2024318py）和侧柏叶水提物降压作用的研究（cx2024323py）；
掌握网络药理学相关数据库、软件和平台的运用，例如：TCMSP、Target Prediction等数据库、Cytoscape 3.10.1和Pymol、AutoDockTools软件、SwissADME和STRING平台；
掌握分子对接技术；
掌握实验动物的常规操作，如喂养、灌胃、取材等；
掌握实验室常规仪器的运用的运用，如全自动酶标仪、超灵敏多功能成像系统、石蜡切片机；
掌握常见组织的常规染色方法如HE 、天狼猩红、马桑染色；
掌握qRT-PCR和western blot检测技术。
指导大学生创新创业7项其中3项已经结题，主持山东省中医药项目一项（在研），主持济宁医学院青年教师科研扶持基金一般项目1项，主持济宁医学院青年教师科研扶持基金重点项目1项，主持济宁市科技局项目1项，目前都已结题。参与山东省自然科学基金项目2项，参与贺林院士基金项目1项。
指导教师负责指导及监管整个项目的立项、实施；为整个项目的开展提供技术以及相关的资金支持；帮助学生解决在整个项目实施过程中遇到的各种问题；指导学生书写研究论文。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
郭家慧 药学院 药物制剂（本科） 2023 免疫荧光检测、 qRT-PCR和western blot检测
李若涵 药学院 药物制剂（本科） 2024 MDA检测盒、肌酸激酶试剂盒和乳酸脱氢酶试剂盒检测、心肌冰冻切片二氢乙锭荧光探针染色
李沛霖 药学院 药物制剂（本科） 2024 通过网络药理学确定侧柏叶缓解心脏衰老的分子机制
郑舒心 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2025 免疫荧光检测、 qRT-PCR和western blot检测
殷正函 药学院 药物制剂（本科） 2024 HE 、天狼猩红、马桑和β半乳糖染色染色
唐一匀 药学院 药物制剂（本科） 2024 Y迷宫实验、分子对接

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
李丽 药学院 否

立项依据

1.通过网络药理学确定侧柏叶水提物缓解心脏衰老的核心成分，核心靶点和信号通路。
2.通过分子对接技术预测侧柏叶水提物核心成分与靶点的结合能力，从而对网络药理学的结果进行初步验证。
3.通过动物实验确定侧柏叶水提物是否具有缓解心脏衰老的作用。
4.通过MDA和活性氧检测判断侧柏叶水提物是否通过缓解氧化应激来对抗心脏衰老。
5.通过免疫荧光染色检测、qRT-PCR检测和western blot检测，判断侧柏叶水提物是否通过增强PI3K/AKT/BCL-2通路的活性，而发挥对抗衰老的作用，从而通过动物实验对网络药理学的结果进行再次验证。
       第一部分：通过网络药理学确定侧柏叶水提物缓解心脏衰老的核心成分，核心靶点和信号通路。
       1.侧柏叶相关成分的获取与筛选
       在 TCMSP 中搜索“侧柏叶”和“CE BAI YE ”，可以得到侧柏叶的相关成分，再以口服利用度(oral bioavailability, OB)≥30%，类药性(drug likeness, DL)≥0.18为条件，对侧柏叶成分进行筛选并保存侧柏叶的活性成分。
       2.侧柏叶相关靶点的获取
       为了寻找侧柏叶活性成分的潜在作用靶点，我们首先利用Swiss Target Prediction这一数据库进行查询。继而通过SwissADME平台来进一步筛选这些化合物，筛选的标准是胃肠道吸收（GI absorption）得分需为“high”，并且类药性（druglike-ness）至少要满足两个“Yes”的条件[1]。一旦完成筛选，我们将筛选出的化合物的SMILES结构信息输入到SwissTargetPrediction数据库中，以预测这些化学成分各自的作用靶点。Swiss Target Prediction数据库设置可信度（probability）大于0，获得侧柏叶的靶点基因数据库。
       3.衰老相关靶点的获取与筛选
以“ senescence”为查询词 ，在Gene Cards和OMIM 数据库中进行查找,最后将搜索完成的2个数据库中的靶点信息进行汇总去重后，得到衰老疾病所对应的靶点。
       4.“药物-成分-靶点-疾病”网络的构建分析
       利用Venny 2.1.0数据库，导入了侧柏叶活性成分的靶点和衰老疾病相关的靶点基因，从而识别出侧柏叶在抗衰老过程中的潜在作用靶点。接着使用Cytoscape3.10.1软件，结合这些活性成分和筛选出的交集靶点，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。这一分析过程旨在明确侧柏叶中哪些核心成分对衰老疾病具有显著影响。在网络图中，节点的度（degree）反映与特定节点直接相连的节点数量，进而体现该节点所代表的活性成分的重要性。因此，我们通过分析网络中各成分的度值，识别出侧柏叶在抗衰老中的主要活性成分。
       5. PPI网络的构建
       将侧柏叶与衰老的交集靶点导入STRING平台，并下载文件，将文件导入Cytoscape 3.10.1，制作侧柏叶靶点-衰老靶点的蛋白互作用PPI网络图，节点大小以及颜色深浅与DEGREE值成正比，值越大颜色越深说明其作用越大。
       6.侧柏叶缓解衰老相关靶点的GO和KEGG富集分析
  将筛选出的交集靶点导入DAVID数据库，并导出相应文件，进行KEGG和GO通路富集分析。依据P值由小到大排序，在KEGG分析中，我们选择前20位的通路进行深入研究，GO分析时共选取了30项（BP条目、CC条目和MF条目每个种类前10项）进行分析。我们依据微生信软件要求对数据进行处理，并可视化。综合评估侧柏叶在抗衰老心脏方面的分子机制。
       第二部分：通过分子对接技术预测侧柏叶缓解衰老的关键成分和核心靶点之间的亲和力，进而对网络药理学的内容进行初步验证。
       为了分析侧柏叶中核心成分的分子结构及其与核心靶点的结合活性，于Pubchem数据库中，下载核心成分3D分子结构图。随后，我们将文件格式转换为PDB格式，并在Uniprot和PDB数据库中，我们查找核心靶点的结构图，并下载相应的PDB格式文件。然后，使用Pymol软件导入下载的PDB文件，并通过处理去除水分子及其他可能存在的杂质，以获得更准确的分子模型，在准备好分子模型后，我们利用AutoDockTools软件将核心成分的PDB文件和靶点的PDB文件转换为AutoDock系列软件所使用的特定格式PDBqt格式。将两个PDBqt文件导入相应的分子对接软件中，进行分子对接模拟，预测分子间的结合方式和结合能。
       第三部分：通过动物实验验证侧柏叶水提物是否具有缓解心脏衰老的作用。
       1.实验分组
       将30只健康成年昆明种小鼠随机分为正常对照组、衰老组和侧柏叶组，正常组，皮下注射相应体积生理盐水，模型组及侧柏水提物给药组皮下注射D-半乳糖（300mg/kg），给药组灌胃侧柏叶水提物（1g/kg)，连续6周。
       2.观察指标
       2.1通过Y迷宫实验验证侧柏叶水提物是否可以缓解衰老
       因衰老常常伴有认知能力的障碍，而Y迷宫实验是考察小鼠探索行为及短期记忆能力等认知能力的常用实验手段。在本研究中，为观察侧柏叶能否改善衰老小鼠的认知能力，我们设置了Y迷宫实验，以期通过空间识别实验和自发交替反应实验观察侧柏叶水提物能够改善衰老小鼠的认知能力。
       Y迷宫由三个完全相同的臂组成，实验开始时，随即指定3个相同臂为起始臂、新颖臂、其他臂，起始臂与其他臂始终打开，小鼠自由探索5min，间隔2h，打开新颖臂，记录动物进入各臂的次数、时间，将小鼠放在起始臂末端，记录10min内小鼠进入各臂的顺序，计算小鼠自主交替率。通过对比新臂探索时间、探索次数及自主交替率观察侧柏叶能否改善衰老小鼠的学习认知能力。
       2.2侧柏叶水提物是否可以缓解心脏衰老
       2.2.1 通过试剂盒观察侧柏叶水提物对衰老心脏心功能的影响
       血清心肌酶如乳酸脱氢酶和肌酸激酶是评价心功能以及心脏损伤程度的重要指标，为观察侧柏叶水提物对衰老心脏的影响，我们检测血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶水平，以期观察侧柏叶水提物能否改善衰老心脏的心功能。
       小鼠处死前，摘除眼球取血，静置30 min后离心，取上清。按照操作说明书要求，测定血清乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）含量。
       2.2.2 通过心组织β-半乳糖苷酶染色、HE、马桑、天狼猩红染色观察侧柏叶水提物对衰老心脏病理染色的影响
       β-半乳糖苷酶染色是检测衰老组织的特异性染色，而心脏衰老时也会伴随着心肌细胞的形态学变化，为全面评估桑黄水提物对衰老心脏的影响，我们将对心肌进行β-半乳糖苷酶染色、HE染色、马桑染色以及天狼猩红染色。
       小鼠心脏组织经固定、脱水、包埋以及切片预处理后，按照试剂盒的要求对心肌组织进行β-半乳糖苷酶染色、HE染色、Masson染色以及天狼猩红染色，为了更精确地评估心肌细胞形态的变化和心肌间质纤维化的程度，我们采用显微镜图像分析仪以及ImageJ图像分析系统，帮助我们量化分析心肌间质纤维化的程度。
       第四部分：通过动物实验观察侧柏叶水提物是否通过抑制氧化应激缓解心脏衰老。
       1.实验分组
       同上
       2.观察指标
       氧化应激是引起衰老的关键因素，为观察侧柏叶水提物对衰老心脏氧化应激的影响，我们进行心肌冰冻切片二氢乙锭荧光探针染色检测ROS水平，并对心肌组织进行MDA水平检测，以期观察侧柏叶水提物能否通过抑制氧化应激缓解心脏衰老。
       2.1 通过二氢乙锭荧光探针检测心肌ROS水平
       包埋新鲜心肌组织，进行冰冻切片，根据说明书配制DHE工作液，覆盖DHE工作液，37℃恒温避光孵育，PBS进行洗涤，用抗荧光淬灭剂进行封片观察。.
       2.2通过试剂盒检测心肌MDA水平
       选取各组小鼠心脏组织放入组织研磨仪中研磨为匀浆后，根据丙二醛（MDA）试剂盒的操作说明书测定得心肌中MDA含量。
       第五部分; 通过western blot、qRT-PCR以及免疫荧光染色等实验手段观察侧柏叶水提物是否通过增强PI3K/AKT/BCL-2通路的活性，而发挥对抗衰老的作用。
       1.实验分组
       同上
       2.观察指标
       我们前期网络药理学的研究表明，癌症相关通路和PI3K/AKT通路是侧柏叶作用于衰老的主要信号通路，结合核心靶点，PI3K/AKT/BCL-2通路中所占核心靶点的数目较多，因此我们最终选定PI3K/AKT/BCL-2通路进行验证。
       2.1 通过western blot 检测心肌p-PI3K、p-AKT1、BCL-2蛋白表达水平
       正常对照组、衰老组、侧柏叶组各取20 mg组织，按照比例加入裂解液，进行匀浆，离心，提取蛋白样品，用BAC法测定蛋白浓度，剩余的蛋白，按样品：5×SDS蛋白上样缓冲液=4：1加入蛋白上样缓冲液(loading buffer)，放在金属浴加热器加热，加热后取出分装，配制上下层胶，凝胶上样，电泳转膜，室温封闭液封闭1.5h，用脱脂奶粉、TBS-T配一抗（1：1000），4℃孵育过夜，摇床摇晃，TBS-T洗膜三次，每次十分钟，用TBS-T稀释二抗，孵育2h，TBS－T缓冲液洗涤PVDF膜3次，配制显影液，显影曝光。
       2.2 通过qRT-PCR检测心肌PI3K、AKT1、BCL-1mRNA水平
       采用Trizol法提取小鼠心脏总RNA，使用Hiscript Ⅲ 1st strand CDNA synthesis试剂盒合成cDNA。以β-actin为内参，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行PCR扩增。
       2.3 通过免疫荧光染色检测心肌P-AKT1表达情况
       将心肌石蜡切片脱蜡至水后，放在EDTA抗原修复缓冲液（pH 8.0）中并于微波炉内进行抗原修复，用组化笔在切片周围画圈并在圈内滴加3%BSA孵育30 min，加一抗4 ℃孵育过夜，加二抗室温避光孵育50 min，DAPI复染细胞核，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下拍照，Image J分析数据。
    《中国心血管健康与疾病报告2022概要》揭示了我国人口老龄化的加速趋势，在这一背景下，心血管疾病对公众健康的威胁日益凸显，其发病率居高不下，甚至呈现出增长态势。目前，心血管病（CVD）已跃升为最主要的致死原因之一，而心脏衰老更是推动心血管疾病发作的关键因素。心血管病的危害日益加剧，已上升为公共卫生领域亟待解决的重要问题。因此，深入探究如何延缓心脏衰老具有重要意义。
      心脏衰老(cardiac agign)系指由年龄增长与不良刺激累积从而不同程度损伤其结构和功能，进而对线粒体功能产生影响，使得DNA损伤，导致出现衰老分泌表型，出现心肌细胞肥厚、收缩功能障碍等问题[2]。
       现代医学现发现心肌细胞衰老机制包括细胞自噬对心肌细胞的影响、细胞氧化对心肌细胞的影响、局部微环境改变对心肌细胞衰老的影响、线粒体质量控制系统对心肌细胞衰老的影响、表观遗传学因素对心肌衰老的影响[3]，近年来多项研究表明多种西药、中药提取物、合理饮食以及适当的运动可通过提高抗氧化能力、减少氧化应激反应、改善线粒体功能、提高自噬等机制延缓心肌细胞衰老，其中衰老过程中心脏发生结构和功能改变的主要病理生理机制是氧化应激，氧化应激的增加是心脏衰老的一个主要因素[4]，因此，研究氧化应激在心 肌细胞衰老中的作用、机制及其相关通路，在寻找延缓衰老所带来的疾病药物上有重要意义。
       查阅文献后发现，磷脂酰肌醇3-激酶与蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路，作为细胞内信号转导的关键途径之一，对细胞凋亡、免疫重塑以及炎症反应等多种生物学过程起着至关重要的调控作用[5]。PI3K/Akt信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，广泛存在于人体心肌细胞中。PI3K是真核生物内一类催化肌醇与磷酯酰肌醇的重要激酶[6]，Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是PI3K的关键下游蛋白，Akt1在多种组织中表达，与心血管功能调节关系密切[7]。刘芬等[8]研究发现黄芪注射液可以降低氧化应激水平，探究其通路发现是通过激活PI3K/Akt通路发挥作用；张永花等[9]研究发现当归补血汤含药血清可以调节PI3K/Akt信号通路活性干预血管紧张素Ⅱ诱导的肥大心肌细胞，进而保护心肌细胞；另有研究发现，姜黄素可能通过激活PI3K/Akt信号通路从而对脂多糖诱导的H9C2心肌细胞炎症损伤有保护作用[10]。PI3K/Akt可作为预防和治疗心血管疾病的靶点[11]。
       侧柏叶是一种多功能的草本植物，其功效广泛，涵盖了清热凉血、祛风除湿、止血化瘀、止咳祛痰以及促进头发生长并使其乌黑亮泽等多个方面。在化学成分方面，侧柏叶富含黄酮类、挥发油以及多糖类等物质。多数文献主要聚焦于黄酮类化合物和挥发油这两种主要成分，但侧柏叶中的多糖和鞣质成分却鲜少被提及。然而，随着对侧柏叶中各种有效成分的深入研究和提取，其多样的药理活性也逐步被揭示。这些药理活性包括抗炎、抑菌、抗氧化、止血、抗肿瘤、降血脂，以及促进毛发再生和增强毛囊代谢功能等，为侧柏叶在医药领域的应用提供了广阔的前景[12]。综上，侧柏叶可以作用于PI3K/AKt通路从而对衰老心脏发挥抗氧化、抗炎、保护心血管系统等作用。
1.首次提出了侧柏叶水提物对衰老心脏有改善作用；
2.首次提出了侧柏叶水提物是通过增强PI3K/AKT/BCL-2通路活性缓解衰老心脏的氧化应激，进而缓解心脏衰老。
3.为心脏衰老的防治提供更多的可能，亦为侧柏叶防治心脏衰老的作用及其机制提供更多的参考。

技术路线：

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拟解决的问题：
1. 通过网络药理学确定侧柏叶水提物缓解心脏衰老的核心成分，核心靶点和网络通路。
2.通过分子对接技术预测侧柏叶水提物核心成分与靶点的结合能力。
3.通过动物实验确定侧柏叶水提物是否具有缓解心脏衰老的作用。
4.通过MDA和活性氧检测判断侧柏叶水提物是否通过缓解氧化应激来对抗心脏衰老。
5.通过免疫荧光染色检测、qRT-PCR检测和western blot检测，判断侧柏叶水提物是否通过增强PI3K/AKT/BCL-2通路的活性，而发挥对抗衰老的作用。
预期成果：
在SCI收录的期刊或者北大Ⅰ类核心期刊发表论文1篇，形成研究报告，在省级及其以上的大学生创新创业大赛中取得奖项。
第一阶段：准备阶段 （2025年3月）
1）组建团队，确定研究项目，撰写报告。
2）制定实验方案，完成前期资料整理汇总。
3）采购实验所需材料
第二阶段：实验阶段（2025年4月-2026年4月）
1）网络药理（2025年4月-2025年7月）
2）分子对接（2025年8月-2025年11月）
3）实验验证（2025年12月-2026年4月）
第三阶段：整理数据、发表论文（2026年5月-2027年4月）
1）整理实验数据，对实验数据进行统计分析，得出实验结果。
2）书写论文并投稿。

   1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
      近期，我们就侧柏叶水提物改善心脏衰老及其相关机制进行了研究，结果如下：
  1)侧柏叶缓解衰老的活性成分及靶点的获取
      在TCMSP数据库中显示侧柏叶相关化学成分共有86个，其中OB值≥30%，DL≥0.18的有7个，将这七种化合物从C1 到C7命名，见表1。通过Swiss Target Prediction数据库获取侧柏叶靶点498个，去除重复值之后得到靶点316个。
                             表1 侧柏叶活性成分
 
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2)衰老疾病相关靶点的获取
      在GeneCards数据库中获得衰老相关靶点1427个，OMIM数据库中查取衰老相关靶点574个，将在两个数据库中所的数据汇总去重，衰老相关靶点共得到1873个。
3)制作并分析“药物-成分-靶点-疾病”网络图
      将在 Venny 2.1.0上所得到128个侧柏叶与衰老的交集靶点（见图1）与其对应7个侧柏叶化合物，导入软件Cytoscape 3. 10.1 构建“药物-成分-靶点-疾病”的可视化网络（见图2）。其中扁柏内酯（Hinokinin）、山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、异海松酸（Isopimaric acid）成分排名最靠前，经分析推测这种四种成分可能是侧柏叶作用于衰老的关键成分。 
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                                                                      图1 侧柏叶活性成分基因与衰老疾病基因交集靶点
                           summernote-img
                                                                                         图2 成分靶点可视化图
4)PPI 网络的构建
      经过STRING平台和Cytoscape 3.10.1软件的共同处理，我们得到了PPI网络图（图3)。这个PPI网络图包含了2038条边，127个节点。此外，图中的节点大小与颜色深浅与其度值大小密切相关。结果显示度值TP53、AKT1、BCL2、CASP3，EGFR排名最靠前，推断这些靶点是侧柏叶抗衰老的核心靶点。
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                                                                            图3侧柏叶和衰老蛋白相互作用网络
5)GO和KEGG富集分析
       在DAVID 数据库中得到GO条目801个，KEGG分析得到细胞信号通路154条。GO分析对所选取的30项条目（BP条目、CC条目和MF条目各种类前10项）进行可视化作图，见图4。KEGG分析选取前20条关键通路作为侧柏叶治疗衰老的主要潜在机制，并进行了直观的可视化展示，见图5，结果表明，富集靶点较多的通路为Pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway等信号通路, 依此推测侧柏叶可能主要通过上述信号通路发挥抗衰老的作用。
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                                                                          图4 核心靶点GO分析
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                                                                                         图5 核心靶点KEGG富集分析
6)分子对接验证
      当结合能小于-5.0 kcal·mol-1时，表示侧柏叶潜在活性分子与核心靶点结合比较好；当结合能小于-7.0kcal·mol-1时，表明侧柏叶潜在活性分子与核心靶点之间的结合极为强烈。结果显示，如表2，经过16次分子对接的结果，所有的对接结果都不高于-5.0 kcal·mol-1，这表明了侧柏叶的潜在活性分子与核心靶点之间存在着良好的结合性能。其中，有13对（81.25%）的结合能低于-7.0 kcal·mol-1，这进一步证实了本研究中所预测的核心靶点与潜在成分均展现出优异的结合特性。
                                               表2活性成分与核心靶点对接结果
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                  AKT1和扁柏内酯                   AKT1和槲皮素                            AKT1和山奈酚
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                                     EGFR和槲皮素                                           AKT1和异海松酸 
                                                            图6 核心成分与核心靶点分子对接模式图
7)侧柏叶水提物对衰老小鼠认知能力的影响
      因衰老伴随着学习认知能力的减退，为了观察侧柏叶能否改善衰老小鼠的学习认知能力，我们进行了Y迷宫实验。新臂探索实验显示，与正常对照组相比，衰老组小鼠新臂探索时间、探索次数均有明显下降（P<0.01），与衰老组相比，侧柏叶组新臂探索时间、探索次数均有所增加(P<0.05)，如图6，图7所示。自主交替实验显示，与正常对照组相比，衰老组自主交替正确率明显降低（P<0.01），与衰老组相比，侧柏叶组自主交替正确率升高，（P<0.05），如图8所示。以上结果提示，侧柏叶能缓解衰老小鼠的学习认知能力障碍，尤其改善对新事物的探索能力和空间记忆能力，初步提示侧柏叶具有缓解衰老的作用。
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                                                              图7 进入新臂时间次数百分比
                                      ** P＜0.01 vs与正常对照组相比, # P＜0.05 与衰老组相比
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                                                                       图8 自发交替率
                                        ** P＜0.01 与正常对照组相比, # P＜0.05 与衰老组相比
8)对衰老心脏病理染色的影响
       心脏衰老可能伴随着心脏形态学的改变。为了观察侧柏叶对衰老心脏衰老程度的影响，我们用心肌冰冻切片进行了衰老相关的β-半乳糖苷酶染色。结果显示，与正常对照组相比，衰老组β-半乳糖苷酶染色所示的衰老程度明显加重( P＜0.01 )，与衰老组相比，侧柏叶组心脏的衰老程度明显减轻(P＜0.01 )。为了观察侧柏叶对衰老心脏心肌损伤程度的影响，我们对心肌石蜡切片进行了HE、马桑和天狼猩红染色。HE染色显示，与正常对照组相比，衰老组心肌有较多炎细胞浸润，与衰老组相比，侧柏叶组炎细胞浸润的程度明显减轻。马桑和天狼猩红染色显示，与正常对照组相比，衰老组心肌胶原纤维明显增多（P＜0.01），与衰老组相比，侧柏叶组心肌的胶原纤维明显减少（P＜0.01），如图13所示。以上结果提示，侧柏叶能缓解衰老小鼠心脏的衰老，缓解衰老小鼠心脏的损伤。
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图9心肌切片HE 、天狼猩红、马桑、β半乳糖染色A：HE 、天狼猩红、马桑、β半乳糖染色图片B：马桑、天狼猩红染色胶原纤维化程度以及β半乳糖染色衰老程度分析
                                                                 ** P＜0.01 与正常对照组相比, ## P＜0.01与衰老组相比
9)侧柏叶水提物对衰老心脏LDH和CK活性的影响
       严格按照试剂盒步骤测定肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶(LDH)活性测定结果如图10、图11所示，与正常组相比，模型组肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶(LDH)活性均明显降低（P<0.01），与模型组相比，侧柏叶水提物给药组肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶(LDH)活性，P<0.01，有明显差异。
                                                         summernote-img

                                                                图10血清中CK活力值（U/ml）检测
                                               ** P＜0.01与正常对照组相比, ## P＜0.01 与衰老组相比 
                                                             summernote-img

                                                                               图11血清中LDH（U/L）活性
                                                         ** P＜0.01与正常对照组相比, ## P＜0.01 与衰老组相比
 10)侧柏叶水提物对衰老心脏氧化应激的影响
       据文献报道，氧化应激在衰老的发生中发挥着关键作用，为了观察侧柏叶能否通过减轻氧化应激缓解心脏衰老，我们经二氢乙锭荧光探针检测心肌冰冻切片ROS水平，红色荧光越强代表心肌ROS含量越高。经过统计分析，与正常组相比，衰老组ROS含量明显升高（P<0.01）；与衰老组相比，侧柏叶组ROS含量明显降低（P<0.01）如图12所示 。MDA试剂盒检测结果显示，与正常对照组相比，衰老组MDA含量明显升高（P<0.01）；与衰老组相比，侧柏叶组MDA含量明显降低（P<0.01），如图13所示。以上结果表明，侧柏叶能明显缓解衰老小鼠心脏的氧化应激，提示侧柏叶可能通过缓解氧化应激来对抗心脏衰老。 
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  summernote-img                                                     
                                                         
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                                       图12心肌冰冻切片二氢乙锭染色检测ROS含量A：二氢乙锭染色图片
                                                                    B：各组ROS水平分析
                                                ** P＜0.01与正常对照组相比, ## P＜0.01 与衰老组相比
                                                summernote-img
                                                                  图13心肌MDA含量水平检测
                                                      ** P＜0.01与正常对照组相比, ## P＜0.01 与衰老组相比
11） PI3K/AKT/BCL-2通路验证
       网络药理学研究表明，癌症相关通路和PI3K/AKT通路是侧柏叶作用于衰老的主要信号通路，结合核心靶点，PI3K/AKT/BCL-2通路中所占核心靶点的数目较多，因此我们最终选定PI3K/AKT/BCL-2通路进行验证。我们分别用qRT-PCR和western blot检测了PI3K、AKT1、BCL-2的表达。为了进一步验证侧柏叶对核心靶点AKT1表达的影响，我们还用免疫荧光染色检测了心肌p-AKT1的表达。结果显示，与正常对照组相比，衰老组小鼠心脏p-PI3K、p-AKT1、BCL-2表达明显降低，p-AKT1阳性面积明显下降（P<0.01），与衰老组相比，侧柏叶组则明显上调p-PI3K、p-AKT1、BCL-2的表达，p-AKT1阳性面积也明显上升（P<0.05），如图14、图15、图16所示。以上结果提示，侧柏叶能明显增强PI3K/AKT/BCL-2通路的活性，而发挥对抗衰老的作用。
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图14 AKT1免疫荧光染色分析A：AKT1免疫荧光染色部分选片B：AKT1免疫阳性面积分析
                   ** P＜0.01与正常对照组相比, #P＜0.05 与衰老组相比


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图15 western blot检测PI3K/AKT/BCL-2通路A：Western blot 检测p-PI3K、p-AKT1、BCL-2水平B：p-PI3K、p-AKT1、BCL-2蛋白相对表达量分析
       * P＜0.05, ** P＜0.01与正常对照组相比, # P＜0.05, ## P＜0.01 与衰老组相比
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                                    图16 qRT-PCR检测PI3K/AKT/BCL-2通路
                            * P＜0.05, ** P＜0.01与正常对照组相比, # P＜0.05与衰老组相比



       我们的前期，跟随指导老师学习实验动物的常规操作，已经掌握本实验需要的分子对接技术，qRT-PCR和western blot检测技术以及网络药理学相关数据库，软件和平台的运用，例如：TCMSP、Target Prediction等数据库、Cytoscape 3.10.1和Pymol、AutoDockTools软件、SwissADME和STRING平台；同时学习了实验室常规仪器的运用的运用，如全自动酶标仪、超灵敏多功能成像系统、石蜡切片 机；学习了常见组织石蜡切片的HE染色、马桑、天狼星和β半乳糖染色的整个流程，已经掌握了各种染色方法的各个环节，包括组织的固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色等。同时，也已经掌握了western blot和RT-qPCR实验操作的整个流程。目前，学姐在做有关毕业实习相关的实验，实验操作技术与本研究项目的实验操作密切相关，因此，如果在实验操作中遇到不懂的操作，可以继续向学长学习。与此同时，我们的指导教师具备丰富的指导学生实验的经验，已陆续指导学生毕业实习20余人，主持济宁医学院青年基金重点项目2项，济宁市科技局项目1项，参与山东省自然科学基金2项，贺林院士基金1项。同时，我们隶属于药学院心血管研究团队，团队的学长和老师具有丰富的细胞培养和分子生物学实验操作的经验，利于我们随时学习。而且，大家都在药理平台做实验，为了做出更好的结果，大家经常在一起交流各种实验手段和方法， 很有利于大家相互学习，共同提升。
       目前，在项目书写、实验数据处理及论文书写等方面能力尚不足，将来会大量的阅读相关中英文文献，书写文献总结或综述，以弥补以上不足。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 5000.00 购买实验材料、发表论文 2000.00 3000.00
1. 业务费 3000.00 发表论文 0.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 发表论文 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 2000.00 购买实验材料 2000.00 0.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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