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基于网络药理学和分子对接研究侧柏叶水提物缓解血管钙化的分子机制

申报人：孙艺轩 申报日期：2025-03-20

基本情况

2025创新项目
基于网络药理学和分子对接研究侧柏叶水提物缓解血管钙化的分子机制 学生申报
创新训练项目
医学
药学类
学生自主选题
二年期
血管钙化是钙磷在血管壁的异常沉积，是衰老的重要表现，亦是慢性肾病、糖尿病、高血压以及动脉粥样硬化患者的重要表征之一。随着人口老龄化进程的加快，防治血管钙化具有重要的意义。血管钙化的发生与血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨样细胞转化、钙磷失衡，炎症学说等有关。其中VSMCs向成骨样细胞转化是中心环节。申请人前期研究发现，侧柏叶水提物能明显减轻由 VD3 联合尼古丁诱导的血管钙化小鼠腹主动脉的增厚，减少腹主动脉管壁钙离子的沉积，提示侧柏叶水提物明显缓解血管钙化，而侧柏叶水提物亦能下调血管钙化小鼠骨形态发生相关蛋白OPN和BMP4的表达，但对于侧柏叶水提物缓解血管钙化及下调血管钙化小鼠骨形态发生蛋白表达的深层机制，尚不十分清楚。本研究将在前期工作的基础上进一步通过网络药理学分析侧柏叶水提物缓解血管钙化的主要药效物质、核心靶点及发挥作用的主要信号通路，再通过分子对接技术以及动物实验对网络药理学的结果进行验证，以期揭示侧柏叶水提物缓解血管钙化及下调骨形态发生相关蛋白的深层分子机制。
学习并参与了校级大学生创新创业项目，侧柏叶水提物降压作用的研究（cx2024323py)；
掌握常规实验动物的操作技术；
掌握实验室常规仪器的操作，如切片机，离心机、酶标仪等；
掌握网络药理学和分子对接技术，熟练运用SwissTargetPrediction 数据库、UniProt 数据库、STRING平台等数联应用；
掌握常见组织石蜡切片的HE染色、Von Kossa染色、免疫荧光染色以及western blot、RT-qPCR等实验方法。
指导校级大学生创新创业项目7项，结题3项；主持济宁医学院青年教师科研扶持基金一般项目1项，主持济宁医学院青年教师科研扶持基金重点项目1项，主持济宁市科技局项目1项，目前都已结题。主持山东省中医药项目1项（在研）；参与山东省自然科学基金项目2项，参与贺林院士基金项目1项。参与山东省中医药项目1项。
指导教师负责指导及监管整个项目的立项、实施；为整个项目的开展提供技术以及相关的资金支持；帮助学生解决在整个项目实施过程中遇到的各种问题；指导学生书写研究论文。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
孙艺轩 药学院 药学（本科） 2023 统筹项目分工，撰写项目申请书
贾云哲 药学院 药物制剂（本科） 2024 Western blot实验
徐昌艳 药学院 药物制剂（本科） 2024 网络药理和分子对接
丁佳依 药学院 药物制剂（本科） 2024 Von Kossa及免疫荧光染色
高雅茹 药学院 药物制剂（本科） 2024 qRT-PCR及各种试剂盒检测
魏春婷 药学院 药物制剂（本科） 2024 动物实验，B超影像

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
李丽 药学院 否

立项依据

1.通过网络药理学获取侧柏叶和血管钙化（vascular calcification , VC）相关靶点，并构建与分析“成分－交集靶点－药物－疾病”网络，预测侧柏叶在治疗 VC 中的分子作用机制。
2.通过分子对接技术预测侧柏叶核心成分与靶点的结合能力，以初步验证网络药理学的结果。
3.在整体动物水平上研究侧柏叶水提物对维生素D3和尼古丁联合诱导的血管钙化是否具有缓解作用。
4.在整体动物水平上研究柏叶水提物是否通过影响骨桥蛋白（OPN）、BMP-4的表达，进而影响血管平滑肌向成骨样细胞转化，缓解血管平滑肌钙化。
5.在整体动物水平上研究侧柏叶水提物是否通过PI3K/AKT/BCL-2通路以及MAPK通路缓解血管钙化。
第一部分：通过网络药理学获取侧柏叶和VC相关靶点，并构建与分析“成分－交集靶点－药物－疾病”网络，预测侧柏叶在治疗 VC 中的分子作用机制。
1.侧柏叶相关成分的获取与筛选
       通过TCMSP和TCMID数据库搜索“侧柏叶”或“CE BAI YE”，筛选出口服利用度（OB)≥30%和类药性（DL)≥0.18的化学成分，并补充已有研究证实与VC相关的未收录成分，构建侧柏叶活性成分数据库。
2.侧柏叶相关靶点的获取
       在SwissTargetPrediction数据库，筛选出可信度大于0的化合物靶点。在UniProt数据库里搜索蛋白质的官方基因名，获取侧柏叶的靶点基因库。
3.VC相关靶点的获取与筛选
       使用“vascular calcification”作为关键词，在GeneCards、OMIM和Disgent数据库中检索与VC相关的靶点蛋白，去重并合并信息，为得到标准化的蛋白质靶点可以将其导入UniProt数据库。
4.构建与分析“成分－交集靶点－药物－疾病”网络
       通过Venny 2.1.0，得到 血管钙化疾病的靶点基因和侧柏叶药物成分的靶点之间的重叠部分，然后在Cytoscape 3.10.1构建“成分－交集靶点－药物－疾病”网络，进行拓扑学分析。网络中的节点（node）代表成分或靶点，边表示它们的关系。节点的度值（degree）反映侧柏叶在网络药理学研究中的重要性，揭示其对抗VC的主要活性成分。
5.构建VC靶点-侧柏叶靶点的蛋白互作（PPI）网络
       侧柏叶与VC的共同靶点经STRING平台构建PPI网络，设置互作阈值0.900，排除孤立蛋白后导出tsv文件。利用Cytoscape 3.10.1进行拓扑分析，为得到侧柏叶抗VC的核心靶点，可以依据度值（即节点大小和颜色）筛选。
6.侧柏叶治疗VC相关靶点的GO和KEGG富集分析
       使用DAVID 6.8分析侧柏叶治疗VC的交集靶点蛋白，以揭示相关生物学过程和代谢通路，设定P<0.05为阈值，对靶基因进行GO和KEGG分析，基于细胞组分（CC）、生物过程（BP )和分子功能（MF）进行GO富集分析，选择P值排序前10和前20的GO过程和KEGG通路，为预测侧柏叶在治疗VC中的分子作用机制，可利用微生信软件实现可视化，预测侧柏叶在治疗VC中的分子作用机制。
第二部分：通过分子对接技术预测侧柏叶核心成分与靶点的结合能力。
      从TCMSP数据库检索核心成分的mol2结构，并导入至AutoDockTools库。从PDB获取核心靶点的文件，转换为pdbqt格式后，使用AutoDock Vina评估它们之间的结合活性，其中结合能小于-4.25 kcal·mol⁻¹表明有较弱结合，小于-5.0 kcal·mol⁻¹为较好结合，小于-7.0 kcal·mol⁻¹则显示强烈结合。并绘制核心活性组分与靶点的分子对接模式图。
第三部分：在整体动物水平上研究侧柏叶水提物对维生素D3和尼古丁联合诱导的血管钙化是否具有缓解作用。
1.实验分组
      取健康雄性小鼠28只随机分为三组，分别为空白对照组（A）、维生素D3肌肉注射+尼古丁灌胃组(B)、维生素D3肌肉注射+尼古丁灌胃+侧柏水提物灌胃组（C)，A组8只，B组、C组分别各10只。A组仅肌肉注射等量的生理盐水，灌胃等量的花生油，不做其他处理；B组维生素D3肌肉注射，并将尼古丁溶于花生油中灌胃，每天两次；C组在每天肌肉注射两次维生素D3和尼古丁花生油溶液灌胃的基础上，次日起每天用侧柏叶水提物和蒸馏水配置的溶液灌胃。6周后眼球取血并取主动脉段组织标本备用。
2.观察指标
①超声仪检测腹主动脉段影像
      因血管钙化后B超影像下会有血管回声增强及血流阻力等的改变，因此在本研究中采用小动物超声仪观察腹主动脉段影像，检测小鼠血管壁厚度及血管内血流阻力，以期观察侧柏叶水提物能否缓解血管钙化小鼠腹主动脉的B超影像变化。
②Von Kossa染色
      因硝酸银与钙盐中的磷酸盐或碳酸盐离子反应，生成磷酸银或碳酸银沉淀，在光照下银盐被还原为黑色的金属银，从而能显示钙盐的沉积部位。Von Kossa染色便是一种利用此原理而显示钙沉积的特异性染色，因此在本研究中我们对各组小鼠的腹主动脉进行了Von Kossa染色，以期观察侧柏叶水提物能否减轻血管钙化小鼠腹主动脉钙盐的沉积。
      组织经固定、脱水、包埋、切片后，依照以下步骤进行Von Kossa染色。滴染Von Kossa覆盖组织，放置在湿盒中，超净台紫外灯照射4h后超纯水浸洗三次，流水冲洗3min后复染，苏木素8min，自来水清洗，盐醇分化液分化3min，自来水清洗，85%乙醇5min，95%乙醇5min，伊红染液染色5min，无水乙醇(Ⅰ)5min，无水乙醇(Ⅱ)5min，无水乙醇(Ⅲ)5min，二甲苯(Ⅰ)5min，二甲苯(Ⅱ)5min，中性树胶封片，显微镜观察。
③血清中钙离子定量检测
      因血管钙化后往往会伴有血清钙的变化，因此在本研究中我们采用钙离子定量检测试剂盒检测血清中钙离子含量，以期观察侧柏叶水提物能否缓解血管钙化小鼠血清钙的变化。
第四部分：在整体动物水平上研究柏叶水提物是否通过影响血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化，缓解血管钙化。
①血清中碱性磷酸酶(AKP)含量测定
      据文献报道，血管钙化的发生与血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化有关。而成骨细胞的增殖会释放较多的AKP，因此在本研究中我们采用碱性磷酸酶试剂盒检测血清中AKP含量，以期观察侧柏叶水提物能够缓解血管钙化小鼠AKP含量的升高，能否减缓血管平滑肌细胞向成骨样细胞的转化。
②骨形态发生蛋白 (BMP-4) 、骨桥蛋白（OPN）含量测定
      据文献报道，血管钙化的发生与血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化密切相关。而骨形态发生蛋白 (BMP-4) 、骨桥蛋白（OPN）是成骨细胞的标志物，因此在本研究中，我们采用western blot 检测腹主动脉BMP-4、OPN的蛋白表达水平，采用qRT-PCR的方法检测腹主动脉OPN的mRNA水平，与此同时，我们还采用免疫荧光染色的方法检测腹主动脉OPN的表达，以期观察侧柏叶水提物能够缓解血管钙化小鼠腹主动脉BMP-4和OPN的表达，能否减轻血管钙化小鼠血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化。
      western blot 方法检测腹主动脉BMP-4、OPN含量:依照文献记载的有关western blot 操作流程，进行细胞蛋白的提取，BCA 法蛋白定量及蛋白样本制备、制胶、SDS-PAGE 电泳、转膜, 5% 脱脂奶粉封闭 1 h；兔抗（GAPDH、BMP-4、OPN）4 ℃条件下摇床上孵育过夜、TBST洗膜3次，每次10 min；室温条件下孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 1 h；TBST洗膜3次，每次10min；显影并保存图片。
      qRT-PCR方法检测腹主动脉段OPN mRNA表达:依照文献记载的有关qRT-PCR操作流程，进行腹主动脉总RNA的提取，反转录合成cDNA，以β-actin为内参，配置qRT-PCR反应体系，实时荧光定量 PCR仪对目的基因进行扩增。
      免疫荧光法检测骨桥蛋白（OPN）表达：依照免疫荧光染色流程，将腹主动脉石蜡切片脱蜡至水后，切片放在柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）中并于微波炉内进行抗原修复，用组化笔在切片周围画圈并在圈内滴加BSA孵育30 min，加Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，加Ⅱ抗室温孵育50 min，DAPI复染细胞核，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下拍照，Image J分析数据。
第五部分：在整体动物水平上研究侧柏叶水提物是否通过PI3K/AKT/BCL-2通路以及MAPK通路缓解血管钙化。
      我们前期网络药理学KEGG富集分析结果显示，PI3K/AKT通路和MAPK通路在侧柏叶水提物对抗血管钙化的过程中发挥重要作用，结合侧柏叶和血管钙化互作网路，这两个通路所占的核心靶点数量也较多，因此，我们最终选择PI3K/AKT/BCL-2通路和MAPK通路进行验证。在本研究中，我们采用western blot方法检测腹主动脉MAPK表达，采用qRT-PCR方法检测腹主动脉PI3K、AKT1和BCL-2mRNA表达，以期观察侧柏叶水提物能否通过PI3K/AKT/BCL-2通路以及MAPK通路缓解血管钙化。
      Western blot检测腹主动脉P-MAPK的表达：依据上述的western blot操作流程对腹主动脉的p-MAPK蛋白表达进行检测。
      qRT-PCR 检测腹主动脉PI3K、AKT1、BCL-2mRNA水平：依据上述的qRT-PCR操作流程，对腹主动脉PI3K、AKT1、BCL-2 mRNA水平进行检测。
       血管钙化( vascular calcification , VC )即在心血管组织，如血管和心脏瓣膜中，出现磷酸钙盐晶体（尤其是羟基磷灰石）异常沉积的情况，在动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾病( CKD ) 及高血压患者中比较常见，是这些疾病中不可忽视的血管病变之一[1]。VC分为中膜钙化和内膜钙化两种主要病理方式，前者多出现在CKD早期阶段，无炎症或脂质异常而易引发心功能障碍，而后者多由巨噬细胞和脂质物质在CKD中晚期于血管内膜沉积，可能诱发冠状动脉缺血[2]。以往的观点认为，血管平滑肌细胞向成骨样细胞的转分化是血管钙化中最重要的病理生理因素。然而，随着对血管钙化研究的不断深入，现已发现，血管内皮细胞与血管平滑肌细胞共同参与血管钙化的发生发展。内膜钙化是骨生物学和慢性炎性斑块共同作用的结果。内皮细胞促进血管钙化的主要机制包括内皮祖细胞激活、氧化应激、炎症、自分泌/旁分泌功能、机械转导、高磷血症和内皮－间质转化，这些机制相互交织，最终导致血管钙化[3]。中膜钙化是不同病因在不同病理状态导致的最终结果，它与衰老、糖尿病、高血压、骨质疏松症、慢性肾脏病、甲状腺功能亢进和维生素D紊乱等疾病相关[4]。血管中膜钙化主要通过血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转化，转化的血管平滑肌细胞表达骨相关因子和骨相关蛋白等物质，再介导血管钙化。其中涉及的主要分子机制包括慢性炎症、内质网应激、线粒体功能障碍、铁稳态、程序性细胞死亡，以及其他细胞代谢动力学等[5]。
目前，中医药研究在减轻血管钙化方面显示出潜力[6]，中药治疗血管钙化也已成为防治血管钙化研究的热点。
侧柏叶又称柏叶，扁柏叶，为柏科植物侧柏的嫩枝与叶，夏秋采收，剪取小枝，晾干。是一种具有生物活性的中药单体成分。《本草纲目》中曰：“柏有数种，入药唯取叶扁而侧生者，故曰侧柏。”[7]
据文献记载侧柏叶气味清香，味道苦涩，归肺、肝、脾 经，具有止咳化痰、生发等功效，侧柏叶的止血作用适用于各种出血疾病。近年来经药理学研究证实，侧柏叶还具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤，抗炎等多种药理学作用。[8,9]此外，我们还发现侧柏叶水煎液能明显减轻糖尿病小鼠的“三多一少”的症状，对糖尿病有一定的治疗作用，其机制与抗氧化、降低胰岛素抵抗有关。[10]
目前，关于侧柏叶化学成分的研究焦点主要落在了黄酮类化合物上。除了药典中明确指出的槲皮苷外，侧柏叶中还含有其他多种黄酮类成分，这些成分包括但不限于杨梅苷、山柰酚、穗花杉双黄酮和芦丁等。黄酮类和双黄酮类是侧柏叶的特征性成分，同时也具有显著的药效[11]。梁青春等研究发现槲皮素可以通过调节 ROS/TLR4 信号通路抑制 Ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞钙化[12]。李徐研究发现山柰酚可以通过抑制铁死亡减轻血管钙化[13]。所以寻找新的血管内皮细胞与血管平滑肌细胞具体分子机制对于缓解血管钙化具有重要意义。查阅文献后发现侧柏叶中含有的槲皮素和山柰酚分别有抑制血管平滑肌细胞钙化和减轻血管钙化的作用。相关文献提及到 PI3K/AKT 信号通路对细胞分裂、增殖、凋亡和代谢等关键生物学过程有广泛影响，与心血管疾病密切相关。AKT，特别是 AKT1，作为此通路的关键激酶，对细胞生长和抗凋亡至关重要。该通路在心肌细胞中作用显著，可抑制细胞凋亡、减轻炎症、改善心肌代谢，深度参与心血管疾病发展。尽管 PI3K/AKT 是心血管疾病的潜在治疗靶点，但仍需加强其与心血管疾病的特异性研究[14]。也有相关文献提及到丝裂原活化蛋白激酶( MAPKs )在真核细胞增殖、转分化和凋亡等生理过程中至关重要。特别是，MAPK 在骨发育、代谢和成骨分化中扮演核心角色。其中，ERK和 p38 途径主导成骨分化和骨发育。因此，在本项目中，针对侧柏叶水提物对血管钙化的改善作用及其相关机制这一问题，我们应用网络药理学和分子对接技术展开研究。
参考文献
[1]钟慧,李带瑛,王苏樱,等.丹参酮Ⅱa通过 NF-κB和β-catenin信号通路抑制血管钙化[J]. 生理学报, 2022,74(6):949-958.
[2]何猛,戎殳.肠源性尿毒症毒素与血管钙化机制进展[J/OL].中国动脉硬化杂志,1-16[2024-06-05].
[3]Jiang H, Li L, Zhang L, et al.Role of endothelial cells in vascular calcification. Front Cardiovasc Med. 2022;9:895005.
[4]Peter L ,Manfred B ,Victor S , et al.Medial vascular calcification revisited: review andperspectives.[J].European heart journal,2014,35(23):1515-25.
[5]王江东,沈洲姬,徐鹏杰,等.RANKL/RANK/OPG 信号通路对骨代谢和血管钙化作用机制的研究现状[J].生命的化学,2024,44(3):448-455.
[6]陈诚,张钲,彭瑜等.血管平滑肌细胞表型的成骨转换与血管钙化[J/OL].中国动脉硬化杂志:1-9[2024-02-28].http://kns.cnki.net/kcms/detail/43.1262.R.20231213.1646.008.html.
[7]韩德承.柏子仁与侧柏叶[J].家庭医学,2023(12):23.
[8]张瑞峰,曾阳,刘力宽等.侧柏叶的化学成分与药理学作用研究进展[J].中国野生植物资源,2021,40(04):53-56.
[9]苗慧. 侧柏叶的化学成分及药理活性研究[D].吉林农业大学,2019.
[10]李丽,刘文彦,王青.侧柏叶水煎液对糖尿病模型小鼠的治疗作用及作用机制探讨[J].济宁医学院学报,2017,40(04):271-274.
[11]张瑞峰,曾阳,刘力宽,等.侧柏叶的化学成分与药理学作用研究进展[J].中国野生植物资源,2021,40(4):53-56.
[12]梁青春,陈燕亭,李传翔,等.槲皮素调节 ROS/TLR4 信号通路抑制 Ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞钙化[J].南方医科大学学报,2018,38(8):980-985.
[13]李徐.山奈酚通过抑制铁死亡减轻血管钙化[D].苏州大学,2023.
[14]李赛赛,李平,康楠,等.PI3K/Akt 信号通路与心血管疾病关系的研究进展[J].北京医学,2021,43(1):66-69+72.
1.首次应用网络药理学对侧柏叶水提物对血管钙化主要活性物质、核心靶点和信号通路进行了预测分析，并用分子对接技术和动物实验对网络药理学的内容进行了验证。
2.首次提出侧柏叶可以缓解血管钙化，并且证明侧柏叶可能通过激活PI3K/AKT/BCL-2通路缓解血管钙化。
3.结合网络药理学、分子对接和动物实验视角对于侧柏叶水提物缓解血管钙化的作用及其机制进行了分析，使得侧柏叶研究的视角更加多元化，弥补单一视角的局限性。
4.本研究的开展将对血管钙化导致的慢性肾脏病患者并发心血管疾病的概率降低以及为治疗血管钙化提供更多的可能性。

技术路线：

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拟解决的问题：
1.应用网络药理学和分子对接技术在整体动物水平上研究侧柏叶水提物对抗血管钙化的机制；
2.在整体动物水平上研究侧柏叶水提物是不是通过PI3K、AKT、BCL-2通路以及MAPK通路影响血管平滑肌向成骨样细胞转化，进而缓解血管钙化的；
3.在整体动物水平上研究侧柏叶水提物对维生素D3和尼古丁联合诱导的血管钙化的缓解作用的相关机制是否和血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨样细胞表型转化有关。
预期成果：
在SCI收录的期刊或者北大Ⅰ类核心期刊发表论文1篇，形成研究报告，在省级及其以上的大学生创新创业大赛中取得奖项。
第一阶段：准备阶段 （2025年3月）
1）组建团队，确定研究项目，撰写报告。
2）制定实验方案，完成前期资料整理汇总。
3）采购实验所需材料
第二阶段：实验阶段（2025年4月-2026年4月）
1）第一、二部分实验（2025年4月-2025年7月）
2）第三、四部分实验（2025年8月-2025年11月）
3）第五部分实验（2025年12月-2026年4月）
第三阶段：整理数据、发表论文（2026年5月-2027年4月）
1）整理实验数据，对实验数据进行统计分析，得出实验结果。
2）书写论文并投稿。
      近期，我们就侧柏叶水提物改善血管钙化及其相关机制进行了研究，结果如下：
1）获取侧柏叶和血管钙化的交集靶点并构建“成分－交集靶点－药物－疾病”网络
登录Venny2.1.0网页，显示侧柏叶与VC共有的133个交集靶点（见图1），这些靶点与侧柏叶中的7个化合物相关。接着，通过Cytoscape 3.10.1软件构建了涵盖“成分－交集靶点－药物－疾病”关系的可视化网络（见图2）。在Network Analyzer的拓扑学分析中显示，槲皮素（quercetin）、扁柏脂素（Hinokinin）、异海松酸（Isopimaric acid）、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）这五种侧柏叶成分在潜在靶点数量上排名靠前，因此可能是治疗VC的关键成分。
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                   图1 侧柏叶和血管钙化的交集靶点

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               图2 构建成分—交集靶点—药物—疾病网络
（椭圆形为侧柏叶活性成分；长方形为侧柏叶与VC的交集靶点）

2）构建侧柏叶和血管钙化蛋白相互作用网络
节点度值的大小通过节点颜色和面积直观呈现，颜色越深、面积越大，表示节点度值越高。结果显示，AKT1、TP53、CASP3、EGFR、BCL-2等的度值排名靠前，推断这些靶点是侧柏叶抗VC的核心靶点。如下图所示：
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                图3 侧柏叶和血管钙化蛋白相互作用网络

3）进行GO 和 KEGG 富集分析，预测侧柏叶在治疗VC中的分子作用机制
通过 DAVID 数据库的 GO 分析，筛选出 888 个 GO 条目，其中 BP、CC、MF 各选前 10 项进行可视化（见图 4）。结果表明，侧柏叶治疗 VC 的靶点主要涵盖的生物过程有磷酸化、信号传导、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控等，细胞组分有质膜、细胞液、细胞质等细胞组分，以及分子功能有蛋白结合、ATP结合等。KEGG 分析表明有 156 条细胞信号通路，其中前 20 条作为治疗 VC 的重要途径进行可视化（见图 5）。其中，PI3K-Akt 和 MAPK 信号通路富集靶点较多，提示侧柏叶可能主要通过这些通路发挥抗 VC 作用。
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                                 图4 核心靶点的 GO 分析
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                        图5 核心靶点的 KEGG 富集分析

4）应用分子对接技术，获得侧柏叶靶点与活性成分的分子结合自由能
靶点与活性成分的分子对接结果中（见表 1），25对对接中，22对（88%）对接的结合能低于-7.0 kcal·mol^-1，3对（12%）对接的结合能在-7至-5 kcal·mol^-1之间，表明核心靶点与活性成分结合特性较强烈。

              表1靶点与活性成分的分子结合自由能
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                  图6 核心靶点与活性成分的分子对接模式图

5）侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉血管壁厚度的影响
Vevo lab超声处理结果表明血管壁厚度及阻力指数钙化组＞实验组＞正常组，且钙化组的血流速度最快，阻力指数最大，如图7、表2所示。提示侧柏叶水提物能明显缓解血管钙化小鼠腹主动脉增厚及血流速度的增加。
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   图7 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉B超成像的影响

      表2 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉B超成像
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（注：*，P＜0.05，与正常组相比；#，P＜0.05，与钙化组比较)
(AA PSV：腹主动脉收缩期血流速度、AA EDV：腹主动脉舒张期血流速度)

6）侧柏叶水提物对血管钙化小鼠血清钙离子浓度的影响
钙离子定量检测结果显示钙化组和给药组与正常组相比血清中钙离子浓度升高；给药组与钙化组相比血清中钙离子浓度明显降低，给药组可以明显降低血清中钙离子含量。如图8所示。
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            图 8 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠血清钙的影响
（ *** P<0.005， 与正常对照组相比；** P<0.01，与钙化组相比）

7）侧柏叶水提物对血管钙化小鼠血清AKP活力的影响
碱性磷酸酶试剂盒检测显示钙化组小鼠血清中AKP活力显著提升，实验组小鼠血清中AKP表达水平较钙化组显著降低。如图9所示，提示侧柏叶水提物能明显降低血管钙化小鼠血清AKP活力，侧柏叶水提物可能通过抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化来缓解血管钙化。
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       图9 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠血清AKP活力的影响
（ * P<0.05， 与正常对照组相比；** P<0.01，与钙化组相比）

8）Von Kossa染色各组小鼠血管钙化的差别
Von Kossa染色显示钙化组主动脉段血管有黑色颗粒样钙盐沉积，实验组有少量黑色颗粒沉积，而正常组血管壁未见明显钙盐沉积，如图10所示，提示侧柏叶水提物能明显缓解血管钙化小鼠腹主动脉钙盐的沉积。
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     图10 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉Von Kossa染色的影响

9）侧柏叶水提物降低OPN和BMP-4蛋白表达量
western blot 结果表明OPN和BMP-4在血管钙化过程中蛋白表达量增加，实验组与钙化组相比OPN和BMP-4蛋白表达量降低。如图11所示。提示侧柏叶水提物能明显降低血管钙化小鼠OPN和BMP-4的表达，侧柏叶可能通过抑制血管平滑肌样细胞向成骨细胞转化来缓解血管钙化。
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     图11 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉OPN 和BMP-4表达的影响

10）侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉OPN免疫荧光染色的影响
通过免疫荧光检测OPN表达结果显示，与正常组相比，模型组OPN的表达明显升高（P<0.01）；与模型组相比，给药组OPN的表达降低（P<0.05），然后通过 qRT-PCR 检测 OPN 表达结果也发现，与正常组相比，模型组 OPN的表达明显升高( P<0.01 )；与模型组相比，给药组OPN的表达降低( P<0.05 )，如图12、图13所示。提示侧柏叶水提物能明显降低血管钙化小鼠腹主动脉OPN和BMP-4的表达，侧柏叶可能通过抑制血管平滑肌样细胞向成骨样细胞转化缓解血管钙化。
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                     小鼠血管OPN免疫荧光染色图
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图12侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉OPN免疫荧光染色的影响
（** P<0.01 与正常对照组相比；#P<0.05 与血管钙化组相比）
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图13 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉OPN mRNA水平的影响
（** P<0.01 与正常对照组相比；#P<0.05 与血管钙化组相比）

11）侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉PI3KmRNA、AKT1mRNA、BCL-2mRNA表达的影响
依据相关文献及网络药理学分析可知，PI3K/AKT/BCL-2通路参与血管钙化的发生。通过qRT-PCR检测，结果显示，与正常组相比，模型组PI3K的表达明显降低（P<0.01）；与模型组相比，给药组PI3K的表达显著增高（P<0.01）。与正常组相比，模型组AKT1的表达降低（P<0.05）；与模型组相比，给药组AKT1的表达增高（P<0.05）。与正常组相比，模型组BCL-2的表达非常明显的降低（P<0.01）；与模型组相比，给药组BCL-2的表达显著增高（P<0.01），见图14所示。提示侧柏叶水提物可能通过增强PIK3/AKT/BCL-2通路缓解血管钙化。
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图14 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉PI3K、AKT1、BCL-2mRNA水平的影响
（ * P<0.05， ** P<0.01 与正常对照组相比；#P<0.05，## P<0.01与血管钙化组相比）

12）侧柏叶水提物对血管钙化小鼠模型血管p-p38 MAPK蛋白表达的影响
依据相关文献及网络药理学分析可知，MAPK通路参与血管钙化的发生。western blot通过检测，结果显示，与正常组相比，模型组p-p38 MAPK的表达明显增高( P<0.01 )；与模型组相比，给药组p-p38 MAPK的表达显著降低( P<0.01 )，如图15所示，提示侧柏叶水提物可能通过抑制MAPK通路缓解血管钙化。
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图15 侧柏叶水提物对血管钙化小鼠腹主动脉 p-p38 MAPK 蛋白表达的影响

其他相关研究如下：
1）李丽，高波，刘梅芳。侧柏叶对家兔心肌缺血-再灌注损伤的保护效应及其胆碱能抗炎作用。济宁医学院学报，2021，44（01）：14-17.
2）Li Li，Bo Gao, Mei-fang Liu. Antagonistic Effects of Tetramethylpyrazine on Hypoxic Respiratory Depression in Rats. Evid Based Complement Alternat Med, 2020: 6456017. doi: 10.1155/2020/6456017.
3）李丽，苗文静，王青。侧柏叶水煎液对耳廓炎症和腹腔炎症模型小鼠的抗炎作用。中国药房，2015，26（25）：3515-3517.
4）李丽，刘文彦，苗文静。酸敏感离子通道在大鼠低O2高CO2所致呼吸效应中的作用，济宁医学院学报，2015,38(04)：243-246。
5）李丽，刘文彦，高波。酸敏感离子通道在中枢化学感受器呼吸调节中的作用。中国病理生理杂志. 2014,30(08)：1400-1403。
8）李丽，刘文彦，刘莹。丹红注射液延迟缺氧性呼吸抑制的发生及其机制，中国病理生理杂志.  2014,30(06)：1123-1126。
7）刘梅芳，孙悦，李丽。枸骨叶水提物对小鼠肥胖的预防作用及对脂肪分化的影响。中国病理生理杂志. 2020,36(05)：899-905。
8）高波，任强，李丽，刘梅芳，黄志成。正己烷亚急性染毒对小鼠骨骼肌超微结构及线粒体分裂与融合基因表达的影响。济宁医学院学报. 2020,43(02)：90-93。
9）刘梦晴，肖子怡，黄依芳，刘文丽，谷雨，王叶凌，沈哲慧，李丽。侧柏叶乙酸乙酯提取物缓解小鼠糖尿病心肌病[J].中国病理生理杂志,2024,40(08):1417-1425.
10）沈哲慧，刘梦晴，朱雪晴，李丽。侧柏叶提取物对血液凝固的影响及其机制[J].济宁医学院学报,2024,47(01):5-9.
       前期，跟随指导老师学习实验动物的常规操作，已经熟练掌握了本研究所需的小鼠灌胃、腹腔注射、动物取血、取脏器等操作方法，同时学习了实验室常规仪器的使用，比如酶标仪、离心机、PCR仪等。学习了血管石蜡切片的HE染色、Von Kossa染色茜素红染色、免疫组化染色的整个流程，已经掌握了各种染色方法的各个环节，包括组织的固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色等。同时，也已经掌握了western blot和qRT-PCR实验操作的整个流程。目前，学长在做有关毕业实习相关的实验，实验操作技术与本研究项目的实验操作密切相关，因此，如果在实验操作中遇到不懂的操作，可以继续向学长学习。与此同时，我们的指导教师具备丰富的指导学生实验的经验，已陆续指导学生大学生创新创业项目7项，已结题3项。主持济宁医学院青年基金重点项目2项，济宁市科技局项目1项，参与山东省自然科学基金2项，贺林院士基金1项。主持山东省中医药项目1项，参与山东省中医药项目1项。同时，我们隶属于药学院心血管研究团队，团队的学长和老师具有丰富的细胞培养和分子生物学实验操作的经验，利于我们随时学习。而且，大家都在药理平台做实验，为了做出更好的结果，大家经常在一起交流各种实验手段和方法， 很有利于大家相互学习，共同提升。
       目前，在项目书写、实验数据处理及论文书写等方面能力尚不足，将来会大量的阅读相关中英文文献，书写文献总结或综述，以弥补以上不足。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 5000.00 购买实验材料，发表论文 2000.00 3000.00
1. 业务费 3000.00 发表论文 0.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 发表论文 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 2000.00 购买实验材料 2000.00 0.00
结束

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