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负载根尖牙乳头干细胞来源外泌体的GelMA水凝胶在骨缺损修复中的作用及机制研究

申报人：史文清 申报日期：2025-03-20

基本情况

2025创新项目
负载根尖牙乳头干细胞来源外泌体的GelMA水凝胶在骨缺损修复中的作用及机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
口腔医学类
学生自主选题
二年期
牙槽骨缺损不仅会导致牙齿脱落，还会影响口腔功能和面部美观。目前多用骨移植治疗牙槽骨组织缺损，但会增加手术创伤且移植物可用性有限。因此，探究骨缺损治疗的新方法具有重要临床意义。根尖牙乳头干细胞（SCAP）是外胚层神经嵴源性的成体干细胞群，增殖能力强。SCAP来源的外泌体（SCAP-Exo）具有丰富生物活性物质，能够激活Wnt/β-catenin通路促进成骨分化。然而，外泌体的稳定性、传递效率和弱靶向性限制其临床应用，尤其是免疫系统对外泌体的快速清除能力大大降低了外泌体在体内的存留时间，严重影响治疗效果。 甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶，因可控的理化性质、良好的生物相容性及可降解性等特性而广泛应用于药物递送和骨、软骨等组织再生中。已有研究表明，外泌体与水凝胶形成的生物复合物，能够显著改善外泌体的组织维持时间和治愈效果。 本项目通过将SCAP-Exo负载到GelMA水凝胶中，设计实验探究其在骨缺损修复中的作用，探究负载外泌体的水凝胶在外泌体运输、靶向递送至修复部位并促进骨组织再生的机制，构建一种新型骨修复材料，结合外泌体的生物学功能与水凝胶的支架特性，为骨缺损提供新的临床治疗方案。
1.获济宁医学院2024年中国国际大学生创新大赛校级一等奖、第十二届山东省大学生生物科技创新创业大赛校级一等奖。
2.已于2024年5月进入口腔医学院实验室跟随指导老师进行实验技术学习，现已熟练掌握细胞培养等实验操作及实验数据分析处理，能够独立完成本课题中涉及的所有实验。
3.在校期间多次参加校内科研论坛等学术讲座，加深了对科研的理解和认识，培养了科研方向的全局观念，为本课题的顺利开展奠定了基础。
1.牙周病与心血管疾病的关系
2.牙周病与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系的机制研究
3.口腔新型仿生再矿化材料的研究
已多次组织本课题组成员进行课题研讨，通过查阅国内外文献，制定了详细可行的技术路线，在科研技术上强烈支持本项目高质量的完成。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
史文清 口腔医学院 口腔医学（本科） 2022 设计实验 查阅文献
孙婷 口腔医学院 口腔医学（本科） 2021 动物建模
汪昱含 口腔医学院 口腔医学（本科） 2023 收集资料 动物实验
刘思含 口腔医学院 口腔医学（本科） 2022 饲养兔 动物实验 归纳总结
叶如嫣 口腔医学院 口腔医学（本科） 2022 饲养小鼠 免疫荧光 Wb

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
闫锐 口腔医学院 否

立项依据

1.提取鉴定SCAP分泌的外泌体，制备GelMA水凝胶，并将SCAP-Exo负载于生物相容性良好的GelMA水凝胶中，构建一种治疗牙槽骨缺损的新型生物材料。在不断改善外泌体获取方式的同时，继续探索水凝胶负载外泌体方法，以便充分发挥出两者的优势。
2.设计实验，验证负载根尖牙乳头干细胞来源外泌体的GelMA水凝胶在骨缺损修复中的作用及机制，探索水凝胶材料用于负载干细胞外泌体的应用前景，为提高外泌体的利用度提供实验信息。
3.结合负载根尖牙乳头干细胞来源外泌体的GelMA水凝胶的作用机制，提出通过水凝胶负载外泌体治疗牙槽骨缺损病人的研究方案，为临床骨缺损治疗提供一种安全、高效且具有广阔应用前景的新策略，同时为干细胞来源外泌体在再生医学领域的应用提供理论依据和技术支持。 
1.拟研究方向
（1）外泌体的提取鉴定：高效提取和分离SCAP-Exo，并对其物理化学特性、生物活性成分进行鉴定和表征。目前，超速离心法被认为是提取外泌体最常用方法，利用低离心力去除细胞和细胞碎片，超高速离心力得到外泌体，所提取的外泌体纯度相对较高，成本也较低。实验将采用超速离心法提取SCAP-Exo，为进一步深入研究SCAP外泌体的生物学作用奠定基础。
（2）GelMA水凝胶的制备：GelMA水凝胶保有明胶良好的生物相容性，满足递送细胞的条件，可以用作支架材料为组织缺损区域递送外源干细胞。项目将设计并制备具有适宜结构的GelMA水凝胶，以作为负载外泌体的理想载体。
（3）外泌体负载水凝胶的作用机制研究：通过构建牙槽骨缺损动物模型并设置体外实验和体内实验，评估负载SCAP-Exo的GelMA水凝胶对成骨细胞的增殖、分化、迁移及成能力的影响，验证该复合材料促进骨缺损修复的效果，包括骨再生速度、骨质改变情况等，深入揭示外泌体与GelMA水凝胶的协同作用机制，明确两者在骨缺损修复中的共同作用。
（4）临床适用性评估：基于实验结果，评估负载SCAP-Exo的GelMA水凝胶在临床牙槽骨缺损修复中的潜在应用价值，包括安全性、有效性及可行性分析。继续研究开发可行的水凝胶-外泌体递送系统，为干细胞负载外泌体用于牙槽骨缺损修复的临床研究提供实验基础，使该生物复合材料成为骨再生领域的有力修复工具。
2.拟采取实验方法
本实验室引进3月龄健康纯种普通级新西兰大白兔42只，体质量2.0～2.5kg；6周龄幼年新西兰大白兔3只（恒牙根尖未闭合），雌雄不限，由济宁医学院实验动物中心分笼饲养。实验室常规定期消毒，温度维持20℃左右，相对湿度50%±2%，通风良好，按照标准进行饲养，并给予人道关怀。所有动物口腔黏膜颜色正常，牙齿无损坏，舌活动自如。所有操作均符合实验动物伦理学要求。
2.1 SCAP的分离培养
（1）动物处死与颌骨分离：选取3只6周龄幼年新西兰大白兔（恒牙根尖未闭合），耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠（100mg/kg），确认兔呼吸心跳停止后，快速取下颌骨。用手术刀剥离下颌骨表面肌肉及软组织，浸泡于含冰PBS的无菌培养皿中；
（2）根尖牙乳头组织分离：使用骨凿纵向劈开下颌骨，暴露未成熟第一恒磨牙，用显微镊（尖端直径≤0.1mm）轻柔夹取根尖牙乳头组织；
（3）酶消化法分离细胞：将组织转移至无菌培养皿，用含双抗的预冷PBS冲洗3次，去除血液和碎屑。用无菌眼科剪将组织剪切成1mm³碎块。加入5mL37℃预热的酶消化液，转移至15mL离心管。37℃恒温摇床以100rpm转速消化30分钟。加入等体积含10%FBS的α-MEM培养基，轻柔吹打混匀。用1mL移液枪反复吹打组织悬液10次，过40μm细胞筛。收集滤液至新离心管，在室温下1000rpm离心5分钟。若沉淀可见红色，加入1mL红细胞裂解液，室温静置5分钟，1000rpm离心5分钟，弃上清。
（4）原代细胞培养：沉淀用5mL完全培养基重悬，接种至25cm²细胞培养瓶，在37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中静置培养。48小时后弃去培养基（去除未贴壁细胞），加入5mL新鲜完全培养基。每3天换液一次，直至细胞融合度达80%-90%。
（5）细胞传代：吸除培养基，用PBS轻柔冲洗1次。加入2mL0.25%胰酶-EDTA，37℃孵育3分钟，在显微镜下确认细胞回缩。加入等体积含血清的培养基终止反应，移液管吹打形成单细胞悬液。1000rpm离心5分钟，弃上清，重悬后按1:2比例接种至新培养瓶。
取P3～P5代细胞进行后续实验。
2.2 SCAP鉴定
（1）流式细胞学检测细胞表面抗原：采用流式细胞术对SCAP表面抗原进行鉴定：细胞胰蛋白酶消化后用预冷的PBS漂洗；再用PBS制备浓度为1×106/ml的细胞悬液；将100μl细胞悬液加入EP管中，加入适量羊抗鼠抗体CD44、CD45、CD90，避光、于4℃环境中孵育1h；离心，200μlPBS重悬，上机。
（2）三系分化检测：SCAP向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞方向的特异诱导分化，在特定的条件培养基中诱导培养后分别进行特异性染色检测。
①成骨细胞诱导分化：取P4贴壁培养的SCAP，以2×105/cm2接种于24孔板中，待细胞达80%-90%融合后，在赛业公司成骨条件诱导培养基中诱导培养，每3d更换诱导培养液。诱导培养21d后,弃去原诱导培养液，PBS漂洗3次后，4%多聚甲醛固定10min，钙盐结节经经典的茜素红染色检测。诱导21d后，弃去上清液，PBS液洗2次；4%多聚甲醛固定10min，PBS洗2次；加入2%茜素红染液，常温（roomtemperature，RT），染色30min。
②成软骨分化：取P4贴壁SCAP，经海藻酸钠水凝胶包裹，制作成微球，在GIBCO成软骨条件诱导培养基中进行3D立体诱导培养，每3d更换诱导培养液。诱导21d后，弃去原诱导培养液，PBS漂洗3次后，4%多聚甲醛固定30min，石蜡包埋切片，脱蜡入水后，经阿利新蓝染色检测软骨特异的细胞外基质。切片在1%阿利新兰染液内染色30s；蒸馏水洗3min。
③成脂分化：取P4贴壁SCAP，接种于24孔板中，待细胞达80%-90%融合后，在GIBCO成脂条件诱导培养基中诱导培养，每3d更换诱导培养液。14d后，弃原诱导液，PBS漂洗3次后，4%多聚甲醛固定10min，诱导形成的脂滴，经油红O染色检测。诱导14d后，弃去上清液，PBS液洗2次；4%多聚甲醛固定10min，PBS洗2次；加入1%油红Ｏ染液，RT，染色10min。
常规脱水、透明、加拿大树脂封片。以上染色均通过普通光学显微镜下观察并拍照。
2.3 SCAP-Exo的提取
（1）收集SCAPP4-P7细胞上清液：细胞生长密度70%或90%左右时，PBS清洗后更换基础DMEM培养基，相当于血清饥饿24-48小时收集培养基。4℃短期保存，-30℃长期保存。
（2）将已收集的SCAP细胞上清液放置室温，复温。100kD超滤管装满MilliQ水放在4℃冰箱，Beckman离心机提前预冷至4℃。
（3）复温结束后分装上清液，50mL离心管不要超过体积2/3。十字配平放入离心机中。按照以下步骤进行超速离心，注意每次离心结束后转动离心管。离心后管侧壁可见白色沉淀。300g/10min/4℃，去除死细胞；2000g/10min/4℃，去除细胞碎片；1000g/30min/4℃，去除大分子囊泡。
（4）轻轻吸取上清液移入超滤管中，注意使用天平配平。离心，5000g/5min/4℃。反复离心（根据过滤管中的培养液体积逐渐缩短离心时间）。最后超滤管中培养基浓缩至1mL内。
（5）将培养基浓缩液移至1.5mLEP管中，加入0.5倍体积的外泌体提取液，涡旋器混匀。4℃过夜保存。
（6）第二天，预冷台式冷冻离心机。前一天的EP管与配平EP管放入离心机，设置13000g，60min，4℃。离心后可见白色沉淀。弃液，注意先轻轻倒掉大部分上清液，再用枪尖在沉淀侧的对面侧壁吸净上清液。
（7）无菌PBS清洗3次。80-100μLPBS溶解沉淀，轻轻吹打混匀，-20℃或-80℃保存。
2.4 SCAP-Exo的鉴定
（1）透射电子显微镜
取少量SCAP-Exo待测液滴加在铜网上，静置1min，继续滴加2%醋酸铀酰，静置30s。待样品干燥后，透射电子显微镜下观察形态。
（2）Western Blot
分为SCAP组和SCAP-Exo组，BCA测定蛋白浓度，置于100℃水浴锅内变性5min;配胶(10%SDS-PAGE),每泳道上样25μg蛋白，蛋白分离90min(电泳电压为120V),200mA条件下PVDF膜转膜120min,封闭1h后4℃孵育一抗CD9(1∶1000)、Alix(1∶1000)、Calnexin(1∶1000)过夜；洗膜后加入相应二抗(1∶10000),洗膜3次，化学发光试剂，成像并拍照。
2.5 GelMA水凝胶的制备与表征
（1）配制0.25%（w/v）引发剂标准溶液：首先，取20毫升PBS，加入装有引发剂LAP的棕色瓶中（内含0.05gLAP）。然后在40－50℃水浴箱中加热溶解15分钟，期间振荡数次。该LAP标准液在4℃避光条件下可保存12个月。
（2）配制GelMA溶液，GelMA浓度为7.5%（w/v）：首先，称取质量为7.5g的GelMA放入离心管，以锡箔纸包裹离心管避光。然后取引发剂标准溶液加入到上述离心管中，振荡使GelMA充分浸润。接着在60－70C水浴箱中避光加热溶解20－30分钟，期间振荡数次。将GelMA溶液立即用0.22um无菌针头过滤器灭菌（防止低温凝胶化）。最后，以405nm紫外线光源，照射15—30s使其光交联固化。
（3）GelMA水凝胶-Exo复合物的建立:将SCAP-Exo（50μg/mL）与GelMA预聚液混合，紫外光（365nm，5mW/cm²）交联20秒成胶。
（4）GelMA水凝胶结构表征:通过扫描电子显微镜（SEM）对GelMA水凝胶的微观结构进行观察分析。首先，取各组水凝胶进行冻干24h，然后将样品置入液氮中进行脆断处理；接着用导电胶将水凝胶样品固定，保持断面朝上进行真空喷金；最后，将水凝胶样品上机，在电镜下观察并拍照。采用核磁共振（Nuclearmagneticresonance，NMR）仪对样品GelMA水凝胶分别进行测试，分别得到1HNMR（400Ｈz）图谱。所用溶剂为氘代重水（D２O）。
（5）检测GelMA水凝胶的缓释性能：取96孔板，每孔加入100µL的实验组水凝胶，随后每孔加入150µL的PBS，置于摇床内振荡孵育(37℃，75r/min)，孵育6h、12h、18h、1d、4d、8d、12d、16d、20d、24d、28d后，每孔吸取100µL的PBS，离心后取上清液，检测吸光度值，计算外泌体累计释放率。每次取样后再充新鲜的等量PBS。每个实验重复3次。
2.6牙槽骨缺损动物模型建立与分组
（1）牙槽骨缺损动物模型建立
术前适应性饲养1周，禁食12h、禁水8h。经兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30mg/kg)，麻醉后将其仰卧位固定于动物实验台上，术区常规消毒铺巾，口内再次消毒，手指触摸到下颌体上缘黏膜最薄处，于第一磨牙近中龈缘前方约5mm与切牙远中龈缘后方约5mm之间用11号尖刀片切开黏骨膜。剥离子剥离暴露骨面，于第一磨牙与中切牙中间处，用口腔科种植手机(800r/min)配备直径2mm裂钻垂直制备约4mm×4mm×4mm骨缺损，边磨边生理盐水冲洗，间断磨除，磨至骨松质后用口腔科小刮尺刮至牙根面，生理盐水清洗创面，棉球压迫止血。无明显出血后，用1号线全层缝合切口。造模后在右侧臀大肌处肌注青霉素，40万U/次，2次/d，连续3d。造模后饲养条件同术前。观察并记录造模后动物精神、饮食、两便、活动及伤口愈合情况。
（2）分组
将42只牙槽骨缺损兔平均随机分成7组进行实验处理：第一组为空白对照组，第二组为PBS缓冲液组；第三组为GelMA水凝胶组；第四组为Exo组；第五组为GelMA水凝胶-Exo组；第六组为DKK1组；第七组为GelMA水凝胶-Exo+DKK1组。空白对照组仅进行牙槽骨缺损建模，未接受任何处理。
分别于造模后1、4、8、12周各组随机选取2只动物经耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠将其处死，完整取出双侧下颌骨体部，去软组织，观察标本局部成骨情况。
2.7体内实验
取第三、四、五组的实验动物，将制备好的GelMA水凝胶、含50µgSCAP-Exo的PBS缓冲液和载有50µgSCAP-Exo的水凝胶注入对应组别动物牙槽骨缺损处。前五组动物骨缺损处均轻覆盖e-PTFE膜保护缺损区。分层缝合创口。术后将动物置于37℃保温垫恢复，持续监测呼吸频率及角膜反射，直至完全清醒。连续3天皮下注射青霉素（5万单位/kg），预防手术部位感染。
2.8骨缺损修复效果评估
术后4、8、12周每组各处死2只动物，取出含缺损区的下颌骨，剔除软组织，生理盐水冲洗标本，4%多聚甲醛固定48小时。
（1）显微计算机断层扫描（Micro-CT)：
①每组动物的下颌骨标本用生理盐水漂洗去除表面残留的固定液，放置在专用载床（直径≤68mm），通过防脱逃罩固定，确保扫描过程中无位移。
②通过Micro-CT系统以18μm的分辨率进行扫描，配置0.5mm铝滤片减少硬化伪影，使用的是100kV/100µA的X射线源。
③使用3D Creator软件对下颌骨进行三维重建，在下颌骨体部避开牙根区域，选取1mm³立方体作为标准分析区域，通过使用VGStudio分析 骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）及骨密度（BMD）。
（2）组织学观察（HE染色）：
①将固定好的动物标本取出，用生理盐水冲洗3次（每次5分钟）去除残留固定液，用解剖刀修剪至厚度≤5mm的规则组织块。
②使用10% EDTA溶液（pH7.4）浸泡2-4周脱钙直至针刺无阻力，梯度乙醇脱水（70%→80%→90%→100%）后，纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ各处理1小时至组织呈半透明状。
③将组织块移入56-58℃石蜡中，分三次浸蜡，将熔化的石蜡倒入包埋模具，用预热的镊子将组织块按纵切面朝下放置，快速冷却后修整蜡块，确保切面与切片刀平行。使用旋转式切片机，调整切片厚度为5μm。
④脱蜡后用苏木精和伊红依次染色，脱水透明，中性树胶封片。
⑤镜下观察组织学变化，重点对比脱钙区与非脱钙区的骨小梁连续性、破骨细胞空泡率。
（3）抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）：
①固定与脱钙、脱水与石蜡包埋并切片操作同上，用pH6.0的0.01M柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，自然冷却至室温后PBS冲洗三次。
②配置含50mM酒石酸钠的酸性磷酸酶底物染色液，37℃避光孵育30-60分钟 ，显微镜下控制显色，苏木素复染细胞核。镜下观察组织学变化，骨小梁边缘或吸收陷窝内可见破骨细胞酒红色胞浆，细胞核呈浅蓝色。
（4）免疫组化染色：
①固定脱钙包埋切片并进行抗原修复，操作同上。3% H₂O₂室温避光孵育10分钟，PBS冲洗3次进行封闭。
②兔源一抗按1:200稀释，每张切片滴加50-100μl覆盖组织，4℃过夜孵育，次日室温平衡30分钟后PBS冲洗3次。HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗直接滴加，37℃湿盒避光孵育1小时（或室温2小时），PBS冲洗3次。
③镜下DAB显色液避光反应5分钟，苏木素复染细胞核，脱水透明，中性树脂封闭。镜下观察骨相关蛋白（Runx2/OCN/VEGF）阳性信号为棕褐色颗粒，定位于细胞质或细胞核，需排除非特异性染色（如血管内皮背景着色）。
④显微镜下随机选取5个非重叠视野，使用ImageJ软件计算阳性染色面积百分比，对比各组成骨相关蛋白表达差异。
2.9机制验证
Wnt/β-catenin信号通路是一种经典的Wnt信号通路，它在成骨细胞的分化、增殖过程中发挥着重要作用。已有研究显示SCAP-Exo可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进成骨分化，现设计实验来验证这一机制。
将100ng/ml DKK1、载有50µgSCAP-Exo的水凝胶+100ng/ml DKK1分别注入第六、七组动物牙槽骨缺损处，其他处理操作皆与前五组动物相同，且与前五组动物实验同期进行。
（1）Western Blot检测Wnt/β-catenin通路关键蛋白：
①取缺损区组织，液氮研磨后每100mg组织加入1ml裂解液，冰上超声破碎，离心（12,000g，4℃，15分钟）后取上清，BCA法测定蛋白浓度。
②每孔上样30μg蛋白，两侧预留预染蛋白Marker，10% SDS-PAGE电泳分离。
③将PVDF膜浸入甲醛10秒活化，膜缓冲液平衡5分钟，采用“三明治”结构，恒流200mA转膜1.5小时，5%脱脂牛奶封闭1小时。
④一抗β-catenin（1:1000, CST #8480）、p-GSK-3β（1:1000, CST #5558）4℃孵育过夜，TBST洗3次，二抗HRP标记羊抗兔（1:5000, CST #7074）室温孵育1小时。
⑤ECL显影，Image Lab软件分析条带灰度值。
（2）成骨分化标志物检测：通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）评估再生骨中RUNX2、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原蛋白（COL-1）和β-catenin的mRNA表达情况。
①取缺损处再生骨组织，液氮速冻后研磨成粉末。加入1mL TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific），转移至无RNA酶离心管中，室温静置5分钟，充分裂解细胞。
②RNA纯化：加入200 μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟。4℃、12,000 xg离心15分钟，吸取上层水相（约400 μL）至新离心管。加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀后静置10分钟，4℃、12,000 xg离心10分钟，弃上清。用75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀，离心5分钟后晾干，溶于20-50μL DEPC水。
③按照说明，使用逆转录试剂盒（中国上海联迈生物工程有限公司）生成互补DNA（cDNA）模板。接下来，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统上，采用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒（中国大连TaKaRa公司）通过PCR对cDNA模板进行定量分析。PCR条件为：95℃ 10秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒，共40个循环。引物序列如下：
Runx2 F:CAGCCACCGAGACCAACAG,R: TGGTGCAGAGTTCAGGGAG
OCN F:GGCGCTACCTGTATCAATGG,R: CTGGAGAGGAGCAGAACTGG
COL-1 F:CCTGGAAGAATGGAGATGATG,R: CAGTGGACAGTAGACGGAGG
β-catenin F:CGGACAGAGCAAGAGCAAGA,R: GCTGGTGCAAAGGCATTGTA
参照GAPDH，使用StepOne Software v2.3设定荧光阈值，采用2-ΔΔCt法测定RUNX2、OCN、COL-1和β-catenin的相对mRNA表达量，使用GraphPad Prism进行单因素方差分析（ANOVA），数据以均值±标准差表示（*p<0.05，**p<0.01）。
牙槽骨缺损是指上下颌骨包围着牙齿的部位出现了组织缺失。引发牙槽骨缺损的原因很复杂，牙齿的过早缺失、拔牙后未及时修复、根尖炎或根尖周炎内有得到及时治疗、外伤等，都可造成牙槽骨的缺损。在当前的临床实践中，对于牙槽骨缺失的治疗，自体髂骨松质骨游离移植手术已被广泛认可为一种成熟且效果显著的方法，但这种治疗手段涉及对供骨区的额外手术，从而带来了供骨区感染、骨折、意外穿透腹腔以及骨量不足等潜在风险［1］。并且对于一些需要种植修复的患者，缺牙位点牙槽骨的质量和体积会极大地影响种植体的植人位置和初始稳定性、软组织轮廓、义齿形态、红色美学及种植修复的长期成功率[2]。牙槽骨缺损严重影响患者的的身心健康，目前常规的治疗方法并不能恢复原本组织的生理功能，因此骨再生一直是口腔再生医学研究的热点[3]。
细胞是修复骨缺损的关键要素。2006年，学者Sonoyam等[4]从人未发育完全的磨牙根尖部分离出一种新的问充质细胞——根尖乳头干细胞(stem cells from apicalpapilla，SCAP)根尖乳头干细胞(StemCellsfromtheAp-icalPapilla，SCAPs)来自牙根未发育完全的根尖乳头组织[5],其具有良好的多向分化能力,在特定条件下可向成骨、成脂、成软骨、神经和成牙本质分化。外泌体是一种细胞释放的小囊泡,存在于骨髓间充质干细胞旁分泌物质中,能将其携带的mRNA、miRNAs和蛋白质转移到靶细胞中,从而调节细胞间的相关通路[6]。Zou等[7]研究发现,外泌体有助于组织的修复和再生,且间充质干细胞外泌体可促进腱骨愈合。并可通过传递其包含的miRNA参与调控多种疾病的发展进程,对细胞的成骨分化发挥促进作用［8-9］。
Wnt/β-catenin信号通路是一个关键的调控网络，它在胚胎发育过程中扮演着至关重要的角色，在成体尤其是哺乳动物体内，该通路对于维持组织稳态、抵抗疾病以及促进再生具有不可忽视的作用[10]。已有研究证实了人根尖牙乳头干细胞具有成牙/成骨、成脂的多向分化潜能。核因子I-C可激活人根尖牙乳头干细胞中Wnt/β-catenin信号通路，并经由该通路促进人根尖牙乳头干细胞的成骨/成牙分化[11]。成骨分化是通过成骨细胞的分化和活化,将原始的未成熟的细胞转化为骨细胞或骨组织,从而对恢复和重建牙槽骨发挥促进作用。ALP是BMSCs成骨分化早期的重要标志物,可有效反应BMSCs的早期成骨分化。OCN是成骨细胞在骨基质矿化过程中合成的非胶原蛋白,其可以反映骨活动和骨转换的情况。Runx2是一种特殊的转录因子,它能够增加OCN、骨唾液蛋白、I型胶原等与成骨有关的基因的表达,进而通过调控这些基因的表达促进BMSCs向成骨细胞的分化。
大量的研究已证实，外泌体具有促进成骨与血管化的作用，但是单纯的外泌体治疗存在靶向性差、负载分子含量无法达到治疗浓度等问题[12]。目前临床常用自体骨移植、同种异体骨移植与异种骨移植等修复方法，但每种方法都有其不足，因此，开发具有良好生物安全性、骨诱导性、骨传导性及骨形成作用的人工骨修复材料具有重要的临床意义。甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)是经化学改性的光敏性生物材料,具有适合的生物特性和物理特性,已经被广泛用于各种生物医学过程中,如组织再生、药物输送和作为组织粘合剂[13-14］。
本研究深入探究SCAP-Exo与GelMA水凝胶的协同作用机制，聚焦GelMA水凝胶如何通过物理包裹或化学作用保护外泌体活性分子（如miRNA、生长因子），以及SCAP-Exo如何调控水凝胶微环境（如细胞黏附因子表达），揭示二者互作促进骨修复的分子网络。探索SCAP-Exo通过Wnt/β-catenin通路促进成骨分化的新机制。研究将通过检测成骨细胞标志物（如RUNX2、OCN、COL-1和β-catenin）的mRNA表达情况，验证Wnt/β-catenin通路如何通过促进成骨细胞功能，加速缺损修复。
参考文献：
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1.创新点
（1）深入探究SCAP-Exo与GelMA水凝胶的协同作用机制，聚焦GelMA水凝胶如何通过物理包裹或化学作用保护外泌体活性分子（如miRNA、生长因子），以及SCAP-Exo如何调控水凝胶微环境（如细胞黏附因子表达），揭示二者互作促进骨修复的分子网络。
（2）发现SCAP-Exo通过Wnt/β-catenin通路促进成骨分化的新机制。研究将通过检测成骨细胞标志物（如RUNX2、OCN、COL-1和β-catenin）的mRNA表达情况，验证Wnt/β-catenin通路如何通过促进成骨细胞功能，加速缺损修复。
2.项目特色
（1）牙源性再生策略突破:规避干细胞移植风险，以牙源性分子精准促再生优于骨髓/脂肪来源外泌体;GelMA水凝胶兼具物理支撑与微环境调控功能，加速骨修复。
（2）高转化临床前研究:采用解剖结构与人类相似的新西兰大白兔牙槽骨缺损模型，结合 Micro-CT、免疫组化等多模态评估，为临床转化提供数据;通过检测炎症因子、成骨基因等，明确作用靶点，助力新型口腔修复材料开发。
1.技术路线

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2.拟解决的问题
1.传统骨移植材料（自体骨/异体骨）存在供区创伤、免疫排斥、感染风险等问题，而人工合成材料（如羟基磷灰石）机械性能不足且缺乏生物活性，难以实现血管化骨再生。本研究旨在开发兼具生物相容性、力学适配性和功能活性的非侵入性递送策略（GelMA水凝胶负载SCAP-Exo），提升患者依从性。
2.现有研究表明SCAP-Exo可能通过miRNA（如miR-126-5p、miR-150-5p）调控成骨相关信号通路（如HIF-1α/VEGFA、Wnt/β-catenin），但具体调控网络及其与GelMA的协同机制仍需深入解析。本研究通过检测成骨相关信号通路关键蛋白和成骨基因的变化进一步验证SCAP-Exo促进骨再生的机制。
3.为根尖周病变（如根尖周炎、根尖囊肿等）导致的牙槽骨或根尖周围骨质的破坏和缺失、糖尿病骨缺损、种植牙后的骨组织损伤（如骨吸收或骨缺损）等口腔临床难题提供新型治疗策略。
3.预期成果
1.完成SCAP-Exo的提取与表征，通过CCK-8实验验证其对BMSCs增殖的促进作用；通过茜素红染色初步证明SCAP-Exo的成骨诱导能力。
2.验证使用GelMA水凝胶负载SCAP-Exo应用于骨缺损修复治疗的可能性；验证核心通路Wnt/β-catenin，明确SCAP-Exo是否激活通路关键蛋白β-catenin。
3.设计可注射型水凝胶操作流程，为后续临床转化提供基础数据；整理数据形成校级课题结题报告，发表1-2篇高质量核心期刊论文。


1.2025年1月—2025年3月：查阅相关资料，确定研究方法，细化实验方案，完成动物伦理审批，准备实验材料，优化SCAP-Exo提取方法及GelMA水凝胶制备条件。
2.2025年3月—2025年9月：细胞分离培养，提取并鉴定外泌体，构建SCAP-Exo与GelMA水凝胶复合体，优化负载率与缓释曲线，进行体外实验，利用CCK-8、ALP活性测定、茜素红染色等，验证对成骨细胞增殖、分化及矿化的影响。
3.2025年9月—2026年3月：建立新西兰大白兔牙槽骨缺损模型，分组进行体内实验，术后取材，进行Micro-CT、HE、TRAP染色及免疫组化分析。
4.2026年3月—2026年6月：通过Micro-CT量化骨修复指标，HE、TRAP染色观察组织及破骨细胞活性，检测成骨标志物等，验证关键基因蛋白表达，进行统计分析。
5.2026年6月—2026年12月：撰写、发表论文，完成研究课题。
（1）SCAP-Exo的提取与功能验证
团队已掌握根尖牙乳头干细胞的分离、培养及外泌体提取技术，并通过透射电镜和Western blot鉴定了SCAP-Exo。
前期实验表明，SCAP-Exo可显著促进骨髓间充质干细胞的成牙本质分化，表现为RUNX2、OCN、COL-1和β-catenin的mRNA表达上调及矿化结节形成能力增强。
（2）GelMA水凝胶的制备与表征
团队已成功制备光交联GelMA水凝胶，并通过扫描电子显微镜、流变学分析和溶胀实验验证其三维多孔结构、力学性能及生物降解性。
初步实验证实，GelMA水凝胶可有效负载SCAP-Exo并实现缓释，且在体外实验中表现出良好的生物相容性。
（3）牙槽骨缺损修复的初步探索
团队已建立新西兰大白兔牙槽骨缺损模型，并通过Micro-CT和组织学染色(HE、Masson)评估了不同修复材料的效果，为本次实验提供了动物模型构建经验。
本研究依托济宁医学院公共科研平台进行研究，科研平台拥有分子生物学实验室、病理学实验室，激光共聚焦显微镜、荧光倒置显微镜、核酸及蛋白检测系统、凝胶成像图像分析系统、低温高速离心机、低温冰箱、冷库等各种先进的实验设施，以及动物房等，能够满足该实验的要求。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 15000.00 购置材料、耗材、论文出版 4000.00 11000.00
1. 业务费 5000.00 论文出版费 0.00 5000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 5000.00 发表核心论文 0.00 5000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 10000.00 购买动物，抗体，试剂盒，耗材 4000.00 6000.00
结束

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