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COX6A2通过调控ROS产生影响衰老进程中认知功能改变的机制研究

申报人：张鑫 申报日期：2025-03-20

基本情况

2025创新项目
COX6A2通过调控ROS产生影响衰老进程中认知功能改变的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
衰老是一个主要源于“氧化应激”的生物学过程，随着年龄的增加，认知功能显著下降。ROS可能在认知过程中充当潜在的信号分子，但是，氧化应激的增加可能导致衰老期间的认知障碍。衰老的哺乳动物的神经元线粒体中呼吸链酶复合物活性随年龄下降，特别是复合物 I和复合物 IV。COX6A2是线粒体复合物 IV的一个亚基，其缺失可以导致COX活性降低并增加线粒体中的ROS产生。COX6A2缺失的PV中间神经元中出现更高的DNA氧化损伤，COX6A2突变可能导致认知异常。 我们前期在24月龄的野生小鼠中发现COX6A2蛋白表达明显降低，提示COX6A2可能与衰老进程有一定关系。本研究通过验证COX6A2与衰老的相关性，探索COX6A2调节衰老进程中认知变化的机制，尝试建立一个完整的衰老调节通路，探索COX6A2作为延缓衰老的一个可能性线粒体靶点。
       负责人利用寒暑假期间，在本校精神卫生学院从事阿尔兹海默症相关基因的功能研究。目前已掌握相关阅读文献、数据分析工作。
       指导教师目前主持在研一项校级教师扶持项目，建立了比较完备的蛋白转运研究的技术平台，可保证本项目顺利实施，但该项目具体研究内容与申请人现申请的本项目无系。
指导教师已熟练掌握本项目所需要的各项技术，也具有相关的科研背景。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
张鑫 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 文献搜索、阅读、文章撰写
李丽然 精神卫生学院 精神医学（本科） 2023 文献搜索、阅读、路线整合、文章撰写
王佳乐 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 文献搜索、阅读、文章撰写
魏钰轩 精神卫生学院 精神医学（本科） 2024 文献搜索、阅读、文章撰写
温佳怡 精神卫生学院 精神医学（本科） 2022 文献搜索、阅读、文章撰写

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张晓红 精神卫生学院 否

立项依据

  衰老的哺乳动物大脑呼吸链酶复合物IV活性随年龄下降，但是衰老模型中COX6A2的变化及给与COX6A2干预能否延缓衰老进程及其作用机制仍不清楚。因此，明确衰老与COX6A2相关性，探索COX6A2通过调节ROS影响衰老进程的可能性及COX6A2调控衰老过程中相关表型的变化,为将来揭示衰老过程中基因表达调控的网络和通路，并且为衰老生物学的基础研究提供新的靶点和理论依据。

  为探索COX6A2通过调节ROS影响衰老进程的可能性，以及其调控衰老过程中相关表型变化，本研究将在衰老模型中验证COX6A2、ROS、突触数量以及树突标志蛋白表达变化，探究ROS对突触数量、树突标志蛋白的影响，同时在细胞模型中检验COX6A2调节ROS及树突标志蛋白簇密度变化。
1、验证衰老模型中COX6A2、ROS、突触数量以及树突标志蛋白Gephyrin表达变化
  ①准备8周C57BL/6J小鼠分为2组：正常对照组，不给以任何药物，正常饲养。衰老模型组，连续背部皮下注射D -半乳糖，制作小鼠衰老模型。使用水迷宫检测小鼠衰老模型的学习记忆能力。
  ②提取与分离小鼠脑组织，用Western blot方法检测COX6A2蛋白表达量以及树突标志蛋白Gephyrin和PSD95的簇密度，用荧光定量PCR的方法检测COX6A2-mRNA表达量。
  ③对完成动物实验的小鼠取全脑做冰冻切片，使用免疫荧光的方法检测ROS的变化，分别使用NeuN及PSD抗体进行免疫组化分析神经元及突触数量变化。
  ④设计靶向神经元的COX6A2过表达病毒载体，靶向病毒腹腔注射于衰老小鼠模型，使衰老动物模型中海马区神经元过表达COX6A2。使用水迷宫检测小鼠衰老模型的学习记忆功能。检测COX6A2表达、ROS产生及突触数量、树突标志蛋白Gephyrin和PSD95的簇密度。
2、ROS能够影响突触数量和树突标志蛋白的水平
  ① 使用H2O2处理SH-SY5Y细胞 30 min，分别使用免疫印迹的方法检测Gephyrin 和PSD95表达水平，使用ROS试剂盒检测ROS产生量，确认ROS途径能影响突触修饰。
  ② 使用ROS抑制剂预处理SH-SY5Y细胞，然后使用H2O2处理SH-SY5Y细胞 30 min，使用ROS试剂盒检测ROS产生量，使用SOD试剂盒检测SOD水平，分别使用免疫印迹的方法检测Gephyrin 和PSD95表达水平，通过荧光显微镜观察分别检测Gephyrin 和PSD95表达水平，在细胞中的表达量及定位变化，进一步确认ROS能够影响突触修饰。
3、COX6A2对ROS产生及突触数量、树突标志蛋白的影响
  ① 使用不同浓度D-半乳糖（10、20、30 g/L）分别处理神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞不同时间（12、24、48 h），使用β-半乳糖苷酶染色观察阳性细胞的数量，使用免疫印迹的方法检测p53表达水平，确定使用D-半乳糖建立SH-SY5Y细胞衰老模型的最适浓度和最适作用时间。
  ② 建立D-半乳糖SH-SY5Y细胞衰老模型，使用ROS试剂盒检测ROS产生量，使用SOD试剂盒检测SOD水平，确定衰老过程中会产生ROS。
  ③ 构建COX6A2过表达质粒，设计COX6A2-siRNA，分别转染培养的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞，用D-半乳糖处理，使用ROS试剂盒检测ROS产生量，使用SOD试剂盒检测SOD水平，使用免疫印迹的方法检测分别Gephyrin 和PSD95表达水平，通过荧光显微镜观察分别检测Gephyrin 和PSD95表达水平，在细胞中的表达量及定位变化。 
  衰老是一个生物学过程，生理能力普遍进行性下降，影响许多组织功能，对认知功能有显着的影响。随着年龄的增长，信息处理的许多方面包括处理速度、工作记忆容量、抑制功能和长期记忆效率降低。研究证明，从青年时期开始，处理速度、工作记忆和长期记忆的认知机制随着年龄的增长而逐渐下降。只有语言能力因为是知识的累积而不是一种认知机制，才能免受年龄差异的影响。
  衰老和退行性疾病主要源于“氧化应激”1，即活性氧 (ROS) 水平的增加，主要是超氧自由基阴离子、过氧化氢和细胞中的高活性羟基自由基。ROS可能在认知过程中充当潜在的信号分子，有报道证明ROS在涉及信号转导、突触可塑性和记忆形成的分子过程中是必需的2。但是，氧化应激的增加可能导致衰老期间的认知障碍3。细胞的不同部位均能产生ROS，线粒体与这个过程最密切，被认为是活性氧（ROS）的主要细胞内来源，也是活性氧氧化攻击的主要目标。
  线粒体功能障碍是导致与衰老相关的脑组织改变的主要因素4-5。随着衰老，累积的自由基会导致脑线粒体膜成分的显着损害以及随后的线粒体功能障碍。鉴于大脑的高能量需求，大脑呼吸链酶复合物活性随着衰老而下降可能对大脑功能以及与年龄相关的神经退行性疾病的病因和进展产生重大影响4。
  衰老的哺乳动物大脑氧化磷酸化产生 ATP 的能力降低，并且在老年人的生理条件下变得有限。线粒体呼吸链复合物 I-IV是 ATP 产生过程中的关键成分，因此这些酶在引发脑衰老中的线粒体衰变和氧化损伤方面特别重要。几项研究表明，大脑呼吸链酶复合物活性随年龄下降,特别是复合物I和复合物IV4-6。
  哺乳动物线粒体复合物 IV细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase, COX）复合物由 13 个不同的多肽亚基组成，分别由核基因组和线粒体基因组编码。线粒体编码的 COX1和 COX2形成参与电子转移的氧化还原位点，与线粒体编码的COX3亚基一起构成了COX保守的结构核心。其余十个亚基由核 DNA 编码，是全酶组装和稳定性所必需的，并且在调节其活动中起作用7-9。亚基COX6A在COX组装的晚期阶段与复合物结合，参与稳定COX的二聚体状态，有助于形成COX的相互作用位点。COX6A 有两种同工型：COX6A1 和COX6A2，由不同的基因编码并分布在不同的组织中。COX6A2蛋白主要在心脏和骨骼肌中表达，也在一些中间神经元中表达，调节COX的组装和催化活性。COX6A2缺失可以导致COX活性降低增加线粒体中的ROS产生10。COX6A2缺失的PV中间神经元中出现更高的DNA氧化损伤，COX6A2突变可能导致认知异常11。此外，在分析阿尔茨海默病高风险谱系的序列数据检测中发现，COX6A2突变（c.34T>G）不存在于长寿队列中12。这说明COX6A2与ROS、认知及长寿相关，但是尚没有研究证明衰老过程中COX6A2的相关作用。
  前期的预实验结果发现，COX6A2在小鼠的皮层和海马中均有表达，且表达呈现年龄差异性，这说明COX6A2可能通过影响ROS的产生影响衰老过程的认知水平，我们希望描述COX6A2与衰老的相关性，探索COX6A2调节衰老进程中认知变化的机制，尝试建立一个完整的衰老调节通路，探索COX6A2作为延缓衰老的一个可能性线粒体靶点。
【1】Kadenbach, B., Ramzan, R., Vogt S. Degenerative diseases, oxidative stress and cytochrome c oxidase function. Trends Mol. Med. (2009), 15:139-147
【2】Kishida, K.T., Klann, E. Sources and targets of reactive oxygen species in synaptic plasticity and memory. Antioxid. Redox Signal. (2007) 9:233–244
【3】Dröge, W., Schipper, H. M. Oxidative stress and aberrant signaling in aging and cognitive decline, Aging Cell. (2007) 6: 361–370
【4】Boveris, A., Navarro, A. Brain mitochondrial dysfunction in aging. IUBMB. Life. (2008) 60:308–14
【5】Chakrabarti, S., Munshi, S., Banerjee, K., Thakurta, I.G., Sinha, M., Bagh, M.B. Mitochondrial dysfunction during brain aging: role of oxidative stress and modulation by antioxidant supplementation. Aging Dis. (2011) 2:242–256
【6】Cocco, T., Sgobbo, P., Clemente, M., Lopriore, B., Grattagliano, I., Di Paola, M., Villani, G. Tissue-specific changes of mitochondrial functions in aged rats: effect of a long-term dietary treatment with N-acetylcysteine. Free Rad. Biol. Med. (2005) 38:796–805
【7】Huttemann, M.等, Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J. Bioenerg. Biomembr. (2008) 40: 445–456
【8】Fontanesi, F., Soto, I. C. and Barrientos, A. Cytochrome c oxidase biogenesis: new levels of regulation. IUBMB. Life. (2008) 60: 557–568
【9】Helling, S., Vogt, S., Rhiel, A., Ramzan, R., Wen, L., Marcus, K. and Kadenbach, B. Phosphorylation and kinetics of mammalian cytochrome c oxidase. Mol. Cell. Proteomics. (2008) 7: 1714–1724
【10】Quintens, R., Singh, S.等, Mice deficient in the respiratory chain gene Cox6a2 are protected against high-fat diet-induced obesity and insulin resistance. PLoS ONE. (2013) 8: e56719
【11】Sanz-Morello, B.等,Complex IV subunit isoform COX6A2 protects fast-spiking interneurons from oxidative stress and supports their function. EMBO. J. (2020) 39: e105759
【12】Teerlink, C. C.等, Alzheimer's Disease Genetics Consortium; Cannon-Albright, L. A., Kauwe, J. S. K. Analysis of high-risk pedigrees identifies 11 candidate variants for Alzheimer's disease. (2022) 18:307-317 
1、项目特色
  本项目将明确衰老导致COX6A2发生变化，COX6A2能够通过调节ROS的变化干预衰老进程中认知的变化，尝试建立一个COX6A2影响衰老的调节通路。
2、创新点
  深度揭示COX6A2与衰老的关联：目前虽有研究提示COX6A2与ROS、认知及长寿存在一定联系，但COX6A2在衰老进程中的具体作用机制仍不明晰。本项目将系统探究衰老与COX6A2的相关性，通过多种实验模型和技术手段，精准剖析衰老过程中COX6A2的表达变化规律及其对细胞和机体功能的影响，为深入理解衰老机制提供关键线索。
  探索COX6A2影响认知功能的独特机制：认知功能衰退是衰老过程中的重要特征，本项目创新性地从COX6A2调节ROS产生的角度，深入挖掘其影响衰老进程中认知变化的分子机制。关注COX6A2对线粒体ROS水平的调控。 
技术路线：summernote-img
拟解决问题：
1. COX6A2在衰老模型中的变化及作用机制不明：衰老的哺乳动物大脑呼吸链酶复合物IV活性随年龄下降，目前不清楚衰老模型中COX6A2的表达、活性等方面会发生怎样的具体变化。而且，给予COX6A2干预后，是否能够延缓衰老进程也不明确，其延缓衰老进程的分子生物学机制、细胞生物学机制更是有待探索。这需要从基因表达、蛋白水平、细胞功能以及整体动物模型等多个层面进行研究，明确COX6A2与衰老进程中各种生理变化之间的内在联系。
2. ROS在认知功能障碍中的作用不明：虽然已知ROS在衰老过程中可能对认知障碍有一定的影响，通过ROS对突触数量及树突标志蛋白产生的影响实验。可以明确ROS与认知功能的关联，为COX6A2作用机制提供部分中间环节，验证氧化应激理论在认知功能中的作用。
预期研究结果：
① 学术成果：项目完成后，预计能明确COX6A2在衰老进程中的作用机制，证实其可通过COX6A2 - ROS通路调节衰老进程中认知功能。
② 社会效益：研究成果有助于人们深入了解衰老和认知功能衰退的机制，为开发预防和治疗认知障碍相关疾病（如阿尔茨海默病）的新方法提供理论依据，对提高老年人生活质量、减轻社会医疗负担具有重要意义。
③ 经济效益：明确通过COX6A2 - ROS通路可调节衰老进程中认知功能，可为COX6A2相关靶向药的研究提供方向，若转化成功，将形成新的产业增长点，带来可观的经济效益 。 
本项目拟用2年时间完成（2025年6月至2027年6月）
2025.06-2026.05：使用衰老小鼠模型以及靶向神经元的COX6A2干预，开展衰老小鼠模型组织形态变化及行为学变化分析，观察衰老进程中COX6A2表达水平、ROS以及突触数量和树突标志蛋白簇密度的变化。初步分析衰老与COX6A2相关性，探索COX6A2通过调节ROS影响衰老进程的可能性和COX6A2调控衰老过程中相关表型变化。

2026.06-2026.12：在上一年度工作基础上，进一步验证衰老模型中COX6A2、ROS以及树突标志蛋白表达变化和检验COX6A2对ROS产生及突触数量、树突标志蛋白的影响，明确衰老与COX6A2相关性。

2027.01-2027.06：延续上一年工作，基于实验定位分析与实验结果数据分析，建立一个完整的衰老进程认知障碍调节通路，评估该通路的准确性。开展通路和相关实验的分析整理，撰写论文和投递论文。 
1．与本项目有关的研究积累和已获取的成绩
  本项目组通过蛋白免疫印迹（Western Blot）技术，系统检测了小鼠血清、大脑皮层及其他组织中的COX6A2蛋白表达水平。实验结果表明，COX6A2在小鼠的多种组织中均有表达，提示其在生理过程中可能具有广泛的功能。进一步的研究发现，COX6A2可能通过调控活性氧（ROS）的产生，影响衰老过程中的认知功能。具体而言，COX6A2作为线粒体呼吸链复合体IV（细胞色素c氧化酶）的一个亚基，其表达水平与线粒体功能密切相关。研究表明，COX6A2的缺陷会导致复合体IV的酶活性中度降低，进而影响线粒体的电子传递链功能，导致ROS的产生增加。ROS是细胞代谢过程中产生的一类具有高度反应性的分子，其水平的升高会对细胞造成氧化应激损伤，影响蛋白质、脂质和DNA的稳定性。在衰老过程中，ROS的积累与多种神经退行性疾病的发生密切相关。项目组发现，COX6A2的表达水平与ROS的产生呈负相关，提示COX6A2可能通过调控ROS的生成，影响细胞的氧化还原平衡，从而在衰老过程中发挥保护作用。此外，ROS水平的升高还可能通过反馈机制进一步抑制COX6A2的表达和活性，形成恶性循环，加剧衰老相关的认知功能下降。综上所述，COX6A2通过调控ROS的产生，可能在衰老过程中对认知功能起到重要的保护作用。
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图 1 COX6A2基因在2月龄组和24月龄组中的相对表达水平
  项目组研究小鼠海马中COX6A2表达变化情况 Western blot检测发现，COX6A2蛋白在2个月及24个月的小鼠含量不同，由图可知1、2、3组小鼠随着身体衰老其体内COX6A2的含量均下降。
团队成员情况：团队成员都是济宁医学院本科学生，目前已基本具备实验能力以及整合、分析、处理实验数据的能力，并且学习态度端正、认真刻苦、做事踏实。
团队指导老师情况：张晓红老师已熟练掌握本项目所需要的各项技术，也具有相关的科研背景。此外指导老师目前主持在研一项校级教师扶持项目，建立了比较完备的蛋白转运研究的技术平台，可保证本项目顺利实施。
尚缺少的条件：目前，针对干扰动物模型中COX6A2基因表达的靶向病毒载体尚未完成构。
解决办法：在此项研究中，项目组成员通过积极翻阅资料来加深对基础医学和生物医学的理解，选择合适的基因干扰方式或病毒载体并进行研究设计。本项目组成员将全面大量查阅有关COX6A2与ROS研究相关方面的文献，以此来解决载体构建及数据处理的问题。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 9300.00 10700.00
1. 业务费 12000.00 无 5100.00 6900.00
（1）计算、分析、测试费 5000.00 数据处理、样品测试等 2000.00 3000.00
（2）能源动力费 1000.00 实验设备用电等 600.00 400.00
（3）会议、差旅费 3000.00 参加相关研讨会议、调研的交通住宿等 1800.00 1200.00
（4）文献检索费 1000.00 用于专业数据库搜索 700.00 300.00
（5）论文出版费 2000.00 发表研究成果 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 3000.00 购买项目所需小型仪器设备 1200.00 1800.00
3. 实验装置试制费 2000.00 制作简易实验装置 1200.00 800.00
4. 材料费 3000.00 采购实验及项目开展所需材料 1800.00 1200.00
结束

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