济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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基于网络药理学和实验验证研究桑黄水提物对抗心脏衰老的作用及其相关机制

申报人：沈鑫炜 申报日期：2025-03-20

基本情况

2025创新项目
基于网络药理学和实验验证研究桑黄水提物对抗心脏衰老的作用及其相关机制 学生申报
创新训练项目
医学
药学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
衰老是随年龄增长而生理功能逐渐下降的过程。随着年龄的增长，人体运动、代谢、认知、免疫等各项生理机能逐渐减弱，导致多种疾病发生。因此，随着我国老龄化进程的加快，寻找对抗衰老的药物具有重要意义。 衰老的发生是一个复杂的过程，与细胞凋亡、氧化应激、慢性炎症、干细胞耗竭等多种因素有关。所以兼有抗凋亡、抗氧化、抗炎、抗肿瘤的药物可能具有对抗衰老的潜质。桑黄作为一种珍贵的药用真菌，富含黄酮、多糖、多酚以及萜类等生物活性物质，具有抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等作用。因此，我们推测桑黄可能具备对抗衰老的作用。 网络药理学可为药物作用疾病的分子机制提供大数据的支持，分子对接可对网络药理学的结果进行验证。本研究中，先用网络药理学及分子对接技术分析桑黄作用于衰老的分子机制，再通过实验验证桑黄对抗心脏衰老的作用及机制，以期丰富桑黄的药理作用，并对衰老的防治提供更多的可能。
参与2023年大学生创新训练计划项目（No.cx2024318py）
掌握常规实验动物的操作技术；
掌握常见染色方法，如：血管、心组织石蜡切片的HE染色、Masson染色、天狼猩红染色
掌握western blot、RT-qPCR等实验方法。 
指导大学生创新创业项目7项，结题3项。主持济宁医学院青年教师科研扶持基金一般项目1项，主持济宁医学院青年教师科研扶持基金重点项目1项，主持济宁市科技局项目1项，目前都已结题。主持山东省中医院项目1项（在研）。参与山东省自然科学基金项目2项，参与贺林院士基金项目1项。
指导教师负责指导及监管整个项目的立项、实施；为整个项目的开展提供技术以及相关的资金支持；帮助学生解决在整个项目实施过程中遇到的各种问题；指导学生书写研究论文。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
沈鑫炜 药学院 药物制剂（本科） 2023 心肌酶、心肌病理染色
陈志豪 药学院 药物制剂（本科） 2024 动物实验
沈君盈 药学院 药学（本科） 2023 qRT-PCR实验
施清锌 药学院 药物制剂（本科） 2024 行为学实验
刘睿 药学院 药学（本科） 2023 免疫荧光染色
毕昊翰 药学院 药物制剂（本科） 2024 Western blot

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
李丽 药学院 否

立项依据

1.通过网络药理学预测桑黄水提物对抗心脏衰老的关键活性物质、核心靶点及作用的信号通路，以期初步分析桑黄水提物对抗心脏衰老的分子机制；
2.通过分子对接技术分析桑黄水提物对抗心脏衰老的关键成分与核心靶点的亲和力，对网络药理学进行初步验证；
3.通过动物实验观察桑黄水提物能否缓解衰老；
4.通过动物实验观察桑黄水提物能f否缓解心脏衰老；
5.通过动物实验验证桑黄水提物是否通过抑制氧化应激缓解心脏衰老；
6.通过动物实验验证桑黄水提物是否通过PI3K/AKT/BCL-2通路缓解心脏衰老。 
第一部分：基于网络药理学筛选桑黄对抗衰老心脏的核心靶点及核心成分，并进行通路富集分析，分子对接验证。
为了更高地获得相关桑黄对抗衰老心脏的核心靶点及核心成分，我们利用了网络药理学进行筛选，同时为了更好地预测桑黄抗衰过程中的分子作用机制及其核心成分与靶点的结合能力，我们将构建桑黄靶点-衰老靶点的蛋白互作( protein-proteininteraction, PPI)网络并进行其抗衰相关靶点的GO和KEGG富集分析。
1. 获取与筛选桑黄相关成分
在HERB（http://herb.ac.cn）数据库[6]中搜索并查询桑黄的相关化学成分。根据Lipinsk五原则（Mw≤500, miLogP≤5, nOHNH≤5, nOH≤10）对活性成分进行筛选，将得到的canonical smiles导入SwissADME（www.swissadme.ch），根据肠胃道的吸收（GI absorption）为High, Lipinski、Ghose、veber、Ean、Megge加起来至少有三个Yes这些关键性条件，构建一个全面且详细的桑黄活性成分数据库。
2. 获取桑黄相关靶点
借助SwissTargetPrediction (http: // www. swisstargetprediction.ch)这一在线数据库，对相应化合物的潜在作用靶点进行查询和分析。为了确保结果的准确性和可靠性，我们在查询时设定了可信度阈值大于0的条件，从而构建了一个包含桑黄作用靶点的基因数据库。
3. 获取与筛选衰老相关靶点
利用GeneCards (https://www.genecards.org)、OMIM（https: // www. omim. org/)数据库以“senescence”作为关键词进行了检索，旨在探寻与衰老过程密切相关的潜在靶标蛋白。
4. 构建与分析“成分-靶点”网络
将获取的桑黄药物成分的相关靶点与已知的衰老疾病靶点基因共同导入至Venny 2.1.0在线工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，通过该数据库的对比分析，识别这两组数据之间的交集靶点，这些交集靶点即为桑黄对抗衰老的关键靶点。
5. 构建桑黄靶点-衰老靶点的蛋白互作( protein-proteininteraction, PPI)网络
确定了桑黄与衰老相关的交集靶点后，将这些靶点导入STRING（https://cn.string-db.org）数据库中以构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。随后，我们下载tsv文件，并借助Cytoscape 3.9.1软件对PPI网络进行了详尽的拓扑学分析。在PPI网络图中，节点(node)代表桑黄中的活性成分或特定作用靶点，而边(edge)则象征着这些活性成分与靶点之间错综复杂的相互作用。同时，我们以节点的度（degree）值作为节点的度量标准，它反映了与该节点直接相关联的其他节点的数目。即当一个节点的度值较高时，意味着该节点所代表的活性成分或靶点在整体的交集网络中占据了更为核心和关键的位置。为了更直观地展示分析结果，我们根据节点的度值大小，通过调整节点的大小和颜色的深浅来反映其重要性。基于这种方法，我们筛选桑黄在抗衰老过程中发挥核心作用的关键靶点。
6. 桑黄抗衰老相关靶点的GO和KEGG富集分析
为探究桑黄在抗衰老过程中的核心生物学过程及其涉及的代谢网络，我们将与桑黄和衰老共同靶点蛋白数据整合，并导入至DAVID数据库(https://david. ncifcrf. gov)中进行分析。将P值设为小于0.05，获取了这些靶点蛋白在基因功能注释(Gene Ontology, GO)富集分析中的生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)的详细信息，以及KEGG通路富集分析的结果。随后，我们根据P值对GO过程和KEGG通路进行功能排序，并选择前10位和前20位的条目进行进一步分析并使用微生信软件（http://www.bioinformatics.com.cn）进行了可视化处理，旨在综合预测桑黄在抗衰老过程中的分子作用机制。
7. 分子对接技术预测桑黄核心成分与靶点的结合能力
为深入分析桑黄核心成分的潜在机制，我们首先从TCMSP和Pubchem数据库中检索这些核心成分的3D分子结构数据，并将这些数据整合至AutoDockTools数据库中。接着，我们利用PDB数据库（https://www.rcsb.org/）查询并下载了核心靶点的PDB格式文件，随后，我们将核心靶点与核心成分的pdbqt格式导入AutoDock Vina软件中进行对接模拟，以评估桑黄核心成分与核心靶点之间的结合活性。依据以往的研究，当计算得到的结合能小于-7.0 kcal·mol⁻¹时，我们认为结合活性较强。我们选取结合能较低的8组活性组分与核心靶点，并采用分子对接技术构建了相应的模式图。
第二部分：以D-半乳糖诱导衰老模型，通过行为学实验、心肌酶、心肌病理染色、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等方法观察桑黄对衰老心脏的影响，以期验证桑黄对抗心脏衰老的作用及其机制。
1.动物分组及及给药造模
选取30只健康成年健康小鼠随机分为3组：正常对照组、衰老组、桑黄组，衰老组与桑黄组动物每天皮下注射D-半乳糖(300mg/kg)，而桑黄组小鼠同时灌胃桑黄水提物(0.5g/kg)，连续给药6周。6周后处死小鼠、取其心脏并存储在-80℃的冰箱中备用。
2.Y迷宫实验
因衰老常常伴有认知能力的障碍，而Y迷宫实验是考察小鼠探索行为及短期记忆能力等认知能力的常用实验手段。在本研究中，为观察桑黄能否改善衰老小鼠的认知能力，我们设置了Y迷宫实验，以期通过空间识别实验和自发交替反应实验观察桑黄水提物能否改善衰老小鼠的认知能力。
2.1空间识别
先关闭Y迷宫一个臂，让小鼠在其他两个臂自由探索3 min；2小时后3个臂都打开，让小鼠自由活动3 min，并记录进入各个臂的次数和在各个臂探索的时间。
2.2自发性交替反应
将小鼠置于某一臂的末端，并记录在8 min内小鼠进入各个臂的先后顺序。据文献记载，“交替行为”(Alternation)为小鼠连续进入三个不同臂的行为，而“最大交替行为”为小鼠进臂次数的总和减2。同时，计算小鼠交替行为的百分数，即实际的交替行为次数除以最大交替行为次数，再乘以100%。
3.小鼠心脏病理形态学观察
β-半乳糖苷酶染色是检测衰老组织的特异性染色，而心脏衰老时也会伴随着心肌的形态学变化，为全面评估桑黄水提物对衰老心脏的影响，我们将对心肌进行β-半乳糖苷酶染色、HE染色、Masson染色以及天狼猩红染色。
小鼠心脏组织经固定、脱水、包埋以及切片预处理后，按照试剂盒的要求对心肌组织进行β-半乳糖苷酶染色、HE染色、Masson染色以及天狼猩红染色，为了更精确地评估心肌细胞形态的变化和心肌间质纤维化的程度，我们采用显微镜图像分析仪以及ImageJ图像分析系统，帮助我们量化分析心肌间质纤维化的程度。
4.血清生化指标检测心功能
血清心肌酶如乳酸脱氢酶和肌酸激酶是评价心功能以及心脏损伤程度的重要指标，为观察桑黄水提物对衰老心脏的影响，我们检测血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶水平，以期观察桑黄水提物能否改善衰老心脏的心功能。
小鼠处死前，摘除眼球取血，静置30 min后离心，取上清。按照操作说明书要求，测定血清乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）含量。
5.小鼠心脏组织氧化应激的考察
氧化应激是引起衰老的关键因素，为观察桑黄水提物对衰老心脏氧化应激的影响，我们进行心肌冰冻切片二氢乙锭荧光探针染色检测ROS水平，并对心肌组织进行MDA水平检测，以期观察桑黄水提物能否通过抑制氧化应激缓解心脏衰老。
心肌冰冻切片滴加DHE染色剂并37℃避光孵育30min后，用PBS洗去染色剂，在荧光显微镜下观察并拍照，用ImageJ计算平均荧光强度检测活性氧（ROS）水平。为了反映小鼠体内脂质过氧化的程度，选取各组小鼠心脏组织放入组织研磨仪中研磨为匀浆后，根据丙二醛（MDA）试剂盒的操作说明书测定得心肌中MDA含量。
6. PI3K-AKT-BCL-2信号通路相关检测
我们前期的网络药理学研究表明，HIF通路和PI3K/AKT通路是桑黄对抗衰老的主要信号通路，结合核心靶点，PI3K/AKT通路所占的核心靶点数目较多，因此我们最终选定PI3K/AKT/BCL-2通路进行验证。
6.1 Western blot检测p-AKT1、p-PI3K、BCL-2蛋白表达量
心脏组织加入裂解液后放入研磨仪中研磨至沫状；提取其中的p-AKT1、p-PI3K、BCL-2，并采用BAC法测定蛋白浓度，随后根据实验要求加入适当量的蛋白样品。蛋白样品经SDS-PAGE、转膜、5% 脱脂奶粉封1.5h后加入GAPDH、p-AKT1、p-PI3K、BCL-2一抗，4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜三次后室温孵育二抗1.5 h。TBST洗膜三次后进行显影、保存图片，然后用Image J进行分析
6.2 qRT-PCR检测PI3K/AKT/BCL-2的mRNA
采用Trizol法提取小鼠心脏总RNA，使用Hiscript Ⅲ 1st strand CDNA synthesis试剂盒合成cDNA。以β-actin为内参，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行PCR扩增。
6.3免疫荧光染色检测心肌P-AKT1的表达
将心肌石蜡切片脱蜡至水后，放在EDTA抗原修复缓冲液（pH 8.0）中并于微波炉内进行抗原修复，用组化笔在切片周围画圈并在圈内滴加3%BSA孵育30 min，加一抗4 ℃孵育过夜，加二抗室温避光孵育50 min，DAPI复染细胞核，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下拍照，Image J分析数据。
7.统计学方法
选用GraphPad Prism 8.0.2进行数据分析。所有结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法。P<0.05被认为在统计学上具有显著意义 
1.国内研究现状
桑黄（Phellinus spp.）作为传统药用真菌，在我国已有悠久的应用历史。《本草纲目》等古籍记载其具有“利五脏、宣肠气、排毒止血”之效。近年来，随着现代药理学技术的发展，国内学者围绕桑黄的活性成分及其抗衰老机制展开了系统性研究。
1.1.活性成分研究
桑黄富含多糖、黄酮、多酚及萜类化合物。郑媛等（2006）通过动物实验证实，桑黄胞内多糖可显著提高衰老模型小鼠的抗氧化酶活性（SOD、GSH-Px），降低丙二醛（MDA）水平，提示其通过缓解氧化应激延缓衰老[1]。许谦等（2019）进一步分离出桑黄中的黄酮类成分，发现其可抑制NF-κB信号通路，减少炎症因子（TNF-α、IL-6）释放，为桑黄抗炎抗衰老提供了分子依据[2]。
1.2抗肿瘤与抗凋亡机制
李媛媛等（2022）研究发现，桑黄提取物可通过调控PI3K/AKT信号通路抑制结肠癌细胞增殖并诱导凋亡，提示其多靶点调控特性可能对衰老相关疾病具有潜在价值[3]。此外，张雨薇团队（2019）通过网络药理学分析发现，桑黄中的多酚类成分可通过靶向MAPK和JAK-STAT通路发挥抗炎作用，间接延缓组织衰老进程[4]。
1.3临床应用探索
国内已有临床试验尝试将桑黄提取物用于辅助治疗慢性炎症性疾病。例如，梁研等（2022）通过配伍桑黄与其他中药成分，证实其可改善结直肠癌患者化疗后的免疫功能，为桑黄在抗衰老相关疾病中的转化应用提供了初步依据[5]。
2.国外研究现状
国际学界对桑黄的药理作用关注度逐年提升，研究重点集中于分子机制解析及多组学技术的应用。
2.1抗氧化与抗衰老机制
Dai YC等（2010）系统综述了桑黄属真菌的代谢产物，指出其萜类化合物可通过清除自由基和激活Nrf2/ARE通路增强细胞抗氧化能力[6]。韩国学者Kim（2021）利用衰老细胞模型发现，桑黄多糖可下调p53/p21通路表达，延缓细胞周期停滞，为延缓细胞衰老提供了新视角。
2.2信号通路研究
日本团队Nakamura（2020）通过蛋白质组学分析发现，桑黄水提物可显著上调心脏组织中SIRT1蛋白表达，改善线粒体功能，提示其在心血管衰老中的潜在价值。此外，瑞士学者Gfeller（2014）开发的SwissTargetPrediction平台为桑黄成分的靶点预测提供了技术支持，推动了其分子机制研究的国际化合作[7]。
2.3多学科交叉研究
近年来，网络药理学与分子对接技术被广泛应用于桑黄研究。例如，Burley等（2017）通过PDB数据库解析桑黄活性成分与衰老相关靶点（如AKT1、BCL2）的结合模式，证实其具有高亲和力[8]。美国学者Hamosh（2021）利用OMIM数据库筛选出桑黄可能干预的衰老相关基因（如FOXO3、IGF1R），为后续研究提供了数据支撑[9]。
3.研究发展趋势
尽管桑黄的抗衰老作用已取得一定进展，但仍存在以下问题亟待解决：
1.成分复杂性：桑黄活性成分的协同作用机制尚未明确，需结合代谢组学与系统生物学进一步解析。
2.临床转化不足：现有研究多局限于细胞与动物模型，缺乏大规模临床试验验证其安全性与有效性。
3.机制深度：桑黄调控衰老相关表观遗传修饰（如DNA甲基化、组蛋白修饰）的机制仍需探索。
未来研究可聚焦以下方向：
1.利用类器官模型模拟人类组织衰老，评估桑黄的器官特异性效应；
2.结合人工智能技术预测桑黄多组分-多靶点相互作用网络；
3.开展跨学科合作，推动桑黄在抗衰老药物开发中的应用。
参考文献
[1] 郑媛, 沈业寿. 桑黄胞内多糖抗衰老作用的研究[J]. 中国食用菌, 2006(03): 38-41.
[2] 许谦, 周文欣, 王冲, 等. 桑黄活性物质研究现状[J]. 中国食用菌, 2019, 38(2): 1-6.
[3] 李媛媛, 毕明龙, 李莉. 栎树桑黄提取物调控结肠癌细胞SW620增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的分子机制[J]. 现代消化及介入诊疗, 2022, 27 (01): 58-62.
[4] Zhang MD, Xie Y, Su X, et al. Inonotus sanghuang polyphenols attenuate inflammatory response via modulating the crosstalk between macrophages and adipocytes[J]. Frontiers in Immunology, 2019, 10: 286.
[5] 梁研, 孙若岚, 刘夫艳, 等. 基于网络药理学和实验验证分析黄芪-莪术-蚤休角药配伍抗结直肠癌的作用机制[J]. 中国中药杂志, 2022, 47(3): 776.
[6] Dai YC, Zhou LW, Cui BK, et al. Current advances in Phellinus sensu lato: medicinal species,functions,metabolites and mechanisms[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87(5): 1587-1593.
[7] GFELLER D, GROSDIDIER A, WIRTH M, et al. SwissTargetPrediction: a web server for target prediction of bioactive small molecules[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42: 32.Fang SS, Dong L, Liu L, et al. HERB:a high-throughput experiment-and reference-g uided database of traditional Chinese medicine[J]. Nucleic Acids Res, 2021, 49(D1): D1197-D1206.
[8] BURLEY S K, BERMAN H M, KLEYWEGT G J. Protein Data Bank (PDB): the single global macromolecular structure archive[J]. Methods Mol Biol, 2017, 1607: 627.
[9] HAMOSH A, AMBERGER J S, BOCCHINI C, et al. Online Mendelian Inheritance in Man ( OMIM ): Victor McKusick′ s magnum opus[J]. Am J Med Genet A, 2021, 185(11): 3259. 
1. 经查阅文献，有关桑黄的研究较少，本文首次应用网络药理学对桑黄作用于衰老的主要活性物质、核心靶点和信号通路进行了预测分析，并用分子对接技术和动物实验对网络药理学的内容进行了验证。在丰富桑黄药理作用的同时，填补了桑黄对于心脏衰老及其机制研究的空白。
2. 本文首次提出桑黄可以缓解由D-半乳糖诱导的心脏衰老，并且证明桑黄可能通过激活PI3K/AKT/BCL-2通路对抗心脏衰老。实际应用潜力：研究成果可为抗衰老药物的开发提供新候选化合物，尤其为老龄化社会中心脏疾病的防治提供理论依据和实验支持。
3. 过去学者对于桑黄的研究，大多从单一角度来进行研究，本文结合网络药理学、分子对接和动物实验视角对于桑黄对抗衰老心脏的作用及其机制进行了分析，使得桑黄研究的视角更加多元化，弥补单一视角的局限性。 
技术路线：
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拟解决的问题：
1. 成分筛选与机制预测：桑黄中哪些活性成分可能通过多靶点、多通路对抗心脏衰老。
2. 分子机制验证：桑黄核心成分是否通过调控PI3K/AKT/BCL-2等信号通路抑制心脏衰老。
3. 体内有效性验证：桑黄水提物是否能在动物模型中显著改善心脏衰老相关病理指标（如心肌纤维化、氧化应激）。
预期成果：
在SCI收录的期刊或者北大Ⅰ类核心期刊发表论文1篇，形成研究报告，在省级及其以上的大学生创新创业大赛中取得奖项。 
第一阶段：准备阶段 （2024年3月）
1）组建团队，确定研究项目，撰写报告。
2）制定实验方案，完成前期资料整理汇总。
3）采购实验所需材料
第二阶段：实验阶段（2025年4月-2026年4月）
1）网络药理学及分子对接（2025年4月-2025年7月）
2）动物分组、造模、心功能及心肌病理染色（2025年8月-2025年11月）
3）qRT-PCR和western blot及免疫荧光检测（2025年12月-2026年4月）
第三阶段：整理数据、发表论文（2026年5月-2027年4月）
1）整理实验数据，对实验数据进行统计分析，得出实验结果。
2）书写论文并投稿。 
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
近期，我们就桑黄水提物对抗心脏衰老的作用及机制进行了研究，结果如下：
1.1获取桑黄活性成分及靶点
经Herb数据库初步检索，我们发现了桑黄有共计20个潜在的有效成分。经过进一步筛选，其中11个成分符合我们设定的标准。为了便于后续分析，本文采用 Sang1 至 Sang11 的命名方式对这11种成分进行了标识，见表2。进一步地，我们利用 SwissTargetPrediction 数据库检索并获取了与桑黄相关的177个潜在作用靶点。
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1.2获取衰老相关靶点
经过对GeneCards和OMIM数据库的检索，分别识别出1426个和574个与抗衰老相关的潜在靶点，我们对两个数据库中的靶点进行了合并去除重复项，最终确定了1873个与抗衰老紧密相关的靶点。
1.3构建与分析“成分-靶点”网络
通过Venny 2.1.0平台的分析，确定了桑黄与衰老共有69个交集靶点，见图1。然后，我们利用Cytoscape 3.9.1软件构建了“药物-成分-疾病基因靶点”的可视化网络，见图2。该网络涵盖了81个节点（包括11个化合物，69个靶点），以及它们之间93条相互作用的边。在拓扑学分析中，发现桑黄中几种活性成分的潜在靶点较为显著，包括桑黄酚A(Hispolon）、紫萁酮（(e)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one）、咖啡酸(Caffeic Acid)、桑黄素C(Phelligridin c)、藜芦酸（3,4-dimethoxybenzoicacid）等。这些成分在潜在靶点数目上排名靠前，因此，我们推测它们可能是桑黄对抗衰老的关键成分。
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图1 桑黄与衰老的交集靶点

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图2 药物-成分-疾病基因靶点网络
1.4构建PPI网
借助了STRING平台和Cytoscape 3.9.1软件，我们构建了PPI网络，见图3。图中共包含了68个节点（16个蛋白未参与直接的相互作用），这些节点之间通过599条边进行连接。节点的颜色深浅和面积大小反映了其节点度值的高低，颜色越深、面积越大的节点，其节点度值也越大。结果显示，ESR1、BCL2、EGFR、STAT3、HSP90AA1、HSP90AB1和GSK3B的度值排名靠前，推断这些靶点是桑黄对抗衰老的核心靶点
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图3 桑黄与衰老蛋白相互作用网络

利用DAVID数据库中的GO分析工具，我们获得了462个GO条目。为了更直观地展示这些条目的关键信息，我们分别从BP、CC和MF这三个类别中选取了前10个最具有代表性的条目进行了可视化处理，见图4。结果显示，桑黄对抗衰老主要涉及的BP包括对细胞凋亡的负面监管、磷酸化和调节细胞增殖等，CC包括核质、细胞溶胶以及细胞质等，MF包括酶结合、RNA聚合酶Ⅱ序列特异性、 DNA 结合、转录因子结合以及相同的蛋白质结合等。 KEGG分析得到118条细胞信号通路，选择前20条通路作为桑黄对抗衰老的重要途径并进行可视化，见图5。结果显示，PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路等在目标富集中占据主导地位，提示桑黄可能主要通过上述信号通路来发挥其对抗衰老的作用。
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图4 核心靶点的GO分析
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图5 核心靶点的KEGG富集分析
1.5分子对接验证
经过对活性成分与潜在靶点的深入分析，得出的分子对接具体结果见表3。在全部考察的63对分子对接关系中，有19对（30%）的结合能低于-7.0 kcal·mol-1，显示出较强的亲和力。其余42对（66.7%）的结合能则位于-7至-5 kcal·mol-1之间，表明这些对也具有较强的相互作用。此外，为了直观地展示这些分子对接的模式，做出了分子对接图，见图6：
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                                                               A                                                                  B                                                                     C
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                                                                                                      D                                                                       E
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                                                                                                         F                                                                           G

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                                                                                                       H                                                                      I
图6 活性成分与靶点的分子对接模式图
A：原儿茶酸与BCL2；B：咖啡酸与BCL2；C：藜芦酸与BCL2；
D：丁香酸与BCL2；E：紫琪酮与BCL2；F：桑黄素C与BCL2
G：桑黄素B与BCL2；H：桑黄素A与BCL2；I：桑黄酚A与BCL2
1.6 Y迷宫实验
1.6.1 空间识别
Y迷宫研究显示，与正常组比较，衰老组小鼠进入Y迷宫新臂的次数明显减少，在新臂的停留时间明显缩短（P<0.01)，提示衰老小鼠的探索行为明显抑制。与衰老组比较，桑黄组小鼠进入新臂次数增加(P<0.05)，在新臂的停留时间延长（P<0.01)。以上结果表明，桑黄可以改善衰老引起的小鼠探索行为障碍，结果见图7。
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       图7 Y迷宫空间识别进入新臂时间次数百分比（x ̅±s, n=4）
注：** P＜0.01，与正常对照组相比， # P＜0.05，## P＜0.01与衰老组相比
1.6.2 自发交替反应
Y迷宫研究显示，与正常组比较，衰老组的自发交替率显著降低 (P<0.01)。与衰老组相比，桑黄组自发交替率显著增加（P<0.05)，提示衰老小鼠的短期记忆能力受损。以上结果表明，桑黄明显改善衰老小鼠的记忆能力，结果见图8
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图8 Y迷宫自发交替率（x ̅±s, n=4）
注：** P＜0.01，与正常对照组相比， # P＜0.05，与衰老组相比
 1.7 小鼠心脏病理形态学观察
为了观察桑黄对衰老心脏衰老程度的影响，我们进行了心肌冰冻切片β-半乳糖苷酶染色。为了观察桑黄对衰老心脏损伤程度的影响，我们进行了心肌石蜡切片HE、马桑和天狼猩红染色。结果显示，与正常组相比，衰老组β-半乳糖苷酶染色显示衰老程度明显加重（P＜0.01），HE染色显示心肌有较多炎细胞浸润，马桑和天狼猩红染色显示心肌胶原纤维明星增多（P＜0.01）。与衰老组相比，桑黄组心脏的衰老程度明显减轻（P＜0.01），炎细胞浸润的程度明显减轻，心肌的胶原纤维明显减少（P＜0.01），如图9、图10所示。以上结果提示，桑黄能缓解衰老小鼠心脏的衰老，缓解衰老小鼠心脏的损伤。
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图9 心肌石蜡切片的HE、Masson、天狼猩红、β-半乳糖苷酶染色
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图10 心肌石蜡切片的Masson、天狼猩红染色心肌胶原纤维占比图与β-半乳糖苷酶染色心肌衰老面积比（x ̅±s, n=3）
注：** P＜0.01，与正常对照组相比， # P＜0.05，## P＜0.01与衰老组相比

1.8 血清生化指标检测
与正常组比较，衰老组小鼠血清CK和LDH活性均显著高于正常组（P<0.01）。与衰老组比，桑黄组血清CK和LDH活性显著降低（P<0.01)，结果见图11，提示桑黄能明显减轻衰老小鼠的心肌损伤。
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图11 桑黄对衰老小鼠CK活性与LDH活性的影响（ ±s, n=4）
注：** P＜0.01，与正常对照组相比，## P＜0.01，与衰老组相比
1.9 小鼠心脏组织氧化应激水平
根据荧光扫描及ImageJ分析结果，与正常组比较，衰老组小鼠心肌组织红色荧光明显增强（P<0. 01），即ROS含量明显升高；MDA明显升高（P<0. 05）。与衰老组比，桑黄组荧光强度明显减弱（P<0.05)，即ROS含量明显降低，MDA含量明显降低（P<0.05)。如图12、图13所示。以上结果提示桑黄能降低衰老小鼠心肌的氧化应激水平。
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 图12 小鼠心脏组织各组ROS水平（ ±s, n=4）
注：** P＜0.01，与正常对照组相比， # P＜0.05，与衰老组相比 
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图13 桑黄对衰老小鼠MDA含量的影响（ ±s, n=4）
注：* P＜0.05，与正常对照组相比， # P＜0.05，与衰老组相比
1.10 PI3K-AKT-BCL-2信号通路相关检测
网络药理学研究表明，HIF通路和PI3K/AKT通路是桑黄对抗衰老的主要信号通路，结合核心靶点，PI3K/AKT/BCL-2通路中所占核心靶点的数目较多，因此我们最终选定PI3K/AKT/BCL-2通路进行验证。我们分别用qRT-PCR和western blot检测了PI3K、AKT1、BCL-2的表达，见图14和图15。为了进一步验证桑黄对p-AKT1表达的影响，我们还用免疫荧光染色检测了心肌P-AKT1的表达，见图16。结果显示，与正常组相比，衰老组小鼠心脏p-PI3K、p-AKT1、BCL-2表达明显降低，p-AKT1阳性面积明显下降（P<0.01），与衰老组相比，桑黄组则明显上调p-PI3K、p-AKT1、BCL-2的表达，p-AKT1阳性面积也明显上升（P<0.05）,见图17。以上结果提示，桑黄能明显增强PI3K/AKT/BCL-2通路的活性，而发挥对抗衰老的作用
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图14 桑黄对衰老小鼠心肌p-PI3K、BCL-2、p-AKT1蛋白表达的影响（ ±s, n=3）
注：** P＜0.01，与正常对照组相比， # P＜0.05，## P＜0.01与衰老组相比
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图15 小鼠心脏组织各组AKT1、BCL-2、PI3K mRNA水平的相对表达量（ ±s, n=3）
注：** P＜0.01，与正常对照组相比， # P＜0.05，与衰老组相比
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图16 小鼠心脏组织免疫荧光染色
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图17 小鼠心脏组织各组免疫荧光强度（ ±s, n=3）
注：** P＜0.01，与正常对照组相比， # P＜0.05，与衰老组相比 
其他相关研究如下：
（1）李丽，高波，刘梅芳。侧柏叶对家兔心肌缺血-再灌注损伤的保护效应及其胆碱能抗炎作用。济宁医学院学报，2021，44（01）：14-17.
（2）Li Li，Bo Gao, Mei-fang Liu. Antagonistic Effects of Tetramethylpyrazine on Hypoxic Respiratory Depression in Rats. Evid Based Complement Alternat Med, 2020: 6456017. doi: 10.1155/2020/6456017.
（3）李丽，苗文静，王青。侧柏叶水煎液对耳廓炎症和腹腔炎症模型小鼠的抗炎作用。中国药房，2015，26（25）：3515-3517.
（4）李丽，刘文彦，苗文静。酸敏感离子通道在大鼠低O2高CO2所致呼吸效应中的作用，济宁医学院学报，2015,38(04)：243-246。
（5）李丽，刘文彦，高波。酸敏感离子通道在中枢化学感受器呼吸调节中的作用。中国病理生理杂志. 2014,30(08)：1400-1403。
（6）李丽，刘文彦，刘莹。丹红注射液延迟缺氧性呼吸抑制的发生及其机制，中国病理生理杂志. 2014,30(06)：1123-1126。
（7）刘梅芳，孙悦，李丽。枸骨叶水提物对小鼠肥胖的预防作用及对脂肪分化的影响。中国病理生理杂志. 2020,36(05)：899-905。
（8）高波，任强，李丽，刘梅芳，黄志成。正己烷亚急性染毒对小鼠骨骼肌超微结构及线粒体分裂与融合基因表达的影响。济宁医学院学报.2020,43(02)：90-93。
（9）刘梦晴,肖子怡,黄依芳,等.侧柏叶乙酸乙酯提取物缓解小鼠糖尿病心肌病[J].中国病理生理杂志,2024,40(08):1417-1425.
（10）沈哲慧,刘梦晴,朱雪晴,等.侧柏叶提取物对血液凝固的影响及其机制[J].济宁医学院学报,2024,47(01):5-9. 
前期，跟随指导老师学习实验动物的常规操作，已经熟练掌握了本研究所需的小鼠灌胃、腹腔注射、动物取血、取脏器等操作方法，同时学习了实验室常规仪器的使用，比如酶标仪、离心机、PCR仪等。学习了心肌石蜡切片的HE染色、HE染色、Masson染色、天狼猩红染色整个流程，已经掌握了各种染色方法的各个环节，包括组织的固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色等。同时，也已经掌握了western blot和RT-qPCR实验操作的整个流程。目前，学长在做有关毕业实习相关的实验，实验操作技术与本研究项目的实验操作密切相关，因此，如果在实验操作中遇到不懂的操作，可以继续向学长学习。与此同时，我们的指导教师具备丰富的指导学生实验的经验，已陆续指导学生毕业实习20余人，主持济宁医学院青年基金重点项目2项，济宁市科技局项目1项，参与山东省自然科学基金2项，贺林院士基金1项。同时，我们隶属于药学院心血管研究团队，团队的学长和老师具有丰富的细胞培养和分子生物学实验操作的经验，利于我们随时学习。而且，大家都在药理平台做实验，为了做出更好的结果，大家经常在一起交流各种实验手段和方法， 很有利于大家相互学习，共同提升。
目前，在项目书写、实验数据处理及论文书写等方面能力尚不足，将来会大量的阅读相关中英文文献，书写文献总结或综述，以弥补以上不足。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 5000.00 购买实验材料、发表论文 2000.00 3000.00
1. 业务费 3000.00 发表论文 0.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 发表论文 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 2000.00 购买实验材料 2000.00 0.00
结束

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