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L-氨基酸连接酶底物识别的分子机制及其底物选择性功能强化

申报人：张子晔 申报日期：2025-03-20

基本情况

2025创新项目
L-氨基酸连接酶底物识别的分子机制及其底物选择性功能强化 学生申报
创新训练项目
工学
生物工程类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
L-氨基酸连接酶(Lal)能够以ATP依赖的方式催化两个非保护的L-氨基酸形成二肽，虽然在二肽生物合成方面具有重要的应用价值，但较宽松的底物特异性，是限制其规模化应用的瓶颈。因此，本项目拟以典型的L-氨基酸连接酶(BacD)为研究对象，基于分子内底物通道效应、计算机模拟及分子生物学的方法探索其底物识别的分子机制，期望在提高其底物选择性的基础上，强化其综合催化能力。首先，通过分子模拟探索BacD的底物转运通道，分析在转运及催化过程中对底物识别起重要影响的关键结构因素。在此基础上，基于层次分析法深入研究不同结构因素对BacD反应活性和稳定性的影响, 建立理性改造BacD的综合评价指标。最后，对BacD进行系统的分子改造，在提高其底物特异性的基础上强化其综合催化能力。本研究有助于进一步理解Lal底物转运、识别及催化的分子机制，渴望为BacD的理性改造及丙谷二肽的生产技术改进提供借鉴。
   课余时间不断寻求机会深入参与科研项目，主动参与指导教师的科研项目中，掌握分子生物学的基本方法，能进行相关的实验研究；在此基础上参与多项实验室开放项目。
1.济宁医学院青年教师扶持基金;
2.贺林院士新医学科研基金;
3.山东省中医药科研项目。
       本项目指导教师将对本团队给予了全方位的支持与指导。在项目筹备阶段，导师结合自身专业领域经验，深入参与项目规划与方向论证，协助团队完成技术路线设计和可行性分析。在实施过程中，针对关键技术难题提供专业解决方案，并协调实验室设备、校内外专家资源对接等实质性支持。特别是在创新性突破环节，导师鼓励团队大胆尝试新兴技术路径，将定期跟踪项目进展并提供优化建议，同时指导学生完成计划书撰写及实验操作。团队可随时通过线上线下多渠道与导师保持高效沟通，确保项目稳步推进。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
张子晔 生命科学学院 生物工程（本科） 2024 统筹项目全过程，规划推动路线，协调团队运作
刘再瑞 生命科学学院 生物技术（本科） 2024 记录并分析实验数据，维护实验仪器
高睿熙 生命科学学院 生物工程（本科） 2024 查询文献，提供理论支持，设计实验方案
杨安然 生命科学学院 生物技术（本科） 2024 按照实验方案，进行实验操作
杨文韬 生命科学学院 生物工程（本科） 2021 对结果进行数据分析和模型构建
张营康 生命科学学院 生物工程（本科） 2021 撰写项目论文和ppt,总结汇报实验成果

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
刘晓环 生命科学学院 否

立项依据

(I) 在前人研究基础之上加深对 Lal 在催化合成二肽类化合物过程中底物识别机理的认识，探索并深入研究对底物识别起关键作用的结构因素。基于BacD，构建蛋白突变体库，从中筛选得到对L-Ala及L-Gln选择性( Kcat/KM)有明显提高的突变蛋白。
(II) 探索并研究在底物识别过程中起关键作用的结构因素对BacD的反应活性和热稳定性的影响。通过层次分析法，找到不同结构因素对选择性、反应活性和稳定性指标的影响，确立新的综合性改造策略从而更加深入地认识BacD在底物选择性改造过程中的构效关系。
(III) 通过全质粒定点突变的策略，构建得到催化性能得到综合强化的突变型 BacD。筛选得到综合能力大幅提升的突变体(底物特异性>90%, 酶活提高20%以上，Tm值提高3-5°C 以上，最适反应温度条件下半衰期延长30%以上，并对理想的突变型BacD进行综合评价。  
     为了探索BacD在催化合成二肽化合物过程中的底物识别的分子基础，及其在丙谷二肽合成中的功能强化，本项目将主要从以下三个方面进行研究：
   (I) 确定底物及产物进出BacD活性中心的转运通道，验证其中参与底物识别的关键结构因素，提高BacD对目标底物的选择性。利用CAVER3.0软件及随机加速动力学模拟对底物和产物在BacD内的迁移路径进行研究，筛选得到最佳的底物及产物的迁移路径。在此基础上，利用计算机模拟探索在该路径范围内，对底物识别起关键作用的结构因素，并通过实验进行验证。
   (II) 确定 BacD 催化合成丙谷二肽过程中，活性位点附近对其底物识别起关键作用的结构因素，探索其催化机制并强化其催化活性。利用分子对接、QM/MM(量子力学/分子力学)及分子动力学模拟的方法，探索在反应过程中(100ns)活性位点附近相关氨基酸的构象变化，找到该过程中起关键作用的结构因素。在此基础上，结合关键氨基酸能量的变化，研究关键的结构因素在酶催化过程中不同阶段所起的作用，并进行实验验证。
   (III) 确定不同结构因素对BacD 底物特异性性、反应活性与热稳定性的综合影响，并获得催化活性显著提高的BacD突变体。运用层次分析法，通过设立恰当的目标层、准则层、指标层与方案层，构建方案评价的递阶层次结构模型及判断矩阵。通过对各相关指标进行评价，经过加权计算，得到各结构因素对BacD 总体催化性能的综合评价结果，建立BacD的综合评价模型。
1.1 L-氨基酸连接酶作为生物催化剂是生物合成二肽化合物的有效手段
   L-氨基酸连接酶(Lal)是ATP-grasp 酶超家族中的重要一员，能够以无保护的L-氨基酸为底物合成二肽，因而在二肽的生物合成过程中具有重要的应用价值。目前已发现多种来源不同的Lal (例如：Ywf E[1, 2]，RizA[3]，BL00235[4]，PSPPH4299[5]及 TabS[6]等) ，其分别能够催化合成不同的二肽化合物。其中来源于枯草芽孢杆菌中的L-氨基酸连接酶：alanine-anticapsin ligase (BacD, YwfE)[7]，是第一个被结构鉴定的Lal，能够催化L-丙氨酸(L-Ala)和L-anticapsin 合成二肽抗真菌化合物：bacilysin。同时，研究发现BacD也能够催化游离的 L-丙氨酸和L-谷氨酰胺合成丙氨酰-谷氨酰胺二肽(丙谷二肽，Ala-Gln) [8, 9]。BacD 蛋白在二肽的生物合成中具有十分重要的潜在应用价值，相比于化学合成或者其它工具酶，BacD具有以下优势：(1) BacD是一种结构较小的可溶性蛋白酶，在常规的实验条件下更容易获得并对其进行相关的分子生物学改造；(2)BacD 催化合成丙谷二肽的反应是单向的不可逆过程，有利于反应的进行及反应转化率的提高；(3)相比于其它二肽合成酶,该反应所需的底物均为天然化合物，反应过程中不需要其它保护、脱保护步骤。因此，加强对BacD在二肽化合物生物合成中的研究，将不仅有利于进一步理解 Lal 底物识别的分子基础及催化机制，而且将有利于进一步强化其在二肽生物合成用的应用潜力。
1.2 如何在保留底物特异性的基础上实现其它各项催化性能的共同进化是BacD 应用于生物合成二肽化合物的关键
   底物选择性差是限制BacD用于催化制备小分子肽类化学品的核心因素。就特定的 Lal 酶而言，其宏观上针对某个或者某几个特定 L-氨基酸的选择性通常是自身多种结构因素综合作用的结果。对Lal底物选择性有重要影响的结构因素通常也很有可能对酶的反应活性和热稳定性产生影响，例如：底物结合口袋的拓扑结构，酶分子的局部结构柔性，酶与底物过渡态结合的局部空间位阻，底物分子过渡态特定原子与附近氨基酸残基的弱相互作用等方面。基于于此，BacD催化合成二肽类化合物过程中的底物识别机制与催化性能协同强化研究可以归结为以下关键科学问题：在现有研究基础上，探索BacD底物识别的分子基础并找出起关键作用的结构因素; 研究这些基团对 BacD 的反应活性和稳定性的影响，建立BacD催化能力的综合评价指标。在此基础上对其进行理性改造，实现其催化性能的协同强化
(I) 深入研究BacD底物识别的分子基础是通过理性改造提高其底物特异性的前提条件。
   前人已经对BacD对不同底物的识别机理进行了一定的研究，主要集中在以下二个方面[1，9-12]：不同的底物及二肽产物在活性中心的结合方式研究；BacD的催化机理研究。
   (1) 不同的底物及二肽产物在活性中心的结合方式研究。底物L-氨基酸结合中心由六个 loop 环构成：N-末端底物主要位于由 Glu273, His301, Glu311 及Gly331 等组成的区域内；而C-末端氨基酸底物被固定在由Gly14, Tyr75, Glu109，及Ser184 等所组成的空间区域。ADP的结合区域位于BacD中间区域和C末端区域的边界位置；两个Mg2+在ADP与BacD结合时，对底物分子空间构型的调整发挥了重要的作用。二肽产物的空间构型受到三个氢键的固定，分别是Glu273、Glu311 和 His309 的 ɛN 原子与产物N末端的氨基之间形成的氢键，其对固定BacD与产物之间形成的四面体过渡态发挥关键的作用。
   (2)目前在一定的研究与推断基础上，研究者认为 BacD 的催化三联体为Glu15, Ser150 和 Tyr216 三个关键的氨基酸残基。在反应过程中(图1)，ATP首先到BacD的活性中心，诱导酶的空间构象发生变化，促进氨基酸底物进入底物结合中心并与其中的关键氨基酸残基发生相互作用[13, 14]。N-末端氨基酸底物进入BacD 的活性中心后通过羰基氧原子亲核攻击γ-磷酸基团的磷原子，实现磷酸基团转移。然后，C-末端氨基酸底物进入催化中心，通过游离氨基亲核攻击磷酸酯的羰基 C 原子形成四面体过渡态。最后，二肽产物通过氨基去质子化释放出磷酸基团并生成最终产物。
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图1 BacD催化L-α-二肽反应机理推断示意图
(1: N 末端底物结合到BacD活性中心，并与关键氨基酸的作用机制，2：C末端底物结合到BacD活性中心，并与关键氨基酸的作用机制，3：产物释放过程)

   尽管对 Lal 催化合成某些特定二肽类化合物的催化机理已经有了一定程度的认识，但如何进一步提高 Lal 的催化效率特别是提高其底物特异性依然是一个技术难题。① 由于对Lal的研究起步较晚，针对其底物识别的研究比较匮乏。② 这主要是由于不同的底物氨基酸在酶的活性中心内可能存在多种不同的结合方式，要获得理想的底物选择性必须对其它所有的结合模式均进行有效的抑制，但在蛋白质改造过程中往往很难做到对其它所有结合模式的有效抑制。③在催化活性口袋附近进行氨基酸改造往往会显著改变酶分子与底物之间的相互作用(如疏水作用等)，从而产生一些不可预期的结果。例如，某些活性口袋同底物的苯环之间所形成的疏水作用，往往能够为特异性识别某种底物提供额外的驱动力。④ 过去的大部分研究基本上都集中在活性中心附近高度保守的(第一层)关键氨基酸，即直接参与底物结合或催化的氨基酸，而对活性中心附近的(第二层)氨基酸则研究甚少。虽然这些基团其保守性较低，但往往能够通过与第一层氨基酸相互作用间接参与催化过程，造成Lal家族成员的底物选择性多样化。因此，如何在现有的认知基础上，探索影响其底物识别的关键结构因素，找到合理的改造策略提高对目标底物的选择性，是对Lal进行有效改造和性能调控的前提条件。
(II) 底物通道效应应用在酶理性设计中有利于拓展生物催化和生物转化的功能空间
   在自然进化过程中，底物通道效(Substrate channeling)应有助于提高反应过程中各组分的扩散效率，进而提高某一特定代谢途径中代谢产物的处理效率[15-17]。底物通道效应已被证实广泛存在于众多的生物代谢途径[18-20]，例如，多酶复合物的级联催化反应[15, 21]。其中，分子内通道效应 (intramolecular tunnels)也是如今研究较为广泛的酶分子内代谢物的主要调控方式，例如：色氨酸合成酶，醛缩酶-脱氢酶，氨甲酰磷酸合成酶分子内的通道效应等等[17, 22-24]。这也为当前酶的理性设计及改造提供了一条有效的、切实可行的策略[25-27]。通过调节/改造生物大分子内部的底物扩散通道，或者通过改造小分子化合物，进而定向调控大分子的生物活性已经成为近年来的一个研究热点内容。在前期研究中，我们将分子内通道效应应用到BacD结构改造中，基于计算机模拟及分子生物学相结合的方法成功提高其对L-Ala、L-Phe的底物选择性，获得一种能够高效催化合成新型抗真菌抗生素的基因工程菌。相关研究成果将在研究基础(二 (1))中展示。我们有理由相信，基于分子内底物通道效应的计算机模拟与分子生物学相结合的方法可以用来探索BacD的底物识别机理。
(III) 探索不同结构因素对 BacD 反应活性和稳定性的影响是实现其多催化性能共同进化的理论基础。
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图 2结构因素对多催化性能的协同影响

  生物催化剂的结构决定其生物学功能，对蛋白酶底物选择性起重要作用的结构因素往往同样也会对酶的反应活性和稳定性产生重要影响。例如，酶活性中心附近的空间位阻(底物结合口袋大小)[28]、结构柔性(如 Ω-loop 结构等)[29]、底物与酶分子之间的各种弱相互作用(氢键、疏水相互作用,盐桥等)[30]都会从不同的角度对酶的反应活性与稳定性产生重要的影响。尽管针对特定结构因素(如Ω-loop 结构)与其相对应的催化性能(蛋白质的稳定性)之间的相互关系研究可以相对容易地取得一定程度的研究进展。但对于特定结构因素对多催化性能的协同影响甚至多结构因素对多催化性能的复杂协同影响却是一个相对棘手的研究难点。由于某一特定结构因素会对酶催化性能造成多样性的影响，因此，在深入理解对BacD底物识别起关键作用的结构因素基础上，探索这些关键结构因素对其反应活性和稳定性的影响，这对于实施有效的分子改造，实现其多催化性能共同进化具有重要的指导意义。而层次分析法(Analytic Hierarchy Process)的出现为解决如何认识多结构因素与多催化性能之间的复杂相互关系就成为一个非常关键的问题提供了可能[31, 32]。由于生物催化剂在催化过程中是一个由相互关联、相互制约的众多因素构成的复杂系统。层次分析法则为研究这类复杂的系统，提供了一种新的、简洁的、实用的决策方法。它可以从量纲各异的统计指标得出相对评价值，确定个指标的权重，最终得到综合评价结论。
  微生物酶法生产二肽具有反应条件温和、环境污染少、产率高、成本低等优点。L-氨基酸连接酶(Lal)能够以ATP依赖的方式催化两个非保护的L-氨基酸形成二肽，虽然其在二肽生物合成方面具有重要的应用价值，但由于其底物特异性差，导致在实际应用中存在催化活性低的问题。因此，本项目拟以典型的L-氨基酸连接酶(BacD)为研究对象，基于分子内底物通道效应、计算机模拟及分子生物学的方法探索其底物识别与催化机制，并对其进行分子改造提高其催化合成丙谷二肽的能力。首先，通过分子模拟探索BacD的底物转运通道，分析该过程中对其底物识别与催化起重要影响的关键结构因素。在此基础上，基于层次分析法深入研究不同结构因素对BacD反应活性和稳定性的影响, 建立理性改造BacD的综合评价指标。最后，对BacD进行系统的分子改造，在提高其底物特异性的基础上强化其综合催化性能。本研究有助于进一步理解Lal底物转运、识别及催化的分子机制，渴望为理性改造 BacD 催化合成丙谷二肽提供理论参考，并为丙谷二肽的生产技术改进提供借鉴。

参考文献
[1] K. Tabata, H. Ikeda, S. Hashimoto, ywfE in Bacillus subtilis codes for a novel enzyme, L-aminoacid ligase, Journal of Bacteriology, 187 (2005) 5195-5202.
[2] T. Tsuda, T. Suzuki, S. Kojima, Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of Bacillus subtilis YwfE, an L-amino-acid ligase, Acta crystallographica. Section F, Structural biology and crystallization communications,68 (2012) 203-206.
[3] K. Wataru, A. Toshinobu, I. Shun, K Kino, H. Kurumizaka, Structure of RizA, an L-amino-acid ligase from Bacillus subtilis, Acta Crystallographica, 71 (2015) 1125-1130.
[4] H. Kino, K. Kino, Alteration of the substrate specificity of L-amino acid ligase and selectivesynthesis of Met-Gly as a salt taste enhancer, Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, 79 (2015) 1827-1832.
[5] T. Arai, K. Kino, A novel L-amino acid ligase is encoded by a gene in the phaseolotoxin biosynthetic gene cluster from pv. 1448A, Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 72 (2014) 3048-3050.
[6] A. Hashida, S. Nakajima, T. Arai, et al, Alteration of the substrate specificity of TabS based on the structural information of L-amino acid ligase, The Society for Biotechnology, Japan, 2014.
[7] J.B. Parker, C.T. Walsh, Action and timing of BacC and BacD in the late stages of biosynthesis ofthe dipeptide antibiotic bacilysin, Biochemistry, 52 (2013) 889-901.
[8] K. Tabata, S. Hashimoto, Fermentative production of L-alanyl-L-glutamine by a metabolicallyengineered Escherichia coli strain expressing L-amino acid alpha-ligase, Applied & Environmental Microbiology, 73 (2007) 6378-6385.
[9] T. Tsuda, M. Asami, Y. Koguchi, S. Kojima, Single mutation alters the substrate specificity of L-amino acid ligase, Biochemistry, 53 (2014) 2650-2660.
[10] Y. Shomura, E. Hinokuchi, H. Ikeda, A. Senoo, Y. Takahashi, J. Saito, H. Komori, N. Shibata Y.Yonetani, Y. Higuchi, Structural and enzymatic characterization of BacD, an L-amino acid dipeptide ligase from Bacillus subtilis, Protein Science, 21 (2012) 707-716.
[11] K. Kino, T. Arai, D. Tateiwa, A novel L-amino acid ligase from Bacillus subtilis NBRC3134. catalyzed oligopeptide synthesis, Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 74 (2010) 129-134.
[12] T. Tsuda, T. Suzuki, S. Kojima, Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of Bacillus subtilis YwfE, an L-amino-acid ligase, Acta Crystallographica, 68 (2012) 203–206.
[13] Y. Kitamura, A. Ebihara, Y. Agari, A. Shinkai, K. Hirotsu, S. Kuramitsu, Structure of D-alanine-D-alanine ligase from Thermus thermophilus HB8: cumulative conformational change and enzyme-ligand interactions, Acta crystallographica, 65 (2009) 1098-1106.
[14] Y. Ogasawara, T. Dairi, Biosynthesis of oligopeptides using ATP-grasp enzymes, Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany), 23 (2017).
[15] I. Wheeldon, S.D. Minteer, S. Banta, S.C. Barton, P. Atanassov, M. Sigman, Substrate channellingas an approach to cascade reactions, Nature Chemistry, 8 (2016) 299-309.
[16] L.J. Sweetlove, A.R. Fernie, The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation, Nature Communications, 9 (2018) 2136-2147.
[17] M.H. Cheng, D. Torressalazar, A.D. Gonzalezsuarez, S.G. Amara, I. Bahar, Substrate transport and anion permeation proceed through distinct pathways in glutamate transporters, Elife, 6 (2017) e25850(doi: 10.7554/eLife.25850).
[18] K.S. Anderson, Understanding the molecular mechanism of substrate channeling and domain communication in protozoal bifunctional TS-DHFR, Protein Engineering Design & Selection Peds, 30 (2017) 253-261.
[19] S .Kim, S.J. Bae, J.S. Hahn, Redirection of pyruvate flux toward desired metabolic pathways through substrate channeling between pyruvate kinase and pyruvate-converting enzymes in Saccharomyces cerevisiae, Scientific Report, 7(2016) 24145-24155.
[20] S. Nikhilesh, B.W. Arentson, L. Min, J.J. Tanner, D.F. Becker, First evidence for substrate channeling between proline catabolic enzymes: a validation of domain fusion analysis for predicting protein-protein interactions, Journal of Biological Chemistry, 290 (2015) 2225-2234.
[21] J.L. Lin, L. Palomec, I. Wheeldon, Design and analysis of enhanced catalysis in scaffolded multienzyme cascade reactions, Acs Catalysis, 4 (2014) 505–511.
[22] F. Wu, S. Minteer, Krebs cycle metabolon: structural evidence of substrate channeling revealed by cross-linking and mass spectrometry, Angewandte Chemical Intional Edition, 54 (2015) 1851-1854.
[23] J. Graham, T. Williams, M. Morgan, A.R. Fernie, R.G. Ratcliffe, L.J.Sweetlove, Glycolytic enzymes associate dynamically with mitochondria in response to respiratory demand and support substrate channeling, Plant Cell, 19 (2007) 3723-3738.
[24] B. Bulutoglu, K.E. Garcia, F. Wu, S.D. Minteer, S. Banta, Direct evidence for metabolon formation and substrate channeling in recombinant TCA cycle enzymes, Acs Chemical Biology, 11 (2016) 2847-2853.
[25] H. Singh, B.W. Arentson, D.F. Becker, J.J. Tanner. Structures of the PutA peripheral membrane flavoenzyme reveal a dynamic substrate-channeling tunnel and the quinone-binding site, Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(2014):3389-3394.
[26] Y. Chen, G. Ke, Y. Ma, Z. Zhu, M. Liu, Y. Liu, H. Yan, C.J. Yang, A Synthetic Light-Driven Substrate Channeling System for Precise Regulation of Enzyme Cascade Activity Based on DNA Origami, Journal of the American Chemical Society, 140 (2018) 8990-8996.
[27] J.L. Lin, J. Zhu, I. Wheeldon, Synthetic protein scaffolds for biosynthetic pathway colocalization on lipid droplet membranes, Acs Synthetic Biology, 6 (2017) 1534-1544.
[28] D. Lan, H. Xu, J. Xu, J. Liu, F.I. Khan, Y. Wang, Malassezia globosa MgMDL2 lipase: Crystal structure and rational modification of substrate specificity, Biochemical & Biophysical Research Communications, 488 (2017) 259-265.
[29] F. Steffenmunsberg, P. Matzel, M.A. Sowa, P. Berglund, U.T. Bornscheuer, M. Höhne, Bacillus anthracis ω-amino acid: pyruvate transaminase employs a different mechanism for dual substrate recognition than other amine transaminases, Applied Microbiology & Biotechnology, 100 (2016) 4511-4521.
[30] X. Zhang, L. Li, N. Li, L. Zhou, S. Lü, S. Chen, D. Mao, M. Long, Salt bridge interactions within the β2 integrin α7 helix mediate force-induced binding and shear resistance ability, Febs Journal, 285 (2017) 261-274.
[31] I. Basak, T. Saaty, Group decision making using the analytic hierarchy process, Mathematical Computer Modelling, 17 (1993) 101-109.
[32] M. Gutknecht, M. Danner, M.L. Schaarschmidt, C. Gross, M. Augustin, Assessing the importance of treatment goals in patients with psoriasis: Analytic Hierarchy Process vs. Likert Scales, Patient, 11(2018) 425-437.
[33] Y. Hirao, Y. Mihara, I. Kira, I. Abe, K. Yokozeki, Enzymatic production of L-alanyl-L-glutamine by recombinant E. coli expressing α-amino acid ester acyltransferase from Sphingobacterium siyangensis, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 77 (2013) 618-623.
  (I) 目前二肽类化合物的高效生物合成是限制其产业化应用的一个关键问题。由于Lal在催化合成二肽过程中表现出的底物选择性差这一问题，在前人研究的基础上通过计算机模拟技术，本项目基于分子内底物通道效应，探索并鉴定出对BacD底物识别起重要作用的关键结构因素，将进一步强化对Lal的底物识别机理的认识。基于分子内通道效应，结合分子动力学模拟的方法，从BacD的结构角度出发，探索关键结构因素对其底物识别的影响，这是本项目的一大理论创新之处。
  (II) 当前，生物酶的理性改造大多是仅集中在如何提高酶的某种单一催化性能，这样往往忽视了酶的催化性能和其它结构因素之间的相互作用，从而对其它的催化性能造成严重的影响(通常是负面影响)。因此，在充分探索和研究多结构因素与多催化性能参数之间相互关系的基础上，通过理性改造，使BacD的多催化性能之间共同进化是本研究的主要特点和创新点。
1.1 技术路线 
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图3 BacD催化机制研究及其功能强化路线示意图

   基于图3，本项目将主要按照以下的方案对BacD进行催化机理研究及其功能强化的研究：
   (I) B_ΔM034 的异源表达、全质粒定点突变、酶学性质表征及其对不同L-氨基酸的底物选择性。
   根据之前的研究基础，以 B_ΔM034的基因序列为模板进行PCR，将扩增得到的目标基因片段测序验证后，插入表达载体 pET28(a)。然后，将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中、IPTG诱导、高效异源表达B_ΔM034。
   通过融合标签实现B_ΔM034的可溶性表达及纯化，并分别测定其在识别不同L-氨基酸过程中的酶学性质参数，包括：ATP酶活、最适pH、最适温度与热稳定性、最适温度下的半衰期等。
   (II) 底物进入BacD活性中心的不同路径对其底物选择性的影响分析。
   利用已报道BacD的晶体结构(PDB:3VMM)为模板，通过MODELLER 软件构建B_ΔM034的同源模型，并进行优化。由于该结构仅仅涉及一个氨基酸的突变，因此得到的B_ΔM034结构模型具有极高的可信度，并以此模型作为本项目中计算机模拟的研究对象。
   ① 基于 CAVER3.0 软件及随机加速动力学模拟(RAMD)对底物(L-Ala、L-Gln)和产物 (Ala-Gln)在BacD内的迁移路径进行研究。首先，探索L-Ala、L-Gln进入活性位点和Ala-Gln释放过程中的可能通道及其重要性。计算模拟中，定义中心碳原子为L-Ala、L-Gln 和 Ala-Gln 的近似质心，采用不同的加速度和阈值来驱动底物/产物的传递，确定可的能通道(轨迹)。通过分析不同通道(孔径、长度等等)，筛选出最有可能的10条可能通道。在此基础上，继续分析不同通道与蛋白质边缘的距离，及通道的宽度，推测出最佳的转运通道。最后，通过对底物及产物的通过几率进行统计，进一步验证并确认该通道的合理性。
   ② 在此基础上，通过量子力学和分子力学组合方法 (QM/MM) 进行蛋白配体复合物的动力学模拟，在高能区域(反应过渡态附近)结合伞形采样技术，对底物/产物通过主要通道的能量性质进行了计算分析，获得相对自由能曲线。
   ③ 通过上述两方面的计算模拟，分析底物与产物在蛋白通道中的迁移机制，并鉴定出其中对底物/产物识别及转运起重要影响的氨基酸残基。通过全质粒PCR 方法，验证上述得到的氨基酸残基对B_ΔM034底物识别所起的作用，并获得底物特异性最高的蛋白酶B_ΔM034_01。
   (III) BacD 活性中心附近关键氨基酸残基对底物选择性及催化活性影响分析。
   ①利用CDOCKER程序，将L-Ala、L-Gln对接到BacD 的活性中心，获得酶-底物复合物结构。然后利用QM/MM方法，基于配体中重原子的坐标均方根偏差(RMSD)值，对配体在活性位点中的结合模式进行优化。以此为初始结构，对其进行分子动力学模拟，当体系达到平衡时进行100 ns动力学模拟，分析在催化过程中相关氨基酸的构象变化，获得在催化过程中其关键作用的氨基酸残基。
   ②使用连续介质模型 (MM/PBSA 和 MM/GBSA)计算底物与酶的结合自由能并将结合自由能按残基进行分解。分析不同的作用力对残基分解结合自由能的贡献，确定活性中心附近不同氨基酸残基对底物结合的影响。
   ③ 获得对BacD 催化活性起重要作用的氨基酸残基, 通过 QM/MM模拟，以及和原始BacD酶体系的模拟结果进行对比分析，研究关键残基在酶催化过程中不同阶段所起的作用。基于上述的研究，通过全质粒PCR方法，构建突变蛋白库并对其催化活性及稳定性进行检测、验证，确定BacD的催化机理。筛选反应活性和稳定性有显著提高的突变型 B_ΔM034_02。
   (IV) 不同结构因素对 BacD 底物专一性、反应活性与热稳定性的综合影响分析。
    ①运用层次分析法(图4)建立BacD 的综合评价模型。其中目标层为理想的生物催化剂BacD，准则层包括 BacD 的底物专一性、反应活性和热稳定性。指标层是与准则层相对应的各评价指标，方案层则是四种待评价的典型蛋白酶改造方向。
    ②建立方案评价的递阶层次结构模型，对各元素的重要性进行两两比较，构造判断矩阵(式1)。对于上述各比较判断矩阵aij 表示因素 i 与因素 j 的相对重要性比较结果。用Matlab数学软件求出其最大的特征值及其对应的特征向量，将特征向量经归一化，得到相应的层次单排序的相对重要性权重向量、一致性指标、一致性比例。
summernote-img                                                                           （1）
   ③进行层次总排序及一致性检验。最后对各结构因素相关各指标进行评价，经过加权计算，得到各结构因素对 BacD总体催化性能的综合评价结果。
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图 4 基于层次分析法的综合评价模型构建示意图


   (V) 综合催化性能强化的BacD蛋白酶的获得及其结构表征。
   基于上述的评价指标，通过全质粒PCR技术进行定点突变，并对其底物选择性、催化活性和稳定性进行检测，得到综合性能最强的蛋白酶: B_ΔM034_03。利用，并利用基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)对其进行蛋白酶结构进行初步表征。在此基础上，对阳性突变体利用 X-射线衍射法测定目标蛋白酶突变体的晶体结构，及小分子化合物与目标蛋白的复合物结构示意图，确定其相互作用方式。
1.2 拟解决的关键问题
   (I) 底物选择性是生物催化剂在催化合成化学品过程中的核心指标，也是限制BacD产业化应用的一个关键因素。从BacD结构因素角度出发，深入探索其在底物识别过程中的分子机制，这是对L-氨基酸连接酶底物选择性进行有效改造的必要条件，也是理解蛋白质构效关系规律和选择性调控分子机制的基础科学问题。
   (II) 具有应用价值的生物催化剂需同时具有多种良好的催化性能，而生物催化剂的催化性能是多种结构因素共同作用的结果。如何认识这些结构因素对反应活性和稳定性的影响，揭示各催化性能与结构因素之间的相互作用规律，这是实现BacD各催化指标协同优化的关键科学问题。这将为BacD的理性设计、改造提供理论基础；这也是进一步拓展和强化BacD的工业属性及其资源利用的先决条件。
1.3预期研究成果
   (I) 基于计算机模拟与分子生物学结合的方法，建立一种探索并改造蛋白质底物特异性的方法，在此基础上阐明BacD的底物识别机理及催化机制。
   (II) 获得一种具有自主知识产权的、底物特异性与催化活性显著提高的BacD 突变体。
   (III) 在国内外高水平学术刊物上发表 2 篇论文，其中 SCI 论文 1-2 篇，申请专利 1 项。
   本项目的研究任务在 2025 年 06月至 2027 年 05月两年内完成分阶段完成预定的目标，具体安排如下：
   2025 年 06 月至 2025 年 09月：
   在大肠杆菌BL21(DE3)中，对B_ΔM034基因进行异源表达，并对目的蛋白的表达量、底物选择性、酶活进行表征。在此基础上，对B_ΔM034在催化合成丙谷二肽过程中的相关酶学性质进行研究，初步确定其最适的催化条件：包括最适温度，pH，反应时间及ATP的最佳初始浓度等。探索其对不同氨基酸底物的选择性，并确定最佳的底物浓度。
   2025 年 09 月至 2026 年 01 月：
   计算机模拟底物分子进入 BacD 蛋白活性中心的路径，分析可能路径上对BacD 发挥底物选择性具有显著影响的结构因素，并进行虚拟筛选。在此基础上，通过全质粒PCR构建突变蛋白库，检测突变体的底物选择性变化，对模拟结果进行验证，筛选得到选择性显著提高的BacD突变体。
   2026 年 01 月至 2026 年 05 月：
   通过计算机模拟BacD蛋白与目标底物的相互作用方式，分析对BacD蛋白活性中心附近对底物识别具有显著影响的氨基酸残基，并进行虚拟筛选。在此基础上，通过全质粒PCR构建突变蛋白库，检测其底物选择性变化，对模拟结果进行验证。
   2026 年 05 月至 2026 年 10 月：
   综合分析不同结构因素对BacD 底物专一性、反应活性与热稳定性的影响，并建立改造 BacD 综合评价指标。在此基础上对B_ΔM034进行定点突变，检测其底物选择性、催化活性与热稳定性，筛选获得理想的BacD突变体，并对其进行结构表征。
    2026 年 10 月至 2027 年 05 月：
    对得到的B_ΔM034突变体进行催化能力表征，获得相关的关键数据，为其进一步的应用奠定基础。
    最后，总结项目研究成果，撰写研究报告，准备结题验收。
   长期以来，本项目指导老师及所在团队在天然抗真菌化合物的研究领域进行了卓有成效的研究。申请人长期从事计算机辅助药物设计、新药研发、蛋白结构与功能关系等方面的研究。之前新药研发过程中，研究了抗真菌二肽类化合物 bacilysin 的生物合成及抗真菌机理。为了解决 bacilysin 在野生菌胞内的含量较低、杂质多的问题，通过改造其生物合成途径中的最后一个催化酶(L-氨基酸连接酶，BacD)，提高 BacD 对其天然底物(L-Ala、L-anticapsin)的选择性，进而提高了 bacilysin 的产量(相关文章正在发表过程中)，相关研究结果简述如下。通过计算机模拟L-Ala 和 L-Phe(由于其与 L-anticapsin 结构上的相似性及为了后续实验验证的方便)在 BacD 内部的迁移路径，确定在该路径中对底物识别有重要影响的关键结构因素(图5)。并通过分子动力学模拟探索在二肽产物形成过程中，活性位点附近对对底物识别有重要影响的关键氨基酸残基(结果未展示)。在此基础上通过分子生物学的方法，验证这些鉴定出的结构因素对L-Ala和L-Phe的选择性影响(部分结果如图6所示)。通过该方法的研究，成功获得一个BacD突变体(B_ΔM034)提高其对L-Ala、L-Phe 的底物选择性(Kcat/KM分别提高了64.2% 和49.4%)。通过基因工程改造，用B_ΔM034基因替换野生菌ZJU-2011染色体中原始的bacD基因，得到基因工程菌ZJU-2011-ΔM034。通过分批发酵，工程菌发酵液抗白色念珠菌的活性提高了3.5倍。
summernote-img图5 BacD底物转运通道中关键节点的底物与蛋白的相互作用示意图
(1:探针化合物在N末端通道内与关键氨基酸的作用机制，2：第二个探针化合物在C末端通道内与关键氨基酸的作用机制) 
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图6 BacD突变体对其底物选择性研究
(1：Trp332 饱和突变结果，2：Arg328饱和突变结果)

   针对本项目，通过PCR的方法以已获得目的蛋白BacD的基因，并进行了测序验证，其基因电泳图如图 7(1)(1419 bp)所示。同时实现其在大肠杆菌BL21(DE3)内高效表达表达(图 7(2), ~53kDa)。通过筛选不同的 L-氨基酸，发现BacD 能够识别L-Ala, L-Phe, L-Met，L-Gln 作为其催化底物(其酶活如表1以所示), 不仅能够催化合成丙谷二肽，同时还有其它二肽化合物的产生，存在底物特异性差的问题。
summernote-img图7 BacD的核酸电泳图(1)与蛋白电泳图(2)

表1 BacD与B_ΔM034催化不同的氨基酸底物合成丙谷二肽过程中的关键酶学参数。 
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     基于之前的研究基础，在进行下一步研究之前，首先对 B_ΔM034 催化合成丙谷二肽的酶学性质进行了研究。如图8 (1)、(2)所示， 其最适反应温度提高了接近4℃，同时热稳定性得到了大大的提高(40℃处理60min后，仍保留70%左右的酶活)。在此基础上，又对其底物耐受性进行了初步的研究(图8(3)、(4))，发现B_ΔM034对Ala与Gln的底物耐受性都有了显著的提升，其相对酶活分别提高了 27%与 63%。已有研究表明催化口袋内非活性位点的某些氨基酸是影响耐受性的关键氨基酸，这也为后续的改造提供了新的研究思路。对B_ΔM034进行丙谷二肽的催化实验(图8(5))，发现相比较原始的 BacD，其对 L-Ala 的催化活力提高了27.5%, 对L-Glu的催化活力提高了35.5%。在20 mM的初始底物浓度下(表1)，丙谷二肽的产量达到了17.12 mmol/L(提高25.1%)的丙谷二肽，最高摩尔转化率可达85.60％(提高23.5%)。
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图8 B_ΔM034酶学性质表征(1), (2)，对L-Gln (3)及L-Ala (4)的底物耐受性对L-Ala及L-Gln的催化活力

    目前，正在对BacD识别L-Ala及L-Gln的分子机制进行计算机模拟，初步确定了BacD 中的多条可能的底物转运途径(图9)，目前正在研究其中多个关键氨基酸残基在底物识别过程中的重要作用及通过实验验证这些关键氨基酸残基所发挥的作用。
summernote-img图 9 基于计算机模拟模拟BacD中可能的底物转运途径
       申请人所在单位建有10个省级重点实验室及药物研发中心，满足细胞生物学、分子生物学、生物化学和结构生物学等相关学科的实验要求。学校公共科研平台配套设施齐全、功能完善，具备从事分子生物学及其相关研究的必备仪器，能够满足本项目分子改造BacD的研究、酶催化及微生物发酵方面的研究工作。
       综上所述，申请人现有的工作条件能够满足本项目的顺利进行。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 16000.00 4000.00
1. 业务费 6000.00 无 6000.00 0.00
（1）计算、分析、测试费 2500.00 引物合成、基因测序及结构表征等 2500.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 500.00 论文检索 500.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 版面费及论文润色 3000.00 0.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 14000.00 购买相关分子生物学试剂及耗材等 10000.00 4000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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