济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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基于 HIF-1α/VEGF 轴探讨黄芪-莪术抑制结直肠癌血管生成改善帕尼单抗耐药的作用机制

申报人：程谨慧 申报日期：2025-03-19

基本情况

2025创新项目
基于 HIF-1α/VEGF 轴探讨黄芪-莪术抑制结直肠癌血管生成改善帕尼单抗耐药的作用机制 学生申报
创新训练项目
医学
中西医结合类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
结直肠癌（CRC）是全球高发的恶性肿瘤之一，靶向药物（如 EGFR抑制剂帕尼单抗）的耐药性问题严重制约临床疗效。肿瘤微环境缺氧和异常血管生成是导致耐药的关键因素，其中 HIF-1α/VEGF 轴是调控肿瘤血管生成的核心通路。传统中药黄芪-莪术药对在前期研究中展现出显著的抗肿瘤活性，但其通过调控缺氧微环境逆转耐药的机制尚未明确。本项目拟结合现代分子生物学技术，探索黄芪-莪术药对靶向 HIF-1α/VEGF 轴抑制血管生成、改善帕尼单抗耐药的科学机制，为中医药干预 CRC 的临床治疗提供新的思路和策略。
1. 担任大学生创新创业大赛“CAFs 源外泌体 miR-625-3p 靶向CPPED1/STAT3 通路参与结直肠癌免疫逃逸的机制研究”成员并获得省级立项。
2.曾作为第七届基础实验设计大赛项目成员，参与实验设计。
3.作为第四作者参与北大核心论文一篇，已录用，待见刊。
1.2023 年国家自然科学基金青年基金项（82305012）目：芍药汤通过干预CAFs 源外泌体 miR-625-3p 表达抑制结肠炎相关结直肠癌免疫逃逸的机制研究，主持；
2.2020 年山东省医药卫生科技发展计划项目（202002060904）：CAFs 源外泌体递送 miR-625-3p 靶向 CELF2/WWOX 通路参与结直肠癌 EMT 及耐药性的机制研究，主持；
3.2023 年度山东省中医药科技项目面上项目（M-2023043）：基于SCFAs/FAM46B/β-catenin 轴探讨芍药汤抑制结肠炎相关结直肠癌上皮间质转化的作用及机制研究，主持。
1.对本项目提供理论和技术上的指导，提出合理方案和建议，使项目更具可执行性；
2.对本项目所需实验室资源和材料资源协助沟通联络；
3.对本项目组成员的任务分配给予组织协调。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
程谨慧 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2023 课题设计，统筹课题运作，撰写报告及论文
王陈晨 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2023 蛋白及基因检测
赵子萱 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2023 动物模型建立及病理检测
李泽坤 中西医结合学院 针灸推拿学（本科） 2022 实验数据统计分析，查漏补缺
高佳音 中西医结合学院 中西医临床医学（本科） 2023 蛋白及基因检测
王雪莹 中西医结合学院 针灸推拿学（本科） 2023 耐药细胞株构建

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张颖 中西医结合学院 否

立项依据

  基于HIF-1α/VEGF轴探究黄芪-莪术改善结直肠癌裸鼠肿瘤微环境缺氧，抑制血管生成，阻断缺氧驱动的EGFR下游信号及旁路通路激活，改善帕尼单抗耐药的分子机制。
1.基于网络药理学预测黄芪-莪术治疗结直肠癌的主要信号通路及作用机制
 1.1 黄芪-莪术潜在化学成分的筛选、靶点获取及结直肠癌靶点的筛选
 通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，Swiss ADME平台(http: //www.swissadme.ch/)剔除肠道吸收能力及类药性较差的成分后，共获得黄芪-莪术活性成分16个。SwissTargetPrediction数据库选取各活性成分Probability>0的靶点共465个。在GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)等数据库中输入“Colorectal Cancer”检索，去重获得1601个关键靶点。
 1.2 绘制韦恩图及蛋白质互作网络(protein-protein interaction，PPI)
  Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)绘制韦恩图(见图1)。药物-疾病交集靶点共43个，STRING数据库获得蛋白互作图(见图2)。Cytoscape 3.9.1可视化，其中排名前5的靶点分别为RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、表皮生长因子受体(EGFR)、热休克蛋白90α型1(HSP90AA1)、视黄酸受体α型1(RARP1)、雌激素受体α(ESR1)。
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 图1 黄芪-莪术-结直肠癌交集靶点韦恩图            图2 PPI蛋白互作拓扑学分析网
 1.3 黄芪-莪术干预CRC“药材-有效成分-疾病靶点”网络的构建
  Cytoscape3.9.1可视化，筛选获得前7种关键成分，山奈酚(kaempferol,MOL000422)、槲皮素(quercetin,MOL000098)、华良姜素(Jaranol,MOL000239)，异鼠李素(isorhamnetin,MOL000354)，3,9-二甲氧基紫檀碱(3,9-di-O-methylnissolin,MOL000371)，黄芪异黄烷苷（(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol，MOL000380），二氢异黄酮(isoflavanone,MOL000398)。此7种化合物生物利用度均在40%-70%之间，据此推断可能为黄芪-莪术治疗CRC的关键成分。
 1.4 KEGG通路富集分析与GO功能富集分析
  KEGG信号通路富集分析和GO富集分析显示，EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)信号通路可能黄芪-莪术治疗结直肠癌的重要通路（见图3,4）。
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                                       图3 KEGG通路富集分析
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                                         图4 GO富集分析

 2.动物水平验证黄芪-莪术通过调控HIF-1α/VEGF轴抑制血管生成改善SW480-R移植瘤裸鼠帕尼单抗耐药的作用机制
 2.1 SW480耐帕尼单抗细胞株的制备
 通过长期低剂量递增暴露于帕尼单抗（起始浓度IC10），直至获得SW480稳定耐药细胞株（SW480-R）。
 2.2 黄芪-莪术水煎剂的制备
 取黄芪200 g、莪术200 g（课题组前期证实黄芪-莪术1：1配伍干预结直肠癌效果最佳），浸泡0.5 h，常规煎煮，合并滤液，浓缩，得到生药含量为1 g/mL的黄芪-莪术药液。按照临床等效剂量的1/2、1、2倍设置裸鼠等效剂量，根据《人体和动物体表面积换算等效剂量比表》折算，低、中、高剂量依次为3、6、12 g/kg。
 2.3 实验分组
  60只6周龄BALB/C裸鼠按体质量随机分为6组，即SW480-R组（MG），SW480-R+帕尼单抗组（PA），SW480-R+黄芪-莪术中剂量组（HE），SW480-R+帕尼单抗＋黄芪-莪术低剂量组（PAHE-L）、SW480-R+帕尼单抗+黄芪-莪术中剂量组(PAHE-M)、SW480-R+帕尼单抗＋黄芪-莪术高剂量组（PAHE-H）。
 2.4 CRC裸鼠造模与给药
取SW480-R制备细胞悬液，100ul（约含5×106个细胞）接种到裸鼠左侧腋窝皮下，构建结直肠癌皮下移植瘤裸鼠模型。细胞接种8d后，于裸鼠左侧腋窝皮下触及包块体积约100-150mm3视为造模成功，筛选后保证每组最少6只。造模成功后开始给药。PAHE-L、PAHE-M、PAHE-H组腹腔注射帕尼单抗（20μg/d，2次/周），同时灌胃黄芪-莪术煎剂(浓度分别为3、6、12 g/kg，1次/d)；PA组腹腔注射帕尼单抗（20μg/d，2次/周），灌胃等体积生理盐水；HE组腹腔注射等体积生理盐水，灌胃黄芪-莪术煎剂；MG组腹腔注射、灌胃等体积生理盐水。给药3周后处死裸鼠，取肿瘤组织，称重，备用。
 2.5 检测指标
（1）每周2次监测裸鼠的体重、食物和饮用水的消耗，观测裸鼠的一般生理状态；
（2）每2天测量肿瘤长径（L）、短径（W），计算肿瘤体积（V=0.5×L×W²）；
（3）计算抑瘤率：称量瘤重，抑瘤率=（模型组平均瘤重-各给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重* 100%；
（4）观察肿瘤病理及血管结构：HE染色；
（5）肿瘤细胞凋亡：TUNEL染色；
（6）相关蛋白和基因的表达：
1）缺氧相关指标：WB检测HIF-1α、CA9表达；
2）血管生成标记: 免疫组化（CD31染色）检测微血管密度（MVD），WB和PCR检测血管生成相关基因（VEGF/VEGFR2、
Ang-2）；
3）EGFR通路耐药相关分子：免疫组化和WB检测p-MET、p-HER2；
4）通路指标：免疫组化和WB检测EGFR信号通路及下游p-ERK、p-AKT蛋白水平。
2.6动物模型伦理审查流程
   为保障基于 HIF - 1α/VEGF 轴探讨黄芪-莪术抑制结直肠癌血管生成改善帕尼单抗耐药研究中的动物福利与实验科学性，在启动动物实验前，严格遵循伦理审查流程。
（1）精心准备伦理审查申请材料。涵盖裸鼠模型构建（60 只 BALB/C 裸鼠分组情况、细胞接种方式）、给药方案（黄芪 - 莪术剂量、频率及帕尼单抗使用）和检测指标（HIF - 1α、VEGF 表达等）。
（2）动物福利保障措施要具体，包括饲养环境（温度控制在 20 - 26℃，湿度保持在 40% - 70%，光照采用 12 小时明暗交替）、饮食供应（提供符合标准的鼠粮和清洁饮用水）及日常护理（每日观察裸鼠状态、定期清理饲养笼具等）。
（3）提供实验人员资质证明，并阐述 3R 原则遵循情况，如前期采用网络药理学预测减少动物实验数量、优化给药方式减少动物痛苦等。填写申请表格后提交至伦理审查委员会办公室。

 1.HIF-1α诱导的血管生成介导了结直肠癌EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药
  结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，其死亡率高居癌症相关死亡的第二位[1]。尽管手术切除联合放化疗可改善早期患者预后，但晚期或转移性CRC的治疗仍面临严峻挑战。近年来，靶向表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）的疗法（如帕尼单抗、西妥昔单抗）通过阻断EGFR信号通路，显著延长了大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Rat Sarcoma virus oncogene homolog，RAS）野生型患者的生存期[2]。然而，约50%的初期有效患者会在治疗12个月内出现获得性耐药，导致疾病进展甚至治疗失败[3]。耐药机制涉及肿瘤细胞内在的基因突变、旁路信号激活以及肿瘤微环境的动态调控[4]。其中，缺氧微环境驱动的缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-Inducible Factor-1 Alpha，HIF-1α）信号异常活化被认为是耐药的核心机制之一。
  实体瘤的快速增殖导致局部氧分压显著降低，形成缺氧肿瘤微环境。在CRC中，缺氧通过抑制脯氨酰羟化酶的活性，阻止HIF-1α的羟基化和泛素化降解[5]。HIF-1α通过转录诱导多种促血管生成因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），驱动肿瘤血管异常增生。VEGF与其受体结合为肿瘤血管生成提供有利环境，促进肿瘤细胞增殖、迁移和血管形成[6]，进而加剧了肿瘤的耐药性。然而，新生血管结构紊乱（如基底膜不连续、周细胞覆盖不足）导致血管渗漏和间质高压，限制药物在肿瘤组织内的均匀分布，形成“药物递送屏障”[7]。此外，HIF-1α还通过激活下游的AKT和ERK信号通路，直接促进肿瘤细胞的生存和增殖，而这些通路的异常活化是导致EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药的关键因素[8-9]。深入研究HIF-1α在CRC耐药中的作用机制，不仅有助于揭示耐药性的分子基础，还为开发针对性的联合治疗策略提供了新的思路。
 2.基于HIF-1α/VEGF轴的干预机制探讨中医视角下黄芪-莪术对结直肠癌的认识与应用
  中医学将CRC归属于“肠积”、“锁肛痔”等范畴，其核心病机为正气内虚、痰瘀互结、气滞血瘀。《素问病机气宜保命集》提出：“溲而便脓血，气行而血止，行血则便自愈，调气则后重自除”，强调气血失调是肠道病变的关键[10]。现代中医结合肿瘤微环境理论提出“缺氧-瘀毒”假说：机体正气不足，气血运行不畅，形成局部缺氧微环境，一方面激活HIF-1α信号，诱导VEGF等促血管生成因子释放，促进“瘀毒”蓄积；另一方面缺氧微环境中代谢紊乱，进一步加剧血管异常增生和肿瘤转移[11]。
  中医药在肿瘤治疗中具有“多通路、多靶点”的特性。本课题组前期证实，黄芪-莪术可以明显限制CRC荷瘤小鼠肿瘤生长，改善上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）进程，减轻奥沙利铂化疗耐药引起的毒副作用[12]（见前期研究基础）。黄芪-莪术药对源自张锡纯《医学衷中参西录》理冲汤，黄芪补气升阳养血，莪术破血行气消癥，黄芪得莪术则气血补而不致瘀滞，莪术得黄芪则瘀血去而气血不至伤损，补气不留淤，活血不伤正[13]。二者配伍攻补兼施：一者气化复元，消逐瘀毒；二者修荣血脉，畅通血道；三者去瘀生新，气血健旺，改善缺氧肿瘤微环境，抑制肿瘤血管生成。现代研究发现，黄芪-莪术还通过干预Wnt5/β-Catenin通路上调E-cadherin的表达抑制结直肠癌EMT进程[14]，抑制肿瘤的生长和扩散。但其是否能逆转EGFR靶向耐药及肿瘤血管生成是否关联尚待探讨。
  现代药理学机制分析发现，黄芪-莪术的核心成分均可通过抑制HIF-1α及其介导的VEGF表达，改善HIF-1α的表达，从而抑制肿瘤生长与转移。如黄芪有效核心活性成分异鼠李素、黄芪甲苷可下调HIF-1α蛋白稳定性，抑制VEGF转录[15]；莪术活性成分姜黄素可直接结合VEGFR2酪氨酸激酶结构域，阻断VEGF介导的血管内皮细胞增殖[16]；黄芪甲苷下调MET受体表达，阻断HGF/MET轴介导的耐药逃逸[17]。网络药理学预测显示，黄芪-莪术核心成分与EGFR耐药通路HIF-1α/VEGF高度关联（见研究内容-图3 KEGG富集分析），提示其可能通过调控缺氧微环境克服耐药。
   综上所述，本课题组提出项目假说：黄芪-莪术通过抑制HIF-1α/VEGF轴介导的血管生成，改善结直肠癌荷瘤裸鼠肿瘤微环境缺氧状态，促进肿瘤血管正常化，从而增强帕尼单抗的药物递送效率；同时通过阻断EGFR下游PI3K/AKT信号及旁路MET通路激活，逆转帕尼单抗耐药（见科学假说图）。本实验将采用多种分子生物技术进行动物在体实验验证，通过靶向肿瘤微环境与信号通路双重干预，为克服结直肠癌EGFR靶向耐药提供了中西医结合的新策略。
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              黄芪-莪术通过HIF-1α/VEGF轴抑制结直肠癌血管生成改善帕尼单抗耐药的作用机制科学假说图
                                                            主要参考文献目录
[1]黄理宾,黄秋实,and 杨烈."全球及中国的结直肠癌流行病学特征及防治：2022《全球癌症统计报告》解读."中国普外基础与临床杂志 31.05(2024):530-537.
[2]王白燕, et al. "结直肠癌靶向治疗相关生物标志物的研究进展." 中国老年学杂志 45. 11 (2025): 2792-2798.
[3]Zhou, Jing et al. “Resistance to anti-EGFR therapies in metastatic colorectal cancer: underlying mechanisms and reversal strategies.” Journal of experimental & clinical cancer research : CR vol. 40,1 328. 18 Oct. 2021, doi:10.1186/s13046-021-02130-2
[4]赵新斐, et al."缺氧介导的肿瘤微环境的免疫抑制及逆转方法."中国临床研究 36.03(2023):464-468.doi:10.13429/j.cnki.cjcr.2023.03.030.
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[8]Zhang, Zhen et al. “PI3K/Akt and HIF‑1 signaling pathway in hypoxia‑ischemia (Review).” Molecular medicine reports vol. 18,4 (2018): 3547-3554. doi:10.3892/mmr.2018.9375
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[13]张代峰,胡晨骏,and 胡孔法."网络药理学在中药领域的应用和展望."医学信息学杂志 45.06(2024):30-36+56.
[14]尹刚, et al."补气活血药重塑肿瘤缺氧微环境的研究思路."中华中医药杂志 37.02(2022):650-654.
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[17]Zhang, Shuo et al. “Synergistic Inhibitory Effect of Traditional Chinese Medicine Astragaloside IV and Curcumin on Tumor Growth and Angiogenesis in an Orthotopic Nude-Mouse Model of Human Hepatocellular Carcinoma.” Anticancer research vol. 37,2 (2017): 465-473. doi:10.21873/anticanres.11338
创新亮点：
1.首次揭示黄芪-莪术如何精准调控HIF-1/VEGF信号轴，为结直肠癌的抗血管生成治疗提供了全新的视角。
2.创新性地探索中药配伍在逆转帕尼单抗耐药性方面的潜在机制，开辟了肿瘤治疗的新路径。
项目特色：
1.巧妙地将传统中医药智慧与现代生物医学技术相结合，专注于HIF-1/VEGF这一关键信号通路，为改善缺氧微环境，抑制肿瘤血管生成提供了精准的治疗靶点。
2.通过从分子到细胞的全面分析，旨在为结直肠癌患者提供个性化的中西医结合治疗方案，提高帕尼单抗的治疗效果。同时强调临床转化潜力，研究成果有望直接应用于临床实践，改善患者预后。
1.技术路线
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                                                                                        技术路线图

2.拟解决的问题：
1. 黄芪-莪术是否通过调控HIF-1α/VEGF轴抑制血管生成？
2. 血管生成抑制如何促进帕尼单抗增敏？
3. 黄芪-莪术是否靶向EGFR下游及旁路耐药通路？

3.预期成果
1.预期发表高水平学术论文一篇。全面呈现基于 HIF-1α/VEGF 轴黄芪-莪术抑制结直肠癌血管生成改善帕尼单抗耐药的研究成果，为该领域研究提供参考。
2.申请 1 项与黄芪 - 莪术治疗结直肠癌关键成分及作用机制相关的发明专利，保护科研成果。
3.制定技术转化计划，积极寻求医药企业合作，推动研究成果向临床应用转化。
（预计研究年限 2025.06-2027.06）
2025.06-2025.12：
查阅文献,完成网络药理学分析；优化实验方案，确定耐药细胞诱导条件、设计裸鼠分组及给药方案、制定检测指标。
2026.01-2026.06：
构建SW480-R耐药细胞株并验证，裸鼠造模、分组给药，监测肿瘤的生长。
2026.07-2026.012：
组织检测（HE/TUNEL/CD3），分子机制验证（WB/PCR检测HIF-1α/VEGR/EGFR通路），实验数据统计、分析，相关实验补充，论文撰写。
2027.01-2027.06：
论文发表及成果鉴定，结题。
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
（1）指导教师取得的与本项目相关的研究工作成绩
  指导教师主要从事肿瘤发生的分子机制研究及中医药干预。
  指导教师应用基因过表达技术明确了肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药的关系，并验证了补中益气汤、黄芪多糖的干预效果。相关研究成果发表在中华中医药杂志和中国实验方剂学杂志上。随后结合外泌体示踪、RIP、慢病毒构建、Western blot、双荧光素酶报告实验等技术，创新性的提出并验证肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）递送miR-625-3p在结直肠癌增殖、侵袭、迁移、EMT、耐药中发挥作用的分子机制。该研究为防治结直肠癌提供新的靶点和思路。相关研究成果发表在 Pharmacological Research 上。
  以上相关研究工作使指导教师积累了大量关于肿瘤逃逸机制的经验，同时也熟练掌握了相关细胞生物学与分子生物学技术，能够满足指导本项目研究的需要。
（2）课题组已完成的与本项目相关的前期工作
  课题组前期研究发现，黄芪-莪术配伍可抑制结直肠癌MC38荷瘤小鼠上皮间质转化（EMT）并促进奥沙利铂化疗减毒增效，相关论文于2025年1月在World Journal of Traditional Chinese Medicine网络首发（中科院JCR三区，IF=4.3）。该研究将MC38荷瘤小鼠随机分为三组，模型组，奥沙利铂组，奥沙利铂+黄芪-莪术组，分别给予奥沙利铂和黄芪-莪术治疗。记录小鼠一般生理状态、体重变化及瘤重，通过HE染色观察肿瘤组织病理形态，TUNEL法检测细胞凋亡情况，并采用免疫组化、Western blot和实时荧光定量PCR技术检测EMT及耐药相关因子的表达。
   （1）提高荷瘤小鼠生存质量明显
 实验表明，奥沙利铂单药治疗导致小鼠生存质量显著下降（精神萎靡、毛发杂乱及体重持续降低），而黄芪-莪术联合奥沙利铂治疗后，小鼠体重下降幅度显著减小（较单药组），行为状态亦有所改善。模型组因肿瘤负荷出现体重异常增长。结果提示，黄芪-莪术联合用药可有效缓解奥沙利铂单药引起的生存质量恶化，显著优化小鼠整体生理状态（Fig.1）。
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                                                    Fig.1: 黄芪-莪术对小鼠体质量的影响。
(A).给药前小鼠体重比较。(B).给药后小鼠体重变化曲线。(C).处死前小鼠体重比较。(D).给药前和处死前对应组别的小鼠体重比较。数据采用均数±标准差表示。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
   （2）抑制肿瘤生长
  实验中，模型组小鼠的肿瘤生长速度最快，其次奥沙利铂组，黄芪-莪术联合奥沙利铂组最慢。处死小鼠并称重肿瘤组织后发现，模型组肿瘤体积和重量最大。奥沙利铂组和黄芪-莪术联合奥沙利铂组相较于模型组，肿瘤体积和重量均显著减小，且黄芪-莪术联合奥沙利铂组的效果更优于奥沙利铂组。此外，黄芪-莪术联合奥沙利铂组的肿瘤抑制率也显著高于奥沙利铂组（Fig. 2）。
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                                                   Fig. 2: 黄芪-莪术对移植瘤的影响。
(A).完整剥离的肿瘤组织。(B).肿瘤体积比较。(C). 肿瘤重量比较。(D). 抑瘤率。数据采用均数±标准差表示*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
   （3）促进结直肠癌细胞坏死和凋亡
  HE染色及Tunnel检测揭示，模型组肿瘤细胞坏死有限，细胞呈细长梭形，间隙大；奥沙利铂组细胞坏死增多，梭形细胞减少，细胞间隙缩小；黄芪-莪术联合奥沙利铂组细胞坏死和凋亡最为显著，核固缩和碎裂现象普遍，凋亡细胞数量显著高于其他两组，凸显了联合治疗在促进细胞坏死和凋亡方面的优势（Fig. 3）。
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                   Fig. 3: 黄芪-莪术对肿瘤组织病理和凋亡的影响。
(A).肿瘤组织病理形态。比例尺= 100 μm（200×）。(B).肿瘤组织病理形态差异。比例尺= 50 μm（400×）。(C,D).检测肿瘤细胞凋亡，计算凋亡率。数据使用均数和标准差表示=。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
  （4）抑制EMT进程
  免疫组化和蛋白印迹实验显示，奥沙利铂组和黄芪-莪术联合奥沙利铂组相较于模型组，E-cadherin蛋白表达增加，而N-cadherin蛋白表达减少，且黄芪-莪术联合奥沙利铂组的这种变化更为显著。实时荧光定量PCR结果也证实了这一趋势，即E-cadherin mRNA水平上升，N-cadherin mRNA水平下降，黄芪-莪术联合奥沙利铂组的变化尤为突出。这些结果表明，奥沙利铂和黄芪-莪术联合治疗可以通过调节EMT标志性蛋白的表达来抑制肿瘤进展（Fig. 4）。
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               Fig. 4: 黄芪-莪术对移植瘤EMT分子标志物E-cadherin、N-cadherin表达的影响。
(A).免疫组化检测E-cadherin、N-cadherin蛋白定位。(B,C).蛋白印迹检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达(B)并定量分析(C)。(D).Real-time PCR检测E-cadherin、N-cadherin mRNA表达。采用均数±标准差来表示。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
  （5）促进奥沙利铂增敏
  MRP1和P-gp是肿瘤细胞化疗耐药的关键蛋白，其阳性表达呈现为棕黄色颗粒，主要分布在细胞浆中，细胞膜上也有少量表达。与模型组相比，奥沙利铂组和黄芪-莪术联合奥沙利铂组的MRP1和P-gp蛋白表达均有所下降，其中黄芪-莪术联合奥沙利铂组的降低更为显著。蛋白印迹分析进一步证实，奥沙利铂组和黄芪-莪术联合奥沙利铂组的MRP1和P-gp蛋白灰度表达均低于模型组，且联合组的变化具有统计学意义。实时荧光定量PCR数据也显示，奥沙利铂组和黄芪-莪术联合奥沙利铂组的MRP1和P-gp mRNA水平均有所下调，黄芪-莪术联合奥沙利铂组的下调程度更为突出（Fig. 5）。
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                                  Fig. 5:黄芪-莪术对移植瘤耐药标志蛋白MRP1、P-gp表达的影响。
(A).免疫组化检测MRP1、P-gp蛋白定位。(B,C).蛋白印迹检测MRP1、P-gp蛋白表达(B)并定量分析(C)。(D).Real-time PCR检测MRP1、P-gp mRNA表达。采用均数±标准差来表示。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
（1）科研平台 科研平台和各实验室设有公共实验区、细胞培养室、标本处理室、微生物实验室、组织病理室、生物样本库、大型仪器设备间、生物信息中心、电镜室、办公室、会议室等单元，总建筑面积3000平方米。实验室拥FEI 120KV 透射电镜（2021年1月份安装，配备有RMC冷冻超薄切片机、修块机、制刀机、全自动染色机和脱水机）、小动物活体成像、microCT、激光片层扫描显微镜、德国蔡司Cell Discover7 活细胞自动化显微成像监控平台、德国蔡司LSM810激光共聚焦显微镜（带Airyscan模块）、蔡司Axio Imager Z2正置荧光显微镜（带 Apo Tome 2 ）、蔡司Axio Observer A1倒置荧光显微镜、德国美天旎密闭式流式细胞分选仪（MACSQuant Tyto）和美国贝克曼分析型流式细胞仪（DxFLEX）、细胞牵张拉伸应力加载培养系统、美国ABIQ5 和 BioRad 荧光定量 PCR 仪、多色荧光成像仪、小动物超声、冰冻切片机、石蜡切片机、ABI3500 遗传分析仪、原代细胞核转移系统、BioRad 电穿孔基因转移仪等一系列高、精、尖的仪器设备以及进行核酸和蛋白实验的常规设备，各类设备总价值达8000 余万元。实验室的生物信息中心配备有高性能服务器和工作站及相应的生物信息学软件，能够进行包括全基因组、转录组、蛋白质组等多种高通量测序数据的分析，并结合统计学习、机器学习等新兴技术对目标下游重要分子特征进行系统性研究。
（2）SPF 级动物实验室 SPF级动物实验室建筑总面积300余平方米的动物房，其中屏障环境200余平方米，辅助环境100余平方米。屏障环境内分为动物检疫室，动物饲养室、净物存放室，清洁走廊和污物走廊等几大部分，有独立通风笼盒系统(Individually Ventilated Cages, IVC)，生物安全柜，高压蒸汽灭菌器，拥有小动物吸入麻醉机、啮齿动物步态分析系统、水迷宫等行为学评估设备。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 13000.00 7000.00
1. 业务费 10000.00 无 3000.00 7000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 3000.00 参加学术交流 3000.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 7000.00 论文版面费 0.00 7000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 10000.00 动物（4000.00）、细胞（3000.00）、试剂盒（1900.00）、抗体（1100.00）等 10000.00 0.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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