济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

济宁医学院 创新创业管理系统

详情

DCLK1乳酸化修饰调控HIF-1α促进胃癌血管生成的机制研究

申报人：孙裔洵 申报日期：2025-03-19

基本情况

2025创新项目
DCLK1乳酸化修饰调控HIF-1α促进胃癌血管生成的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
临床医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
胃癌作为全球高发的恶性肿瘤，其侵袭与转移高度依赖肿瘤血管生成，其中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是调控血管内皮生长因子等促血管生成因子的核心因子，但其上游调控机制仍需深入探索。近年来，乳酸化修饰作为一种新型的蛋白翻译后修饰，在影响肿瘤细胞血管生成方面展现出巨大潜力。然而，乳酸化修饰在影响胃癌血管生成中的作用机制尚存在许多空白，亟待人们探究。DCLK1是一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛表达于多种肿瘤组织中。相关报道显示DCLK1与HIF-1α的表达量正相关，并且HIF-1α与DCLK1可能通过Notch通路存在潜在关联。同时本团队前期研究发现，DCLK1在肿瘤内皮细胞内的表达量显著高于一般内皮细胞，DCLK1的多个位点发生乳酸化修饰，并且DCLK1的高表达量与胃癌患者不良预后显著相关，这提示DCLK1乳酸化可能通过调控HIF-1α信号通路介导肿瘤血管生成，促进胃癌发生发展。因此，我们将主要针对DCLK1乳酸化能否增强HIF-1α的转录活性或稳定性，从而促进胃癌肿瘤血管生成的问题展开研究。
以第一作者身份一篇JCR 2区 SCI 期刊的文章under review；《第十一届全国大学生医学创新大赛》参与中。
作为山东省青创团队《纳米药物靶向肿瘤内皮代谢抗血管疗法研究创新团队》带头人，结题国家自然科学基金项目《非胰岛素激活的INSR介导FGF5/ADRB2信号 轴促进胃癌血性转移的机制研究》，结题中国博士后第72批面上项目《胰岛素激活的INSR通过ALDOC调控肿瘤血管内皮细胞代谢重编 程的机制研究》，立项山东省自然科学基金《胰岛素/INSR调控内皮细胞GOT2糖基化修饰促进胃癌血行转移的机制研究》，在《British journal of cancer》《Cell death and disease》发表中科院一区SCI论文多篇，获批中国发明专利一项。
指导老师提供课题思路、课题预实验数据。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
孙裔洵 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 总实验执行，数据汇总整理，论文撰写
赵玉宸 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 免疫共沉淀、免疫组化实验验证相互作用
王博艺 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 迁移实验，成管实验，乳酸化修饰抑制剂实验
张百川 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 TCGA数据库分析，IHC检测DCLK1表达
石居岳 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 构建细胞模型，双荧光素酶基因报告实验
崔如洁 临床医学院（附属医院） 临床医学(本科) 2024 IP实验富集DCLK1，液相色谱-串联质谱分析

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
王森 临床医学院（附属医院） 否

立项依据

（1）明确DCLK1与HIF-1α之间是否存在相互作用，以及与DCLK1乳酸化修饰水平是否相关。
（2）明确DCLK1的乳酸化修饰是否影响HIF-1α的稳定性和转录活性。
（3）明确DCLK1的乳酸化是否通过HIF-1α信号通路介导血管生成和迁移、侵袭能力的影响。

（1）分析DCLK1在胃癌细胞中的表达与定位及其临床意义。

1）TCGA数据库分析；2）购置胃癌组织芯片实验分析。

（2）验证DCLK1是否发生乳酸化修饰，以及进一步验证DCLK1与HIF-1α之间是否存在相互作用，DCLK1的乳酸化修饰能否增强它们的相互作用。
1）通过Western Blot实验分析胃癌细胞系泛乳酸化水平，分析癌旁细胞与癌细胞微环境的差异性。
2）免疫沉淀（IP）富集DCLK1后，通过Western Blot实验验证DCLK1是否发生乳酸化修饰。
3）通过免疫组化验证HIF-1α与DCLK1之间的相互作用及空间位置（核/质）关系。
4）构建去乳酸化和高乳酸化水平的胃癌细胞模型，进行免疫共沉淀（Co-IP）、WB实验，对比分析，评估DCLK1乳酸化水平与DCLK1和HIF-1α之间的相互作用的相关性。
（3）分析DCLK1的乳酸化修饰对HIF-1α稳定性和转录活性的影响，以及对胃癌细胞的血管生成和迁移侵袭能力的影响。
1）构建高乳酸化水平的稳定表达DCLK1的野生型胃癌细胞模型和高乳酸化水平的敲降DCLK1（siRNA）的胃癌细胞模型。
2）通过Western Blot实验分析HIF-1α的表达水平。通过双荧光素酶基因报告实验分析HIF-1α转录活性变化。
3）利用上述两种胃癌细胞模型，通过RT-PCR/qRT-PCR实验分析HIF-1α下游基因的mRNA水平变化。
（4）分析DCLK1的乳酸化修饰对胃癌细胞的血管生成和迁移侵袭能力的影响。
1）迁移与侵袭能力：通过Transwell实验评估两种胃癌细胞模型的迁移、侵袭能力，分析DCLK1的乳酸化修饰对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响。
2）血管生成：通过体外管状形成实验检测两种模型血管形成情况，分析DCLK1的乳酸化修饰对胃癌细胞的血管生成的影响。
乳酸诱导的乳酸化引起了各个生物学、医学学科的极大关注，乳酸化修饰已成为一个有前途的研究领域。最近的研究表明，乳酸化对细胞的蛋白质功能、信号转导、基因表达和免疫反应都产生了显著影响。这些过程在各种疾病，特别是肿瘤进展中起着关键作用[1-7]。这其中也不乏对缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)乳酸化的研究，HIF-1α乳酸化修饰能驱动前列腺癌中的血管生成和血管模拟[8]。此外，在胃癌中，乳酸化修饰可通过稳定HIF-1α的活性，上调血管内皮生长因子和血管生成相关基因的表达[9]。
对于DCLK1，相关报道显示DCLK1与HIF-1α的表达量正相关[10]，同时它能够通过激活Wnt/β-catenin、Notch和NF-κB等信号通路促进肿瘤进展[11-14]，一些文章也显示DCLK1在胃癌组织中高表达[15,16]。但是对于其乳酸化的研究尚存在较大空白。尽管现有报道未直接涉及DCLK1乳酸化，但基于乳酸化修饰的普遍性和其在肿瘤中的调控功能，以及我们预实验结果（对大量DCLK1的乳酸化位点进行了测定），我们相信DCLK1乳酸化在胃癌中对其他机制具有潜在的调控影响，DCLK1乳酸化将会作为未来癌症治疗的靶点，具有巨大的潜力。
参考文献：
[1] Zhang D, Tang Z, Huang H, et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 2019. 574(7779): 575-580.
[2] Su J, Zheng Z, Bian C, et al. Functions and mechanisms of lactylation in carcinogenesis and immunosuppression. Front Immunol. 2023. 14: 1253064.
[3] Chen AN, Luo Y, Yang YH, et al. Lactylation, a Novel Metabolic Reprogramming Code: Current Status and Prospects. Front Immunol. 2021. 12: 688910.
[4] Chen H, Li Y, Li H, et al. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature. 2024. 631(8021): 663-669.
[5] Chen Y, Wu J, Zhai L, et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 2024. 187(2): 294-311.e21.
[6] Sun L, Zhang Y, Yang B, et al. Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m(6)A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 2023. 14(1): 6523.
[7] Raychaudhuri D, Singh P, Chakraborty B, et al. Histone lactylation drives CD8(+) T cell metabolism and function. Nat Immunol. 2024. 25(11): 2140-2151.
[8] Luo Y, Yang Z, Yu Y, Zhang P. HIF1α lactylation enhances KIAA1199 transcription to promote angiogenesis and vasculogenic mimicry in prostate cancer. Int J Biol Macromol. 2022. 222(Pt B): 2225-2243.
[9] 佟柏峰, 王鑫, 孙晶. HIF-1α和VEGF-C在胃癌中的表达及意义. 国际遗传学杂志. 2010. 33(05): 272-276.
[10] 潘燕芳, 李秋云, 赵旁益, 姜海雅. 缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和双肾上腺皮质激素样激酶1?(DCLK1)在结直肠癌组织中的表达及临床意义. 大医生 2021年6卷10期 17-20页. 2021 : 2019年广西卫健委自筹经费科研课题项目.
[11] Zhou J, Zhou D, Zhang Q, et al. DCLK1 mediated cooperative acceleration of EMT by avian leukosis virus subgroup J and Marek's disease virus via the Wnt/β-catenin pathway promotes tumor metastasis. J Virol. 2024. 98(11): e0111224.
[12] Vanan AG, Vesal S, Seraj P, et al. DCLK1 in gastrointestinal cancer: A driver of tumor progression and a promising therapeutic target. Int J Cancer. 2025 .
[13] Broner EC, Trujillo JA, Korzinkin M, et al. Doublecortin-Like Kinase 1 (DCLK1) Is a Novel NOTCH Pathway Signaling Regulator in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Front Oncol. 2021. 11: 677051.
[14] Lai T, Qiu H, Si L, Zhen Y, Chu D, Guo R. Long noncoding RNA BMPR1B-AS1 facilitates endometrial cancer cell proliferation and metastasis by sponging miR-7-2-3p to modulate the DCLK1/Akt/NF-κB pathway. Cell Cycle. 2022. 21(15): 1599-1618.
[15] 陈琳. DCLK1和miR-217在胃癌中的表达及意义 ,2016.
[16] Afshar-Sterle S, Carli A, O'Keefe R, et al. DCLK1 induces a pro-tumorigenic phenotype to drive gastric cancer progression. Sci Signal. 2024. 17(854): eabq4888. 
（1）选题机制创新、进阶前沿：
本研究将乳酸化修饰这一新兴表观遗传调控机制与DCLK1-HIF-1α信号通路相结合（构建代谢-表观-血管生成三联调控轴），探索其在胃癌血管生成中的作用。DCLK1虽被报道与肿瘤干性及转移相关，但其翻译后修饰机制研究甚少。不同于传统缺氧依赖的HIF-1α激活路径，本项目提出肿瘤微环境中乳酸代谢驱动的DCLK1乳酸化修饰可能通过非经典途径增强HIF-1α的转录活性或蛋白稳定性，突破现有研究对HIF-1α调控机制的认知局限，为靶向肿瘤代谢-表观遗传交叉调控提供全新视角。
（2）临床意义显著：
DCLK1的高表达或乳酸化修饰水平可能作为胃癌血管生成活性及预后的生物标志物。提供新的靶向治疗策略：抑制DCLK1激酶活性，开发特异性激酶抑制剂，阻断其促血管生成功能；调控乳酸化修饰，通过靶向DCLK1去乳酸化修饰逆转异常修饰，恢复DCLK1的正常功能。联合治疗，若证实DCLK1的乳酸化通过HIF-1α信号通路介导血管生成，可直接利用现有靶点开发联合治疗方案（如抑制DCLK1乳酸化+HIF-1α抑制剂）。本项目开创了靶向乳酸化修饰联合抗血管治疗的新研究方向，具有显著的科学原创性与临床转化潜力。
（1）现有数据分析，研究DCLK1在胃癌细胞中的表达与定位及其临床意义（技术路线1）
1）TCGA数据库分析：利用TCGA数据库分析胃癌细胞和癌旁细胞内DCLK1基因的差异化表达情况。以及DCLK1的表达分析、生存分析、临床参数相关性分析。
2）购置胃癌组织芯片：胃癌组织芯片对DCLK1的表达进行检测，进行IHC检测DCLK1的表达，以及DCLK1的表达分析、生存分析、临床参数相关性分析。
技术路线1. 分析DCLK1在胃癌细胞中的表达与定位及其临床意义
summernote-img
（2）验证DCLK1是否发生乳酸化修饰，DCLK1与HIF-1α之间是否存在相互作用，以及DCLK1的乳酸化修饰能否增强它们的相互作用（技术路线2）
1）分析胃癌细胞系泛乳酸化水平：设置三组细胞系（胃癌旁组织、常规培养胃癌细胞系、乳酸/乳酸盐处理的胃癌细胞系）通过WB实验，得到各组泛乳酸化水平。对比分析癌旁细胞与癌细胞微环境的差异性。
2）验证胃癌细胞中DCLK1是否发生乳酸化修饰：
①通过乳酸/乳酸盐处理模拟肿瘤微环境的高乳酸水平，诱导发生乳酸化修饰，进行免疫沉淀（IP）实验，富集DCLK1，排除其他蛋白的干扰。②对DCLK1进行WB实验，检测DCLK1是否发生乳酸化修饰。③通过LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）分析，确定DCLK1的乳酸化位点。
3）验证DCLK1与HIF-1α之间是否存在相互作用：
①通过乳酸/乳酸盐处理模拟肿瘤微环境的高乳酸水平，诱导发生乳酸化修饰，进行免疫共沉淀（Co-IP），通过WB实验验证DCLK1复合物中是否存在HIF-1α（条带显著高于对照组），以确定DCLK1与HIF-1α之间是否存在相互作用。
②利用上述细胞进行免疫组化，通过免疫组化进一步验证乳酸化修饰的DCLK1与HIF-1α是否存在相互作用，尤其确定空间位置（核/质）关系。其中一抗采用不同源的乳酸化抗体、DCLK1抗体和HIF-1α抗体共同孵育。二抗使用不同酶标记或荧光标记。保证清晰对三种抗原的重合度和空间位置进行分析。
4）验证DCLK1与HIF-1α之间的相互作用是否受DCLK1乳酸化水平影响：
①利用胃癌细胞系（AGS）构建去乳酸化（LDHA抑制剂、HDAC3等）和高乳酸化水平（乳酸/乳酸盐处理等）的胃癌细胞模型。
②再次进行免疫共沉淀（Co-IP），通过WB实验分别得到两种细胞模型的HIF-1α条带，进行对比分析，评估DCLK1乳酸化水平与DCLK1与HIF-1α之间的相互作用的相关性。
技术路线2.分析DCLK1是否发生乳酸化修饰，DCLK1与HIF-1α之间是否存在相互作用，以及DCLK1的乳酸化修饰能否增强它们的相互作用
summernote-img
（3）研究DCLK1的乳酸化修饰对HIF-1α稳定性和转录活性的影响，及对胃癌细胞的血管生成和迁移侵袭能力的影响（技术路线3）
1）利用胃癌细胞系（AGS），构建高乳酸化水平的稳定表达DCLK1的野生型胃癌细胞模型和高乳酸化水平的敲降DCLK1的胃癌细胞模型（设计DCLK1特异性siRNA转染AGS细胞）。
2）对构建好的细胞模型提取核蛋白（HIF-1α主要位于细胞核中）。
①Western Blot实验：通过Western Blot实验分析HIF-1α的表达水平，对比两种细胞模型的结果，分析HIF-1α的表达水平与DCLK1乳酸化水平的相关性。
②双荧光素酶基因报告实验：进行双荧光素酶基因报告实验，检测两种胃癌细胞模型中HIF-1α的转录活性。对比两种细胞模型的结果，分析HIF-1α的转录活性与DCLK1乳酸化水平的相关性。
3）RT-PCR/qRT-PCR实验：利用上述两种胃癌细胞模型，通过RT-PCR/qRT-PCR实验分析DCLK1的乳酸化修饰是否影响HIF-1α下游基因的mRNA水平变化。
4）利用上述两种细胞模型进行迁移实验（或划痕实验）和成管实验，分析胃癌细胞迁移、侵袭能力以及血管生成能力与DCLK1乳酸化的相关性。
①迁移实验（Transwell实验）：对比两种细胞模型的结果，评估两种模型胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化，DCLK1乳酸化是否促进胃癌细胞迁移、侵袭能力增强。
②成管实验：内皮细胞选取人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行成管实验（胃癌肿瘤细胞通过分泌血管生成因子促进内皮细胞迁移、增殖和管状结构形成）。对比两种细胞模型的结果，分析DCLK1乳酸化是否增强胃癌细胞的血管生成的能力。
③乳酸化修饰抑制剂实验：对乳酸盐处理的胃癌细胞模型进行去乳酸化处理，再次进行迁移实验和成管实验，观察迁移、侵袭以及成管能力是否减弱。
技术路线3. 研究DCLK1的乳酸化修饰对HIF-1α稳定性和转录活性的影响，及对胃癌细胞的血管生成和迁移侵袭能力的影响
summernote-img
预期成果：
（1）明确DCLK1与HIF-1α之间存在相互作用，并且作用强度与DCLK1乳酸化水平正相关。
（2）明确DCLK1的乳酸化修饰通过增强HIF-1α稳定性和转录活性，促进胃癌细胞的迁移、侵袭能力以及血管生成能力增强，导致胃癌的发生发展。
（3）以本项目研究成果发表 Q3-Q2区SCI论文 1 篇。
2025.4.1-2025.4.10 TCGA数据库分析，以及DCLK1的表达分析、生存分析、临床参数相关性分析。
2025.4.10-2025.4.31 购置胃癌组织芯片，胃癌组织芯片对DCLK1的表达进行检测，进行IHC检测DCLK1的表达，以及DCLK1的表达分析、生存分析、临床参数相关性分析。
2025.5.1-2025.6.31 进行Western Blot实验分析癌旁细胞与癌细胞微环境乳酸化水平差异。
2025.7.1-2025.8.31诱导高乳酸水平胃癌细胞，进行免疫沉淀（IP）实验，富集DCLK1。
2025.9.1-2025.10.31 对DCLK1进行WB实验，检测DCLK1是否发生乳酸化修饰。③通过LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）分析，确定DCLK1的乳酸化位点。
2025.11.1-2026.1.31 用高乳酸水平胃癌细胞，进行免疫共沉淀（Co-IP），通过WB实验验证DCLK1复合物中是否存在HIF-1α（条带显著高于对照组），分析DCLK1与HIF-1α之间是否存在相互作用。
2026.2.1-2026.2.28 用高乳酸水平胃癌细胞进行免疫组化，进一步验证乳酸化修饰的DCLK1与HIF-1α是否存在相互作用，尤其确定空间位置（核/质）关系。
2026.3.1-2026.4.30 用胃癌细胞系（AGS）构建去蛋白乳酸化（LDHA抑制剂、HDAC3等）和高乳酸化水平（乳酸/乳酸盐处理等）的胃癌细胞模型。再次进行免疫共沉淀（Co-IP），通过WB实验分别得到两种细胞模型的HIF-1α条带，进行对比分析，评估DCLK1乳酸化水平与DCLK1与HIF-1α之间的相互作用的相关性
2026.5.1-2026.5.31 设计DCLK1特异性siRNA转染AGS细胞，以构建胃癌细胞系（AGS），构建高乳酸化水平的稳定表达DCLK1的野生型胃癌细胞模型和高乳酸化水平的敲降DCLK1的胃癌细胞模型
2026.6.1-2026.6.30 进行Western Blot实验分析HIF-1α的表达水平，对比两种细胞模型的结果，分析HIF-1α的表达水平与DCLK1乳酸化水平的相关性。
2026.7.1-2026.7.31 进行双荧光素酶基因报告实验检测HIF-1α的转录活性，对比两种细胞模型的结果，分析HIF-1α的转录活性与DCLK1乳酸化的水平的相关性。
2026.8.1-2026.8.31 进行RT-PCR/qRT-PCR分析HIF-1α下游基因的mRNA水平变化，分析HIF-1α下游基因的mRNA水平与DCLK1乳酸化的相关性。
2026.9.1-2026.9.30 进行迁移实验，分析两种模型胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化。
2026.10.1-2026.10.31 进行成管实验，分析分析DCLK1乳酸化是否增强胃癌细胞的血管生成的能力。
2026.11.1-2026.12.31 进行乳酸化修饰抑制剂实验，再次进行迁移实验和成管实验，观察迁移、侵袭以及成管能力是否减弱。
2027.1.1-2027.4.31 总结发表 Q3-Q2区 SCI 论文 1篇. 
（1）项目负责人以第一作者身份一篇有关乳酸化的JCR 2区 SCI 期刊的文章under review。
（2）得到了预实验结果：
summernote-img
TEC：肿瘤内皮细胞；EC：内皮细胞。
通过乳酸化修饰组学，在小鼠皮下肿瘤分选出肿瘤内皮细胞和正常内皮细胞，检测出差异乳酸化修饰蛋白和位点。并且结合蛋白质组学数据，发现DCLK1在肿瘤内皮细胞表达高于正常内皮细胞。
1）DCLK1在肿瘤内皮细胞内的表达量显著高于一般内皮细胞。
2）对大量DCLK1的乳酸化位点进行了测定。

summernote-imgsummernote-img
3）通过GEPIA 在线网站，分别分析了结直肠癌、胃腺癌、肾透明细胞癌中DCLK1表达量与患者生存期及预后的相关性。其中在胃腺癌中，DCLK1高表达量与患者不良预后显著相关。
取得预实验结果，其他具体机制亟待进行研究证实，将在项目通过后继续研究。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 项目执行 8000.00 12000.00
1. 业务费 2000.00 版面费 0.00 2000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 2000.00 版面费 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 18000.00 购置耗材 8000.00 10000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

版权所有： 南京先极科技有限公司        

访问量：0001176293