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缺氧间充质干细胞外泌体通过减轻线粒体氧化应激改善大鼠早发性卵巢功能不全

申报人：王秋如 申报日期：2025-03-19

基本情况

2025创新项目
缺氧间充质干细胞外泌体通过减轻线粒体氧化应激改善大鼠早发性卵巢功能不全 学生申报
创新训练项目
理学
生物科学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
早发性卵巢功能不全(POI)是女性生育力下降甚至丧失的主要原因。环磷酰胺（CTX）作为肿瘤常用化疗药物，可导致POI。人脐带间充质干细胞（hucMSCs）来源的外泌体对化疗性POI治疗作用及机制，目前尚未完全清楚。本研究拟在低氧（HExos）和常氧（NExos）条件下，分析二者生物学特征和POI修复作用。利用CTX构建POI大鼠模型，尾静脉注射NExos或HExos，研究比较二者对POI大鼠体重、卵巢重量系数、动情周期、卵巢形态、性激素水平、排卵数量以及体外胚胎发育力的影响。采用CTX处理KGN细胞系，建立卵巢颗粒细胞损伤模型，研究NExos和HExos对细胞增殖、凋亡、氧化应激和线粒体膜电位的影响。RT-qPCR探究二者对SIRT3、SOD2、PGC1a和TFAM表达的影响。WB检测凋亡相关蛋白cleaved caspase3、 caspase3、Bax和P53在细胞中的表达，揭示NExos或HExos通过SIRT3/PGC-1α信号通路修复卵巢早衰的作用及机制。尾静脉和卵巢原位注射不同剂量HExos，优化POI治疗策略，以期为hucMSCs来源外泌体临床应用研究提供理论和数据支撑。
      负责人作为细胞与发育生物学课题组组员和校创新创业工作坊坊员，长期从事人脐带间充质干细胞外泌体修复POI的作用研究，能熟练开展项目相关动物、细胞和分子实验操作。

      指导教师作为创新创业导师、创新创业工作坊负责人和日照市科技副总，长期从事干细胞细胞与生殖发育相关研究，近年来，主持山东省企业创新能力提升项目1项，山东省高校科研计划项目1项，日照市重点研发计划项目1项，横向课题3项，济宁医学院博士基金1项，济宁医学院科研计划重点项目1项，贺林院士临床转化工作站科研基金项目1项。指导学生立项国家级大学生创新创业计划3项，省级优秀学士论文1项，指导学科竞赛获国家级三等奖3项，省级一等奖3项、二等奖6项，校级一等奖2项。
      项目完成后，预期构建一套用于POI治疗的hucMSCs外泌体生产工艺和质量评价体系，开发一种基于外泌体及的新型治疗POI药物和治疗策略。对解决我国女性患癌群体化疗后生殖健康问题具有重要意义。基于此，指导教师在本项目的实验设计、实验材料的购置、实验开展以及论文撰写等方面都会给予全力指导和支持。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
王秋如 生命科学学院 生物信息学（本科） 2023 项目设计及组织实施
刘志昊 生命科学学院 生物工程（本科） 2023 POI模型构建与评估
郑衍运 生命科学学院 生物技术（本科） 2022 数据记录及统计分析
冯歆月 生命科学学院 生物技术（本科） 2023 细胞模型构建及评估
李群 生命科学学院 生物工程（本科） 2022 外泌体修复分子机制
陈佳慧 生命科学学院 生物技术（本科） 2023 外泌体分离及表征

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
武艳群 生命科学学院 否

立项依据

      环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）作为临床常见的化疗药物，可诱导早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency， POI）导致女性面临生育力丧失、长期内分泌紊乱等风险，严重影响生育健康。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSCs）来源的外泌体（Exosome，Exos）因其低免疫原性及高效旁分泌活性可通过调控颗粒细胞凋亡、减轻线粒体氧化应激、重塑卵泡微环境等途径缓解POI进展。然而，关于hucMSCs来源的常氧（normoxic exos，NExos）与低氧（hypoxic exos，HExos）预处理外泌体和对化疗性POI的治疗作用差异，尤其是低氧环境是否通过调控颗粒细胞凋亡、线粒体氧化应激增强其延缓卵巢衰老的疗效及分子机制，目前尚不完全清楚。
      本研究分离hucMSCs来源的NExos和HExos，CTX诱导构建POI大鼠模型，系统性比较常氧与低氧预处理外泌体对卵巢功能的改善作用，利用CTX诱导人卵巢颗粒细胞KGN构建细胞损伤模型，探究比较NExos与HExos对KGN细胞凋亡、线粒体ROS代谢及线粒体膜电位的调控作用。进一步结合SIRT3抑制剂（3-TYP）干预实验，阐明HExos激活减轻氧化应激、修复POI的作用机制，估优化HExos修复POI的最佳策略，为开发靶向线粒体功能的POI治疗策略提供理论依据。
1.NExos和HExos的制备与表征
      常氧（21% O₂）和低氧（1% O₂）条件下培养48h收获hucMSCs上清液，分离NExos和HExos。采用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、WB对比HExos 和NExos的生物学差异和外泌体制备量。
2.动物模型评估NExos和HExos对POI大鼠卵巢的修复作用
      6-8周龄SD大鼠腹腔注射CTX构建POI模型。将大鼠分为对照组、模型组、NExos组和HExos组，尾静脉注射PBS或外泌体。检测各组大鼠体重、动情周期、激素水平、卵巢系数、血清氧化指标和卵巢细胞凋亡情况，IVF实验检测各组大鼠排卵数量、卵子受精率及胚胎发育情况，评估NExos和HExos对POI大鼠卵巢功能的修复作用。
3.细胞模型检测NExos和HExos对颗粒细胞损伤的保护作用
      将Dio荧光染料标记外泌体与KGN细胞进行共培养。共聚焦显微镜观察KGN细胞对Exos的内吞作用，采用CTX诱导KGN细胞，构建颗粒细胞损伤模型，将细胞分为对照组、模型组、NExos组和HExos组，采用CCK8、流式细胞术、DCFH-DA荧光探针和JC-1探针检测胞内ROS和线粒体膜电位水平变化，研究NExos和HExos对颗粒细胞损伤的保护作用。
4.探究分析NExos和HExos修复POI卵巢的机制
      通过转录组和代谢组学揭示NExos和HExos修复POI卵巢和颗粒细胞作用的代谢网络调控通路。qRT-PCR检测动物和细胞实验各组基因调控网络中相关差异基因的转录表达情况，WB检测各组卵巢和颗粒细胞凋亡、氧化应激和线粒体功能相关蛋白及下游信号蛋白的表达情况，深入探究NExos和HExos修复POI的分子机制和信号通路。
5.评估优化HExos修复POI的最佳策略
      采用微静脉注射和原位注射低、高、中剂量的HExos，检测各组大鼠体重、动情周期、激素水平、卵巢系数、血清氧化指标和卵巢细胞凋亡情况，IVF实验检测各组大鼠排卵数量、卵子受精率及胚胎发育情况，自然交配大鼠产仔数量。优化HExos对POI大鼠卵巢功能修复的最佳策略。
      卵巢功能下降是个循序渐进的过程，早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency，POI)是发生于40岁之前女性的妇科内分泌疾病，伴随着闭经、血清促卵泡激素（FSH）升高和雌二醇（E2）降低等症状[1,2]，会引起类围绝经综合征的表现，也会诱发骨质疏松、缺血性心脏病、自身免疫性疾病等并发症，对女性的身心和生殖健康产生严重危害[3]。据统计，约有8%的30至40岁女性患有POI[4]，且随着社会经济迅速发展、女性的压力增加以及环境因素的影响，POI的发病率逐年上涨，呈现年轻化趋势。研究表明，引起POI发病的原因较多，自身免疫、遗传、环境、药物和应激因素等都可能引起卵巢功能的减退，发病机制尚未完全明确[5,6]。
      近年来，恶性肿瘤表现为高发病率、死亡率和日益年轻化趋势，严重威胁人类生命健康。化疗是通过化学药物来遏制肿瘤细胞增殖、浸润、转移，最终杀死肿瘤细胞的一种治疗方法，其中环磷酰胺一直作为一线药物被广泛使用[7]。临床发现，由于卵巢对化疗药物极其敏感，女性肿瘤患者在化疗后常会出现严重的卵巢功能损伤，导致卵巢储备减少，进而引发化疗源性卵巢早衰，表现出低雌激素和高促性腺激素特征的性器官萎缩、继发性闭经及潮热、心烦等更年期症状，且与正常人群相比不孕不育几率提高38%，严重影响患者身心健康和生活质量[8]。已有研究表明，化疗药物导致POI的主要路径包括细胞凋亡、原始卵泡过度激活以及卵巢微血管损伤[9,10]，但许多相关机制尚待进一步阐明。
      目前临床治疗POI的方法多种多样，主要包括激素替代治疗(HRT)、免疫疗法、中西医结合和心理治疗等[11-13]。目前POI的常规治疗方法是HRT，该治疗方法虽然能够弥补由于POI造成的雌激素水平不足的情况，改善患者因为激素水平下降导致的各种生理不适，但无法有效逆转POI患者的卵巢功能，而且长期治疗会增加患者发生女性生殖系统肿瘤、乳腺癌以及血管栓塞性疾病的风险[14]。同时，随着我国生育年龄的推迟和三胎政策的放开使得部分POI患者仍存在生育需求。近年来发展出的卵母细胞和胚胎冷冻保存、卵巢组织移植治疗法等新技术，因存在不同程度的治疗局限性、操作侵袭性和质量不可控性，在临床应用中受到一定的限制[15,16]。基于此，亟需寻找一种简单易行、微创的治疗方案，有效缓解化疗性卵巢功能损伤。
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图1 目前常见的POI治疗策略
      脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UCMSCs)是来源于医疗废弃物脐带中的一种多潜能成体干细胞，与其它成体干细胞相比，因其具有来源广泛，取材便利，免疫原性低，更强的自我更新和分化能力等优势，被认为是最具临床应用前景的成体干细胞之一。已有研究表明，脐带间充质干细胞主要是通过旁分泌机制产生的细胞因子而非直接分化为生殖相关细胞而改善卵巢功能[17]。多个研究发现，注射UCMSCs可显著促进POI动物模型的卵泡生长，增加其血清中孕酮、雌二醇和抗苗勒氏管激素的水平，恢复发情周期[18-20]。Zheng等利用UCMSCs移植修复化疗引起的卵巢损伤，结果表明，UCMSCs移植可改善化疗性POI小鼠的卵泡生长和激素分泌紊乱[21]。Yang等人研究结果显示，UCMSC移植可恢复化疗诱导的POI的雌性小鼠的卵巢功能，刺激卵巢血管生成，恢复POI小鼠发情周期。Jalalie等人在环磷酰胺(CTX)诱导的POI的小鼠中注射UCMSCs，其能够迁移到受损组织并通过调节免疫系统和分泌生长因子来发挥修复作用[22]。虽然很多研究表明人脐带间充质干细胞对卵巢早衰动物具有一定修复功能，然而，由于卵巢损伤后局部炎症微环境限制了移植细胞的存活和疗效，且外源细胞介入生殖系统可能导致伦理问题，干细胞移植治疗卵巢早衰在临床应用中仍存在一定的局限性。
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图2 脐带间充质干细胞修复POI的作用机制
      外泌体是一类由细胞释放的纳米级细胞外囊泡，具有磷脂双分子层结构，粒径大小约为30-150nm。1983年，外泌体首次在绵羊网织红细胞中被发现，1987年，Johnstone等正式将其命名为“外泌体”。外泌体可与邻近细胞的胞膜发生融合，形成一种细胞间信息传递系统。人脐带间充质干细胞来源外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived exosomes，hucMSC-Exos)，是从体外培养的hucMSCs培养液中提取分离的纳米囊泡。近年来，由于hucMSC-Exos具有来源广泛，较低的免疫原性、跨越生物屏障的能力以及较少的安全伦理问题，已成为非细胞生物治疗的研究的热点。
      最新研究显示，hucMSC-Exos可通过Hippo通路恢复卵巢颗粒细胞促卵泡激素受体表达并促进体内卵巢颗粒细胞增殖，改善POI卵巢功能和生殖能力；并且当关键Hippo分子被阻断时，治疗效果被抑制，从而说明Hippo通路在外泌体治疗POI过程中的必要性[23]。此外，另一实验选发现，外泌体处理后大量卵细胞中Foxo3a出核，伴有mTOR信号通路相关蛋白磷酸化程度升高，且原始卵泡被大量激活；在加入通路抑制剂及肝素以后，原始卵泡的激活作用可被抑制，有力证明了hucMSC-Exos可通过影响卵母细胞的mTOR通路激活休眠的原始卵泡，恢复小鼠的生育能力[24]。DING等[25]研究发现hucMSC-Exo可通过激活miR-17-5P抑制SIRT7及其下游靶基因的表达，从而抑制卵巢内各种细胞的凋亡。间充质干细胞外泌体及miRNA在POI疾病的治疗中表现出巨大潜能，包括促进增值、抑制凋亡、激素分泌、氧化应激和抗炎作用等[26,27]，但其对化疗性POI的修复功能及作用机制鲜有报道。
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图3 卵巢卵子激活的 PI3K 信号途径
      不同来源、不同环境的外泌体其功能存在显著差别[28]。低氧张力是一种与缺血环境相关的常见情况，可以通过激活糖酵解途径来提高细胞的增殖和遗传稳定性、促进分化潜能并上调干细胞基因包括Oct4、Nanog和Sox2 的表达，还会导致低氧诱导因子1α的激活，对血管内皮生长因子等多种生长因子具有较强的生物调节作用，最终可以提供更好的间充质干细胞状态，增加间充质干细胞的旁分泌和迁移能力[29]。已有研究表明，不同的细胞经相同或不同浓度的低氧条件和不同处理时间诱导，产生的外泌体具有不同的作用。与常氧 (21%O2) 条件相比，细胞在低氧 (1%O2) 条件下预处理6 h时，衍生的外泌体可促进共培养细胞的成熟[30]，而采用同一浓度预处理细胞48 h来源的外泌体，更加有效地促进了内皮细胞血管形成，还可以触发抗凋亡、免疫调节以及抗氧化应激反应等[31]；另有研究也表明，采用体积分数1%-3%的低氧预处理间充质干细胞12 h或1周获得的外泌体，可以显著诱导抗氧化应激反应，减轻细胞损伤]。目前对于低氧诱导hucMSC产的外泌体在化疗性卵巢早衰方面的修复功能尚未见报道。
      本实验拟采用超速离心法分离提取培养上清液中的外泌体，制备hucMSC-Exos，模拟卵巢早衰微环境条件采用不同浓度氧处理，通过体内体外实验探索不同诱导条件下hucMSC-Exos对化疗性卵巢早衰及氧化损伤颗粒细胞的修复作用及分子机制，进一步优化卵巢早衰治疗性外泌体的培养条件，以期为临床预防和治疗化疗性卵巢早衰提供新策略。
参考文献
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  1. 系统分析NExos和HExos生物学特征及POI修复作用，探究二者存在差异的机制；
  2. 采用多组学手段，创新性揭示HExos通过减轻氧化应激修复化疗性POI分子机制；
  3. 首次评估优化HExos修复POI治疗策略，为临床POI治疗策略选择提供数据支撑。
1.研究技术路线
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2.拟解决的问题
（1）明确HExos通过SIRT3/PGC-1α信号通路改善化疗性POI核心分子调控机制；
（2）阐明低氧预处理增强hucMSCs外泌体抗氧化应激与线粒体修复能力分子基础；
（3）评估优化HExos修复POI的最佳策略。
3.预期成果
（1）揭示 HExos 修复卵巢功能的科学机制和治疗策略，为 POI 治疗提供数据支撑。
（2）项目负责人作为第一作者发表论文 1-2 篇；
（3）项目负责人前三受理相关国家发明专利 1 项；
（4）获省级以上学科竞赛奖项 1-2 项。
1.准备阶段
2025年1月-2025年2月，hucMSCs培养及低氧预处理优化
2025年3月-2025年6月，NExos和HExos分离，POI模型建立
2.实施阶段
2025年7月-2026年4月，构建CTX诱导的POI大鼠模型，分组干预
2026年5月-2025年7月，建立KGN细胞氧化应激模型，分组干预
2026年8月-2026年11月，多组学分析修复POI机制
2026年12月-2027年1月，优化HExos修复POI策略
2027年2月-2027年3月，整合动物与细胞实验数据，进行统计学分析
2027年4月-2027年5月，撰写论文初稿，申请专利
3.总结阶段
2027年6月，提交结题报告和各项资料，申请结题。
      1.1 常氧/缺氧条件下hucMSCs的表征
      观察显示，hucMSCs 在常氧和缺氧条件下均呈现成纤维细胞样形态、纳米颗粒跟踪分析法测得常氧和缺氧条件下培养的 hucMSCs 数量、粒径分布、细胞活力均无明显差异（图
1A-C）。流式细胞术分析显示，hucMSCs 表达间充质标志物 CD90、CD73、CD105，不表达造血标志物 CD45、CD34、HLA-DR（图 1D）。
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图1 常氧/缺氧条件下hucMSCs的表征A.hucMSCs在常养和缺氧下形态特征（1mm）；B.常氧和低氧条件下培养的hucMSCs数量；C.CCK8测定细胞活力；D.流式分析 hucMSCs 的表面标志物表达情况
      1.2hucMSC-NExos和hucMSC-HExos的表征
      透射电子显微镜观察显示，NExos 和 HExos 均为圆形囊泡；NTA 结果显示，NExos 和HExos 的尺寸无显著差异（图 2A、C、D）；WB 分析证实，表达外泌体标志物 CD81、Syntenin，不表达 Calnexin（图 2B）。缺氧条件下，HExos 的浓度显著高于 NExos（图E）。qPCR 结果显示，HExos 中 HIF1α 的水平显著高于 NExos（图 2F）。
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图2 hucMSC-NExos和hucMSC-HExos的表征A.：NExos和HExos的透射电子显微镜（TEM）图像；B.Western blot分析检测NExos和HExos的外泌体标志物。C.纳米颗粒跟踪分析（NTA）评估NExos和HExos的尺寸和浓度。；D.qPCR检测NE8xos和HExos中HIF1α的mRNA水平
      1.3 HExos对POI大鼠的体重和卵巢功能的有效改善
      POI 大鼠模型建立，外泌体治疗显示，HExos 组大鼠体重恢复显著，卵巢重量、卵巢系数显著高于 NExos 组（图 3A-D）。HExos 组大鼠动情周期恢复更显著（图 3E、F）。HExos 组血清 FSH 水平显著降低，E2 水平显著升高，效果优于 NExos 组（图 3G、H）。
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图3.HExos对POI大鼠的体重和卵巢功能的有效改善A.POI 大鼠治疗过程示意图；B.各组大鼠体重变化；C.不同组大鼠卵巢大小；D.各组大鼠卵巢重量变化；E.各组大鼠卵巢重量系数；F.不同组大鼠动情周期曲线；G.不同组大鼠动情周期数；H.各组大鼠血清 FSH 水平；I.各组大鼠的血清 E2 水平
      1.4 HExos比NExos更有效地改善POI大鼠的卵巢形态和卵泡发育
      与 NExos 组相比，HExos 组卵巢组织结构呈现更显著的形态学恢复，表现为各级卵泡数量明显增加（图 4A）。HExos 组初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡计数较 NExos 组显著增加（P<0.05）（图 4B），HExos 组经超排卵后获得的成熟卵母细胞数量显著多于 NExos 组（图 4C, D）。外实验证实，HExos 组的体外受精成功率（图 4E）及后续囊胚形成率（图4F）均显著优于 NExos 组。
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图4 POI大鼠的卵巢形态和卵泡发育的有效地改善A.卵巢组织切片组织病理学图像（1 mm）；B.不同发育阶段的卵泡数量统计；C.体外胚胎发育的明场图像（从上到下、从左到右：卵丘-卵母细胞复合体、带有第二极体的受精卵、正常发育胚胎）；D.超排卵后每组的卵母细胞数量；E.体外受精后两细胞胚胎的受精率；F.正常发育胚胎的百分比
      本项目依托日照校区生物医药科研平台，并联合日照市细胞工程重点实验室开展。平台建有本项目所需细胞培养室、SPF级动物实验室，并配有扫描电子显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、流式细胞仪、实时荧光定量PCR仪等高端仪器设备，能够完全保障本项目的顺利实施。项目组学生作为细胞与发育生物学课题组组员和校创新创业工作坊坊员，长期跟随指导教师开展动物模型和细胞模型建立，能熟练开展本项目相关实验操作。
      目前尚未发现缺少的条件。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 本项目的实施 14000.00 6000.00
1. 业务费 10000.00 无 6000.00 4000.00
（1）计算、分析、测试费 5000.00 无 4000.00 1000.00
（2）能源动力费 2000.00 无 2000.00 0.00
（3）会议、差旅费 3000.00 无 0.00 3000.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 0.00 无 0.00 0.00
2. 仪器设备购置费 10000.00 无 8000.00 2000.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 0.00 无 0.00 0.00
结束

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