1、血管内皮细胞衰老是高血压发展的关键因素
目前为止，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）在世界范围内占居民总死亡原因的首位，而血压升高是导致心血管疾病和全因死亡的主要可预防因素[1, 2]。现代医学治疗高血压病以降压药物、合理膳食为主，虽然有一定的效果，但不能有效阻止其发展及恶化[3]。其中，人口老龄化加剧是主要危险因素，也是CVD发病机制的一个重大全球健康挑战[4]。衰老对心脑血管疾病的影响不仅是由于其它危险因素的增加，而且是由于其本身独立和不可避免的影响[5]。大量流行病学研究表明，血管老化可引起血管内皮功能异常，是心脑血管疾病死亡的主要诱因之一[6]。血管内皮细胞衰老是血管老化的驱动因素和关键标志，在高血压等血管功能障碍疾病的发病过程中起着至关重要的作用[7]。因此，研究细胞衰老的发生机制并采用有效手段积极预防甚至逆转，对高血压的预后具有重要意义。
细胞衰老包括因生理性细胞增殖分裂引起的复制性衰老，以及刺激性诱因导致的过早衰老。二者机制不同，所以，在疾病发展过程中抑制刺激性诱因导致的细胞过早衰老显得尤为重要。众所周知，高血压介导多种慢性细胞应激过程，包括内质网应激、氧化应激、DNA损伤、应激诱导的衰老和促炎过程等[8, 9]。研究表明，通过抑制血管内皮细胞氧化应激可以阻断细胞过早衰老，延缓血管老化，从而改善血管内皮功能，预防高血压等心血管疾病[10-12]。
2、通窍活血汤通过抑制细胞氧化应激和衰老改善高血压血管内皮功能
高血压的临床治疗常根据患者的个体差异而采用不同的药物治疗，尽管多种降压药物的联合使用在一定程度上可放大治疗效果，但长期或不合理使用降压药物仍会导致各种不良反应，严重影响患者的预后。因此，高血压病的防治亟需寻找有效的补充与替代疗法，而中医药在高血压病患者的防治中取得了显著且安全的疗效[13, 14]。中医文献中并没有与高血压相对应的病名，现代中医学根据其临床表现将其归属于“眩晕”“头痛”“风阳”等病证范畴。众所周知，高血压是一组以动脉血压持续升高为主的血管综合征，这正与《黄帝内经》中的“脉胀”理论相符合。《灵枢·胀论》云：“黄帝曰：脉之应于寸口，如何而胀？岐伯曰：脉大坚以涩者，胀也。”脉胀即血脉胀满，是以“脉搏胀满”为特征的一类疾病，病位在血脉。《灵枢·胀论》又云：“营气循脉，卫气逆为脉胀”，指出脉胀是由于营卫气血在脉内运行异常，最终导致血脉压力增大，血脉胀满的疾病。此外，《灵枢·决气》曰：“壅遏营气，令无所避，是谓脉......脉道以通，血气乃行”，指出脉道通利则气血运行顺畅。因此，本课题认为高血压的病位在血脉，病机是不同原因导致的血脉胀满、血液运行不畅，临床可采用调和营卫、活血化瘀法进行治疗。
高血压表现为动脉内压力的升高，患者早期可无任何不适，也可出现眩晕、头痛等症状，若血压持续增高，易引起脉管破裂，导致出血。因此，其总的治疗原则应为“疏其血气，令其条达，而致和平”，即在控制血压水平的同时，减少并发症的发生。课题组前期做了大量关于活血化瘀类中药干预高血压等血管功能障碍疾病的研究[15-17]。文献调研发现，中医活血化瘀经典方剂通窍活血汤常用于治疗高血压导致的头痛、眩晕、脑出血等症状。前期通过自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）验证，发现通窍活血汤干预后，SHR大鼠血清中一氧化氮（NO）明显增加，内皮素1（ET-1）和活性氧（ROS）水平明显降低，主动脉组织中醌氧化还原酶（NQO1）和超氧化物歧化酶（SOD2）的蛋白水平升高，NADPH氧化酶1（NOX1）、NOX4、p53和p21的蛋白水平明显降低。结果提示：通窍活血汤能够改善大鼠血管内皮功能，抑制细胞氧化应激和衰老（见前期工作，图1A-E）。
通窍活血汤出自《医林改错》，为清代王清任创制的活血化瘀方，原方由桃仁，红花，赤芍，川芎，鲜姜，老葱，红枣，麝香共八味中药组成。其中，桃仁破血行滞而润燥，红花活血祛瘀以止痛，共为君药；赤芍、川芎助君药活血祛瘀；麝香、老葱、生姜具有通阳开窍的功效，辛香温通作用较佳，全方重在活血通窍，主治瘀阻头面之头痛、眩晕等证。麝香来自于野生动物，较珍贵而临床罕用，现代中医用药常用人工麝香代替。临床证据表明，通窍活血汤可以改善患者的血管内皮功能，对于多种疾病都具有良好的治疗效果[18-20]。课题前期研究发现，通窍活血汤可以改善SHR大鼠血管内皮功能，并且抑制细胞氧化应激、衰老，然而其作用机制并未阐明。因此，探索通窍活血汤干预高血压的作用靶点及机理，对于血管功能障碍疾病的发生发展和防治机制非常重要。
在此基础上，课题组开展了体外验证，血清药理学研究结果显示：通窍活血汤干预血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）后，细胞ROS活性降低，NQO1、SOD2蛋白水平明显升高，NOX1、NOX4、p53和p21蛋白水平明显降低（见前期工作，图2A-C）；使用氧化应激经典激活剂过氧化氢（H2O2）诱导细胞，研究结果显示：细胞ROS活性降低，p53和p21蛋白水平明显降低。体外表明：通窍活血汤可以逆转血管内皮细胞氧化应激及其介导的细胞衰老（见前期工作，图2D-F）。本项目立足于探索通窍活血汤抑制血管内皮细胞衰老的分子机制，为中医药防治高血压等血管功能障碍疾病提供新的治疗靶点。
3、通窍活血汤通过上调NUPR1抑制细胞氧化应激、衰老
为进一步探究通窍活血汤抑制血管内皮细胞氧化应激和衰老的作用机制，课题组利用课题前期的高血压相关转录组测序数据，关注到NUPR1、PTGS2、UPP1等基因，这些基因在高血压相关细胞损伤模型中显著低表达，且与氧化应激均有相关报道[21-23]。其中，NUPR1差异表达最为显著，进一步在HUVECs中验证，发现采用通窍活血汤含药血清干预经AngⅡ诱导的HUVECs，细胞内NUPR1 mRNA表达和蛋白水平显著升高（见前期工作，图3A-D）。那么，通窍活血汤是否通过上调NUPR1，从而缓解血管内皮细胞氧化应激和衰老呢？
核蛋白1（Nuclear protein 1，NUPR1）是一种小的固有无序蛋白（Intrinsically disordered proteins，IDPs）。IDPs没有稳定的蛋白结构，因在真核生物体中的比例远高于原核生物，可能是生物进化的重要特点之一，近年来引起科研工作者的极大关注[24, 25]。人类NUPR1基因位于第16号染色体上，编码低分子量蛋白（8 kDa），缺乏稳定的二级和三级结构，在正常生理条件下的健康细胞中表达水平较低。然而，其可以在应激条件下被转录激活，如氧化应激、内质网应激和代谢应激，以保护细胞免受这些应激的影响。越来越多证据表明，高活性氧（reactive oxygen species，ROS）导致线粒体氧化应激时，NUPR1被激活以保护细胞免受氧化损伤[26, 27]。高水平的ROS也可触发细胞发生内质网应激，并且通过NUPR1/CHOP/TRIB3信号通路启动细胞凋亡和自噬，由此说明NUPR1在不同应激反应之间具有联结作用[28, 29]。国外研究近期已证实，NUPR1是一种转录调节因子，可将应激信号转化为基因表达程序，使细胞能够抵抗微环境变化诱导的应激，如微重力条件下激活的衰老途径[30]。通窍活血汤发挥治则治法的现代分子生物学机制，是否通过上调NUPR1实现呢？
结合课题组前期的文献调研和体内外验证，本项目提出科学假设，通窍活血汤可以改善高血压血管内皮功能，其内在机制可能是通窍活血汤作用于血管内皮细胞后，细胞中NUPR1蛋白水平升高，从而抑制细胞氧化应激及其介导的细胞衰老。本项目旨在通过探索通窍活血汤抑制血管内皮细胞衰老的分子机制，为高血压等血管功能障碍疾病发掘新的生物诊疗靶点。
参考文献（划线处为本课题组前期研究成果）
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