济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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一种新型抗菌神经肽DH44及其抗菌活性分析

申报人：孙莹昊 申报日期：2025-03-18

基本情况

2025创新项目
一种新型抗菌神经肽DH44及其抗菌活性分析 学生申报
创新训练项目
理学
生物科学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
抗生素的滥用已引发全球性的病原菌耐药性危机，严重威胁公共卫生安全。在此背景下，新型抗菌活性物质的开发成为当务之急。近期研究表明，由神经细胞或免疫细胞产生的部分神经肽与抗菌肽十分相似，并被证明具有广谱的抗菌活性。本项目基于前期构建的深度学习预测模型，对仿刺参（Apostichopus japonicus）神经肽家族进行系统性分析，成功鉴定出利尿激素44（DH44）这一具有潜在抗菌效能的神经肽分子。预实验数据表明，DH44对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均展现出显著抑菌效果，初步验证了其抗菌功能。本项目拟系统评估DH44的抗菌谱系，涵盖典型革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等）和革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等），确定其最小抑菌浓度（MIC）和半抑制浓度（IC50）。借助透射电镜技术解析其抗菌作用模式，结合溶血和细胞毒性实验评估其生物安全性，并通过活体实验确定其能否促进小鼠创面愈合。本项目的顺利实施将为人类健康提供新的、安全的抗菌活性物质。

无

指导教师侯西坦主持国家自然科学基金、山东省自然科学基金、贺林院士新医学转化基金各1项。
指导教师侯西坦负责实验设计和经费支持，指导教师刘若男负责带教学生实验研究以及论文修改工作。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
孙莹昊 医学影像与检验学院 医学检验技术（本科） 2023 项目申报，分工统筹，实验及论文写作
程舒彦 医学影像与检验学院 医学检验技术（本科） 2023 文献整理，实验及论文写作
张海颜 法医学院 法医学（本科） 2025 菌种培养及抗菌活性分析
张文慧 医学影像与检验学院 医学检验技术（本科） 2024 数据整理及小鼠养殖实验
商瑾溪 医学影像与检验学院 医学检验技术（本科） 2024 数据整理及小鼠养殖实验
李家乐 医学影像与检验学院 医学检验技术（本科） 2024 菌种培养及抗菌活性分析

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
侯西坦 医学影像与检验学院 否
刘若男 医药工程学院 否

立项依据

深入探究神经肽DH44的抗菌谱系和生物安全性，评估其在小鼠创面愈合中的作用。
1. 神经肽DH44的序列特征和抗菌活性预测
1.1 深度网络学习模型预测DH44是否具有抗菌活性
        抗菌肽已有大量研究数据库，且随着近年来计算机和AI发展崛起，对于抗菌肽的深度预测模型也开发非常多，我们根据常用的深度学习预测模型（本次运用APD、DBAASP、AMPFUN、AMPpred-MFA、AMP_Scanner、CAMP Prediction）预测神经肽DH44的抗菌活性，DBAASP和AMPFUN预测其他生物活性，ToxinPred预测毒性等。
1.2 生物信息学分析DH44成熟肽的序列特征
        采用生物信息学方法，对DH44前体的基因序列、基因结构、蛋白序列以及进化地位进行分析；随后对成熟肽DH44的保守序列（peptide logo）、三维结构、等电点（PI）、多肽平均疏水性（GRAVY）、氨基酸组成（螺旋轮圈）等进行预测。
2. 神经肽DH44体外（in vitro）抗菌活性分析
2.1 菌种的获取与活化
        大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25922）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC 23857）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniac，ATCC 4352）由商业途径购买。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和创伤弧菌（Vibrio vulnificus）由本实验室提供。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌使用LB培养基活化；无乳链球菌使用BHI培养基活化；哈维氏弧菌使用含3.5%氯化钠的TSB培养基活化。
2.2 DH44抗菌活性分析
        将各菌种提前在摇床上150 rpm和37℃培养过夜，随后将过夜培养物按1/100稀释到新鲜相应培养基中，37℃培养至600 nm处的吸光度值在0.4-0.6（指数生长中期），离心弃上清，PBS清洗菌种杂质；离心弃上清，用1 mL PBS定容菌液，吹打混匀，使菌液稀释至106CFU/mL。提前配制好神经肽DH44浓度为128 μM、64 μM、32 μM、16 μM、8 μM、4 μM、2 μM、1 μM的系列工作溶液，同时设置阴性对照（PBS）。取50 μL的系列工作溶液与50 μL稀释菌液混合，150 rpm，37℃共孵育3 h，通过在冰上添加冷PBS溶液（稀释度1/10）10 min停止反应，取10 μL上述菌液，加入90 μL新鲜培养基至96孔板中，培养2-6 h，用酶标仪测定OD600值，实验平行3次测定。抑菌效果用细菌存活率表示：细菌存活率（%）=[(加入肽处理后的OD值-培养基的本底OD600值)/(无肽时的OD值-培养基的本底OD600值)]×100%。以细菌存活率为纵坐标，共孵育菌液中神经肽DH44实际浓度为横坐标做MIC图。另外抑菌活性可用半数抑制浓度（IC50）评估：以细菌抑制率为纵坐标，以log（共孵育菌液中神经肽DH44实际浓度）为横坐标作图，然后用Prism拟合获得IC50值。
2.3 神经肽DH44对细菌损伤效果的超微结构观察
        利用透射电镜观察抗菌肽对细菌的损伤效果。将各细菌培养至对数期生长期，取菌液，PBS缓冲液洗涤菌体两遍，PBS缓冲液重悬，制备菌体浓度为108CFU/mL的菌悬液。将菌液分成两组：对照组（PBS）和DH44处理组（DH44浓度为2×IC50）。37℃孵育3 h，离心弃上清，用PBS缓冲液洗涤2遍，将处理后的细菌用戊二醛固定，PBS洗涤、并用乙醇系列梯度脱水，不同比例丙酮环氧树脂渗透、包埋、切片后染色，用透射电子显微镜观察细菌的形态变化，分析抗菌肽对细菌损伤的效果。
3．神经肽DH44生物安全性评价
3.1 神经肽DH44的细胞毒性检测
        将复活后的HEK 293T细胞，用完全培养基制备密度为3-5×104个/mL的细胞悬液，取100 μL/孔加入96孔板中，37℃过夜培养，至细胞融合度为50%左右。用完全培养基配置浓度为64 μM、32 μM、16 μM、8 μM、4 μM、2 μM、1 μM的DH44系列工作溶液，同时设置阴性对照（PBS）。吸去96孔板中原有细胞培养基，加入100 μL/孔上述工作液，37℃过夜培养。然后，每孔加入10 μL CCK‑8溶液，在培养箱中培养1小时后，酶标仪测量450 nm处的吸光值OD450。CCK‑8细胞存活率的计算公式为：存活率（100%）=（实验组OD值‑空白对照组OD值）/（对照组OD值‑空白对照组OD值）×100%。其中空白对照组OD值为培养基的吸光度值。
3.2 神经肽DH44的溶血测试
        取家兔血液（耳静脉或者心脏采血），去除纤维蛋白原，用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤至上清液不显红色为止，制成10%的红细胞悬液，4℃保存，1周内使用。试验分为样品组1 μM、2 μM、4 μM、8 μM、16 μM、32 μM、64 μM及阴性对照（PBS）、阳性对照（ddH2O），取10 μL 4%红细胞悬液至EP管，加入990 μL的PBS配制的药品DH44，立即放入37℃水浴中孵育 30 min-1 h。反应完成后，在1500 r/min 下离心15 min，收集上清液100 μL至96孔板，每组3个平行，545 nm测吸光度。阳性对照应在0.5-1.1，阴性对照在≤0.03。溶血率（%）=（神经肽DH44 OD值-阴性对照OD值）/（阳性对照OD值-阴性对照OD值）*100%。
4. 小鼠创面愈合应用分析
4.1 DH44-卡波姆缓释凝胶配制
        本项目使用卡波姆（1.5%）作为增稠剂，聚乙二醇400（8%）作为透皮吸收促进剂，甘油（10%）作为调节润滑剂，混匀后121℃，高压灭菌。随后配制DH44终浓度为32 μM的DH44-卡波姆凝胶。
4.2 愈合率与组织病理学分析
        对BALB/c小鼠进行创面术后，每天敷DH44-卡波姆凝胶（对照组敷PBS-卡波姆凝胶）2次，在第0、1、3、5、7、9、11、14 d分别拍照，Image J计算愈合率。取术后第3、7天创面组织，H&E染色评估肉芽组织厚度、炎症细胞浸润及再上皮化程度；Masson染色量化胶原沉积面积（ImageJ软件分析蓝色胶原区域占比）。
4.3 免疫荧光检测创面修复相关标志物
        使用免疫荧光技术检测CD68+巨噬细胞浸润密度（Anti-CD68抗体）、α-SMA+肌成纤维细胞活化（Anti-α-SMA抗体）和Ki67+增殖细胞比例（Anti-Ki67抗体），以评估炎症水平以及细胞迁移和增值水平。 

1 抗菌肽的应用前景和抗菌机制
1.1抗菌肽的应用前景
        抗生素耐药和多重耐药已成为全球性健康危机，其影响呈现多维度、跨领域的特点。首先，在医疗卫生领域，耐药性问题直接导致全球死亡率持续攀升，显著增加了医疗负担。其次，在农业经济层面，耐药菌株的传播对畜牧养殖业造成持续性经济损失，威胁全球粮食安全。更值得关注的是，这一危机正在抵消全球在公共卫生领域取得的重要进展，包括新生儿存活率的提升、健康老龄化成果的巩固及减贫事业的推进。因此，新型、安全的抗菌活性物质亟待被开发。抗菌肽以广谱抗菌、特有免疫作用、靶点特异、高效力及绕过微生物耐药的独特特性，使其成为传统抗生素的有前景的替代品。
1.2抗菌肽的三维结构
        根据近900种抗菌肽的结构模型，天然的抗菌肽结构可分为四个大家族（α、β、αβ和非αβ）（图1）[1]。其中，具有α-螺旋和β-片状结构的抗菌肽在自然界中最为常见。
        α家族的抗菌肽主要采用线性结构α-螺旋（图1 A）作为其二级结构，其中富含组氨酸和色氨酸的肽可能形成α-螺旋结构，导致不同类别之间存在重叠。例如乳铁蛋白B、人抗菌肽LL-37等。β家族的特征是该结构中至少有两条β链[2]，半胱氨酸稳定且呈β-折叠（图1 B），人类α-防御素和Tachyplesin Ⅰ使用这种结构。而αβ家族中的抗菌肽同时包括了α-螺旋和β-折叠结构（图1 C），典型代表有β-defensins、CXCL4L1等。然而非αβ家族既没有α结构也没有β结构。然而，该家族具有广泛的二级结构，包括环状肽（图1 D和E）和无规卷曲（图1 F）。summernote-img 
                                                                                        图1 抗菌肽的结构多样性
（A）α-螺旋结构抗菌肽；（B）β-折叠结构抗菌肽；（C）αβ结构抗菌肽；（D）和（E）具有环状结构的抗菌肽；（F）无规卷曲结构抗菌肽。
 1.3抗菌肽的抗菌机制
        抗菌肽是先天免疫系统的重要组成部分，具有抗菌、抗真菌、抗寄生虫和抗病毒活性 [3]。此外，抗菌肽还在细胞内过程中发挥核心作用，主要包括血管生成、动脉生成、炎症反应、细胞信号传导和伤口愈合反应等 [4]。迄今为止，已经提出了几种抗菌肽的作用机制。然而，大部分抗菌肽通过破坏细胞膜的完整性起到直接杀灭病原微生物的作用 [5]。与传统的抗菌阳离子肽一样，抗菌神经肽通过这种机制作用于微生物，其过程包括：（1）带正电的神经肽与带负电的微生物表面静电结合；（2）带负电的磷脂双分子层失稳导致膜完整性的破坏；（3）膜通透性改变；（4）微生物因低渗而死亡 [6]。据报道，抗菌肽的破膜机制主要包括四种：桶状-隔层模式、环形-孔隙模式、类似洗涤剂的地毯机制和聚集体模式。桶状-隔层模式（图2A）的形成是首先为抗菌肽沿平行、垂直、或倾斜三个方向整合到磷脂双分子层，在达到特定的肽/脂质比时，其疏水区域与磷脂双分子层内部疏水区域结合，亲水区域向外暴露，螺旋分子平行排列形成中央管腔，即桶状-隔层模式 [7]；此外，与之相似的另一种跨膜离子通道——环形-孔隙模式（图2B），此模式在抗菌肽积累到一定值时，诱导磷脂双分子层弯曲，肽螺旋插入膜内，多肽与脂质结合后，形成环形孔型复合物，所以，此机制无需跨越完整的双层 [8]。类似洗涤剂的地毯机制（图2C）是抗菌肽持续积累，在其浓度达到阈值时，以簇状覆盖磷脂双分子层，通过类似洗涤剂的方式导致膜破裂，这一机制不会形成通道 [9]；而聚集体模式（图2D）则通过形成肽和脂质的复合物，建立离子泄露通道，细胞内容物泄露后导致细胞死亡 [10]。研究表明，多肽的拓扑（而不是线性）两亲性结构将直接影响其对膜通透的能力。因此，电荷以有规律的簇状分布在多肽的表面，是其获得抗菌能力的基础 [11]。
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                                                                                         图2 抗菌肽的作用机制模型
                                   （A）桶状-隔层模式；（B）环形-孔隙模式；（C）地毯模型；（D）聚集体模式。
 2 具有抗菌活性的神经肽
        大量研究结果表明，许多神经肽在体外具有直接的抗菌作用，证实了它们作为抗菌药物的既定作用。这些神经肽有Pituitary adenylate cyclase-activating peptide（PACAP） [12-14]、Vasoactive intestinal peptide（VIP） [15, 16]、α-Melanocyte stimulating hormone（α-MSH） [17, 18]、Orexin-B（ORXB） [19-21]、Ghrelin [22, 23]、Substance P（SP） [24, 25]、Adrenomedullin（AM） [26, 27]、Calcitonin-gene related peptide（CGRP） [28-32]、Urocortin-Ⅱ（UCNⅡ） [33-35]、Neuropeptide Y（NPY） [36, 37]、NDA-1 [38]和Catestatin（CST） [38]（表1）。此外，它们大多可以由免疫细胞分泌，发挥免疫调节作用（图3）。然而，上述大部分神经肽只在体外被证实具有抗菌活性，仅PACAP、NDA-1和UCN2被证实在体内具有抗感染作用。其中，PACAP是一种在大脑中可被病原体诱导的抗菌神经肽，并保护大脑免受病原体感染 [42]。
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                                                                      图3 免疫系统细胞产生的抗菌神经肽
        2021年，Lee [13]等利用生物信息学方法，将人类神经肽与抗菌肽数据库进行比对预测，发现PACAP是一种潜在的抗菌神经肽，同时在三维结构、氨基酸组成以及平均疏水性方面与已知抗菌肽LL37十分相似。Lee [13]等还利用X射线散射技术，证实PACAP可对细菌质膜进行穿孔，却对哺乳动物细胞膜没有影响。这一结果结合后续的抑菌实验可证实，PACAP具有广谱抗菌活性。此外，在不引起细胞免疫的情况下，Staphylococcus aureus和Candida albicans可特异性地诱导PACAP在脑内近50倍表达量，即使在中枢神经系统外的不同组织中也存在不同程度PACAP诱导表达。这些所观察到的诱导模式与在模拟相应组织在特定生理环境条件下测得的PACAP抗菌功效相一致。因此，PACAP可将潜在的伤害性神经炎症减至最轻的情况下，保护中枢神经系统免受病原体感染。
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注：GRAVY，多肽平均疏水性；PI，等电点；α，α-螺旋；β，β-折叠；RC，无规卷曲；PP-fold，由一个长N端脯氨酸螺旋和一个长两亲性α-螺旋组成；G，细菌；G-，革兰氏阴性菌；F，真菌；V，病毒；P，寄生虫。
3 抗菌神经肽的发现及应用研究
        近期研究表明，部分神经肽在体外具有广谱抗菌活性，可通过抗菌（破膜效应）和抗生物膜双重机制保护病变组织免受微生物侵袭。此外，由免疫细胞或神经细胞产生的部分神经肽还具有强烈的抑炎和促细胞生长活性，不仅可以参与不同免疫紊乱的耐受性维持，还可以促进细胞增殖和迁移。本项目认识到了神经肽的这种抗菌、抑炎以及促细胞生长活性，在伤口愈合中有协同作用。因此，如假说图4所示，深入研究神经肽的“抗菌-抑炎-促修复”活性在伤口愈合中的作用研究，将有助于在如今抗生素滥用的背景下，为人类健康提供新的、安全的抗菌活性物质提供理论基础。同时，本项目在后期药物开发中也具有重要的潜在应用价值。
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                图4 神经肽DH44抗菌-抑炎-促修复的假说图
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（1）本项目创新性的使用深度网络学习模型预测成熟神经肽抗菌活性。
（2）本项目发现神经肽DH44在体外具有良好的抗菌活性和生物安全性，具有促进创面愈合的潜力。 
技术路线
针对前述研究内容，本项目拟采取的技术路线如图5所示
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                                     图5 本项目的技术路线图 
拟解决的关键科学问题
（1）神经肽DH44抗菌活性分析：明确DH44抗菌谱图；通过精确测定DH44对各种病原菌的MIC和IC50来明确DH44的抗菌活性。
（2）神经肽DH44安全性检测：通过溶血测试及细胞毒性实验来评估其安全性。
（3）神经肽DH44应用研究初探：制备DH44-卡波姆缓释凝胶，探究DH44能否促进小鼠场面愈合。 
预期成果
        发表论文 1 篇，或申请专利 1 项，或参加学科类竞赛并获得省级及以上奖励 1 项。
2025年6月-2026年5月
（1）建立和优化神经肽团队，完成文献阅读与积累，利用生物信息学分析DH44成熟肽的序列特征。
（2）通过深度学习网络预测模型分析，预测DH44是否具有抗菌活性。
（3）体外抗菌活性实验测试，包括抗菌肽对各类细菌MIC、IC50值及多重诱导耐药菌测定，确定其抑菌效果。
2026年6月-2027年6月
（1）对有活性的抗菌肽进行电镜扫描，确定其形态变化。
（2）对抗菌肽进行溶血及细胞毒性检测，确定其生物安全性。
（3）进行小鼠创面愈合实验分析：包括愈合速率，细胞迁移速度等评价炎症水平和修复过程。
（4）数据总结及完成专利或论文撰写和投稿。 
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
1.1海参来源抗菌神经肽DH44的发现及合成
        海参来源抗菌神经肽DH44，序列为PLSVNQALVPLSNLAYGASRNRQNAQVRN FLNSI，分子式：C162H266N52O49；GRAVY为-0.21，总净电荷数：+3；理论等电点：pH 12.11，碱性多肽，3D结构为α-螺旋。液相色谱图中（图6 A），DH44保留时间8.981 min，且根据峰面积归一化法纯度高于95%，同期质谱图（图6 B）可检测到[M+3H]3+、[M+4H]4+和[M+5H]5+质荷比（m/Z）分别为1242.40、932.25和746.05，计算其M为3724.20、3725.00和3725.25，拟合值为3725.00，符合理论值3725.20，说明合成的神经肽DH44序列正确可靠。
1.2 DH44体外抗菌活性分析-酶标法
        取大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌进行活化。使用酶标法，以细菌存活率为纵坐标，共孵育菌液中神经肽DH44实际浓度为横坐标做MIC图，如图7所示，神经肽DH44对大肠杆菌和无乳链球菌的MIC值为32 μM，对金黄色葡萄球菌的MIC值为64 μM（见表2）。另外抑菌活性可用半数抑制浓度（IC50）评估：以细菌抑制率为纵坐标，以log（共孵育菌液中神经肽DH44实际浓度）为横坐标，如图8所示：使用GraphPad Prism拟合IC50曲线，得到大肠杆菌拟合IC50值为4.21±1.11 μM，无乳链球菌拟合IC50值为8.31±1.19 μM及金黄色葡萄球菌拟合IC50值为16.60±1.24 μM（见表2）。通过MIC值和IC50值，可看出神经肽DH44对大肠杆菌、无乳链球菌及金黄色葡萄球菌具有优越的抑制活性。 
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图6 仿刺参源神经肽DH44人工合成色谱和质谱检测图
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 图7 DH44对大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度（MIC）


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 图8 DH44对大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的半数抑制浓度（IC50）
1.3 DH44体外抗菌活性分析-平板法
        采用共培养-平板涂布法进一步验证海洋来源的神经肽DH44的抗菌作用：如上操作，取共孵育液稀释1000倍后，在超净工作台严格无菌操作，在固体培养基（LB琼脂板）上涂布，37℃培养箱培养过夜，拿出计数。如图9 A和B所示，大肠杆菌和无乳链球菌在DH44实际浓度为32 μM时，未见菌落生长；而如图9 C所示，金黄色葡萄球菌在DH44实际浓度为64 μM时，基本看不到菌落生长。以上结果与酶标法测定MIC结果相互对应。
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图9 神经肽DH44与大肠杆菌（A）、无乳链球菌（B）和金黄色葡萄球菌（C）共培养后的平板培养结果图

1.4 神经肽DH44在小鼠创面愈合中应用预实验结果
        整理小鼠第0-14 d创面愈合情况，结果如图10 A所示，对照组第1 d伤口明显发生炎症反应，伤口变大，而敷药组炎症反应较轻，伤口变细长；之后，敷药组伤口皮肤迁移较快成线状伤口愈合模型。第11 d时，敷药组小鼠伤口基本愈合，而对照组小鼠第14 d时还未完全愈合；总的来说DH44处理组可至少提前4 d时间完成创面的愈合进程。差异分析结果显示（图10 B和C），两组创面愈合进程之间存在明显差异（P=0.0022），并且在第1、7、9和11 d敷药组和对照组之间存在显著性差异（P<0.05）。综上所述，神经肽DH44可有效控制创面炎症并促进皮肤迁移，从而显著促进小鼠创面的愈合。
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图10 神经肽DH44可促进小鼠创面愈合。（A）小鼠创面愈合情况；（B）小鼠创口面积；（C）小鼠创面愈合率统计。*，表示P<0.05；**，表示P<0.01。

        本项目所使用的实验方法和手段，主要涉及一些常规的分子生物学以及细胞生物学的相关实验技术，这其中包括细菌培养、透射电镜、细胞培养等等。申请人所在实验实验室已经建立了相应的实验技术平台，对项目的顺利开展奠定了坚实的基础，所以本项目在技术上具有可行性。指导老师侯西坦所在实验室具备罗氏荧光定量PCR仪、十万级无尘细胞间、激光共聚焦显微镜、蛋白电泳/印迹系统、Nikon倒置荧光显微镜使用技能和条件等等，且指导老师一直从事抗菌剂及酶抑制剂筛选方法研究多年，有一定专业基础和成绩；而合作老师刘若男实验室具备本项目开展所需的各项工作条件，能够保证本项目研究工作的顺利完成。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 10000.00 10000.00
1. 业务费 15000.00 无 7000.00 8000.00
（1）计算、分析、测试费 12000.00 多肽合成及电镜测试 7000.00 5000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 版面费 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 5000.00 抗菌分析试剂、药品费用以及小鼠养殖等 3000.00 2000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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