济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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基于富勒烯适配体传感器高选择性检测维生素D的研究

申报人：王子恒 申报日期：2025-03-18

基本情况

2025创新项目
基于富勒烯适配体传感器高选择性检测维生素D的研究 学生申报
创新训练项目
医学
公共卫生与预防医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
在人体内，胆钙化醇会转化为维生素D的活性形式。这种活性形式对于控制钙和磷的吸收与利用至关重要，以确保达到最佳的骨骼健康状，测量维生素D3的水平可以被视为评估人群生活质量的一个重要指标，我们决定一种快速、有效且灵敏的检测维生素D3的技术，以适用于即时诊断应用。我们系统地研究了一种以富勒烯作为猝灭剂、基于适体的快速简便荧光传感器，用于检测维生素D3。
参加过第十二届大学生数字媒体科技作业及创意竞赛
魏胤，副教授，博士，毕业于四川大学，分析化学专业，现任职于公共卫生学院卫生检验学教研室。主要从事《空气理化检验》、《食品理化检验》、《实验室安全与管理》等课程的教学工作。近年来主要从事生物传感器的开发、非侵入式医学诊断等研究工作。至今已在Biosensors and Bioelectronics、Analytical Chemistry等国内外专业期刊上发表论文20余篇。主持山东省自然科学基金、济宁市科技计划等5项课题。2021年荣获2018-2021年度济宁医学院优秀教师称号。
ZR2020QH297 基于纳米石墨-适配体-脱氧核糖核酸酶的荧光传感器检测肝癌生物标志物的研究 15.0 1 青年基金 山东省自然基金委员会 2021.01-2023.12 在研
2016-56-68 纳米石墨传感器对饮用水中汞离子的检测 1.0 1 一般项目 济宁市科技局 2016.12-2018.12 结题
JYP2018KJ15 基于纳米石墨和适配体的新型生物传感器检测抗生素类和激素类物质的研究 6.0 1 一般项目 济宁医学院 2019.01-2021.12 在研
1.对本项目进行指导，监督，督促本小组成员在规定时间内完成既定任务
2.对本项目提出合理的方案和建议，使本项目更具有丰富性，可靠性和相关性
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
王子恒 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 联系老师，资料汇总
鲁子豪 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 资料搜集，翻译
申晞雯 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 资料搜集，翻译
康钰婷 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 资料搜集，翻译

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
魏胤 公共卫生学院 否

立项依据

维生素 D 作为人体必需的脂溶性维生素，在钙磷代谢、骨骼健康维持等方面起着关键作用。维生素 D 缺乏或过量与多种疾病，如佝偻病、骨质疏松症、心血管疾病等密切相关。准确检测维生素 D 的含量对于疾病诊断、治疗监测以及营养评估至关重要。
目前，现有的维生素 D 检测方法存在一定的局限性，如高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）虽准确性高，但仪器昂贵、操作复杂、检测时间长；免疫分析法特异性和灵敏度有限。因此，本项目旨在开发一种基于荧光标记适体探针和核酸外切酶 I 辅助信号放大的维生素 D 灵敏便捷检测方法。
通过优化荧光标记适体探针的设计，提高对维生素 D 的特异性识别能力；利用核酸外切酶 I 的特性，实现对检测信号的高效放大，从而显著提升检测的灵敏度。同时，简化检测流程，缩短检测时间，降低对专业操作人员和复杂仪器的依赖，使该方法能够广泛应用于临床实验室、基层医疗单位以及家庭自我检测等场景，为维生素 D 相关疾病的早期诊断和防治提供有力的技术支持。
1. 荧光标记适体探针的筛选与优化：从适体文库出发，运用系统进化指数富集配体技术（SELEX）筛选出对维生素 D 具有高亲和力和特异性的适体序列。通过对适体的结构和功能进行深入分析，确定最佳的荧光标记位点，选择合适的荧光染料进行标记。优化荧光标记适体探针的制备工艺，确保其稳定性和活性。
2. 核酸外切酶 I 辅助信号放大体系的构建：研究核酸外切酶 I 对与维生素 D 结合后的荧光标记适体探针的作用机制。通过实验确定核酸外切酶 I 的最佳反应条件，包括酶浓度、反应时间、温度、pH 值等。利用核酸外切酶 I 对特定核酸结构的识别和切割特性，实现对荧光信号的有效放大。
3. 检测方法的建立与优化：将荧光标记适体探针和核酸外切酶 I 辅助信号放大体系相结合，构建完整的维生素 D 检测方法。优化检测过程中的各个参数，如适体探针浓度、样本处理方法、反应体系的组成等。采用不同浓度的维生素 D 标准品进行检测，绘制标准曲线，确定检测方法的线性范围、灵敏度和检测限。
4. 方法学评价：对建立的检测方法进行全面的方法学评价。评估其特异性，通过检测与维生素 D 结构类似的物质，考察方法对维生素 D 的选择性识别能力。测定方法的精密度，包括日内精密度和日间精密度。评估方法的准确度，通过加标回收实验确定检测结果的准确性。
5. 实际样品检测与验证：应用建立的检测方法对实际生物样品，如血清、血浆、尿液等进行维生素 D 含量的检测。与传统的检测方法（如 LC-MS/MS）进行对比分析，验证新方法的可靠性和实用性。收集临床数据，分析检测结果与维生素 D 相关疾病之间的关系
1. 国内研究现状：国内在维生素 D 检测技术领域不断发展。传统的 HPLC 和 LC-MS/MS 技术已在一些大型临床实验室中应用，但由于设备成本高、操作复杂，限制了其在基层医疗单位的普及。近年来，基于生物传感器的检测方法逐渐兴起，部分研究团队开展了适体探针用于维生素 D 检测的探索。然而，在信号放大技术的应用方面相对滞后，已有的研究在检测灵敏度和便捷性上仍难以满足实际需求。同时，对于核酸外切酶 I 辅助信号放大在维生素 D 检测中的研究较少，相关技术有待进一步开发和完善。
2. 国外研究现状：国外在维生素 D 检测技术方面处于领先地位。LC-MS/MS 作为金标准，被广泛应用于临床诊断和研究。此外，免疫分析法、电化学传感法和荧光传感法等也得到了深入研究和应用。在适体探针的研究上，国外已成功筛选出多种对维生素 D 具有高亲和力的适体，并将其应用于生物传感检测中。核酸外切酶辅助信号放大技术在生物分析领域的应用较为成熟，一些研究将其与适体探针相结合，实现了对多种生物分子的高灵敏检测。但在维生素 D 检测领域，尽管有一定的研究进展，但仍需要进一步优化检测方法，提高其稳定性和实用性。
3. 发展动态：随着生命科学和生物技术的不断发展，维生素 D 检测技术正朝着更加灵敏、特异、便捷的方向发展。一方面，新型信号放大技术的不断涌现，如纳米技术、酶催化放大技术等，为提高检测灵敏度提供了新的思路和方法。另一方面，微流控技术和生物芯片技术的发展，使得检测设备更加小型化、集成化，有望实现现场快速检测。此外，对适体探针的深入研究，包括适体的优化设计和修饰，将进一步提高检测的特异性和稳定性。未来，维生素 D 检测技术将在临床诊断、健康管理和公共卫生等领域发挥更加重要的作用。
创新点：
1. 新型猝灭剂的独特优势：选用富勒烯作为猝灭剂，是基于其特殊的分子结构与理化性质。富勒烯具有完美的球状共轭结构，电子云均匀分布在球壳表面 ，这种结构使其能够高效地接受荧光基团发射的能量，发生荧光共振能量转移（FRET），进而实现对荧光的猝灭。相较于传统的猝灭剂，如一些金属纳米颗粒或有机染料，富勒烯具有更宽的吸收光谱，能够匹配多种荧光基团的发射光谱，显著提升猝灭效率，降低背景荧光信号，使得检测维生素D3时的信噪比大幅提高，从而可以检测到极低含量的目标物，在超痕量分析领域展现出巨大潜力。
2. 适体荧光传感的创新机制：适体是经过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到的单链寡核苷酸片段，对维生素D3具有高度特异性识别能力。当适体未与维生素D3结合时，其通过碱基互补配对形成特定二级结构，使荧光基团靠近富勒烯，发生高效的荧光猝灭；一旦维生素D3存在，适体与维生素D3特异性结合并发生构象改变，荧光基团远离富勒烯，荧光恢复。这种基于分子构象动态变化调控荧光信号的机制，为维生素D3检测提供了全新的思路，突破了传统检测方法依赖化学反应或抗体 - 抗原结合的局限，能更灵敏、直观地反映目标物浓度变化。
3. 免标记检测的技术革新：传统的检测方法往往需要对适体或目标物进行标记，标记过程不仅繁琐，涉及多步化学反应和纯化步骤，而且标记物可能影响适体与维生素D3的结合活性，导致检测误差。本项目的荧光传感器实现了免标记检测，直接利用适体与富勒烯之间的相互作用及荧光信号变化进行分析。这不仅简化了检测流程，节省了时间和成本，还避免了因标记物引入而带来的假阳性或假阴性结果，提高了检测的可靠性和准确性，为生物分析检测技术的发展开辟了新路径。
项目特色：
1. 快速检测，满足时效需求：在检测维生素D3时，从样品采集到获得最终检测结果，整个过程可在5 - 10分钟内完成。这得益于适体与维生素D3之间快速的特异性结合反应以及荧光信号的即时响应。例如在临床急诊中，医生需要快速了解患者体内维生素D3水平以制定治疗方案，该传感器能迅速提供准确数据，为患者争取宝贵的治疗时间；在食品安全现场筛查中，可快速判断食品中维生素D3的含量是否达标，及时发现问题产品，保障消费者权益。
2. 简便操作，易于推广普及：操作过程极为简便，无需专业技术人员进行复杂的培训。仅需将适量的样品加入含有荧光传感器的反应体系中，轻轻混匀并孵育一段时间，然后使用普通的荧光检测仪即可读取荧光信号，根据预先建立的标准曲线计算出维生素D3的含量。这种简单易懂的操作方式，使得该技术可以在基层医疗单位、小型食品检测实验室以及现场检测场景中广泛应用，极大地拓展了维生素D3检测的覆盖范围，促进公共健康监测和食品安全监管工作的开展。
3. 高选择性，保障检测精度：适体对维生素D3具有极高的亲和力和选择性，其三维结构与维生素D3精确互补，能够准确识别目标分子，有效区分维生素D3与其他结构类似物，如维生素D2以及各种干扰物质。即使在复杂的生物样品（如血清、血浆）或食品基质（如奶制品、保健品）中，该荧光传感器也能准确检测维生素D3的含量，避免其他成分的干扰，确保检测结果的准确性和可靠性，为维生素D3相关的临床诊断、营养评估和食品安全检测提供了有力的技术支持。
1.适体筛选与优化
（1）文库构建：合成包含10¹³ - 10¹⁵ 个随机单链寡核苷酸序列的文库，长度一般在40 - 80个核苷酸左右，两端为固定序列，中间是随机序列，为筛选特异性适体提供丰富的分子多样性。
（2）多轮筛选：将维生素D3固定在固相载体（如磁珠、96孔板）上，加入寡核苷酸文库进行孵育，使能与维生素D3特异性结合的适体吸附在固相载体上。通过多次洗涤去除未结合的寡核苷酸，然后采用PCR扩增结合的适体，再将扩增产物进行下一轮筛选。经过8 - 15轮筛选，逐步富集对维生素D3亲和力高的适体。
（3）序列测定与分析：对最终筛选得到的适体进行测序，利用生物信息学工具如BLAST分析其与已知序列的同源性，并通过RNAstructure、Mfold等软件预测其二级和三级结构，分析可能的结合位点和构象变化，确定亲和力和特异性最佳的适体序列。
2. 荧光标记适体的制备
（1）标记方法选择：采用亚磷酰胺法，将预先活化的荧光基团（如FAM - 亚磷酰胺单体）在DNA合成仪上按照设计好的序列添加到适体的5'端或3'端。此方法反应条件温和，标记效率高，能保证荧光基团与适体稳定连接。
（2）纯化与鉴定：标记后的适体通过HPLC进行纯化，利用不同物质在固定相和流动相之间分配系数的差异，将未反应的荧光基团、短链寡核苷酸等杂质去除。通过PAGE电泳进一步验证纯度，在紫外灯下观察条带，若仅出现单一明亮条带，则表明适体纯度符合要求。
3. 富勒烯 - 适体复合物的构建
（1）相互作用研究：利用荧光光谱滴定实验，逐步增加富勒烯的浓度，监测荧光标记适体的荧光强度变化，研究两者之间的结合模式和亲和力。通过等温滴定量热法（ITC）测定结合过程中的热力学参数，如结合常数、焓变、熵变等，深入了解相互作用机制。
（2）条件优化：系统考察富勒烯与适体的比例（如1:10 - 1:100）、反应时间（1 - 24小时）、反应温度（4 - 37℃）以及缓冲液种类和pH值对复合物形成及荧光猝灭效率的影响。采用响应面分析法等实验设计方法，确定最佳制备条件，使荧光猝灭效率达到90%以上。
（3）结构表征：使用DLS测量复合物的粒径分布，了解其在溶液中的聚集状态；通过TEM直接观察复合物的形貌和结构，验证富勒烯与适体是否成功结合以及结合方式。
4. 检测体系的建立与优化
（1）标准曲线绘制：配制一系列不同浓度（如10⁻¹² - 10⁻⁶ mol/L）的维生素D3标准品溶液，分别加入到优化条件下制备的富勒烯 - 适体复合物溶液中，在37℃孵育15 - 60分钟，使适体与维生素D3充分结合并发生构象变化，导致荧光恢复。用荧光分光光度计在特定波长下测定荧光强度，以维生素D3浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算检测限（LOD）和定量限（LOQ）。
（2）条件优化：分别考察孵育时间（5 - 120分钟）、温度（25 - 45℃）、缓冲液pH值（6.0 - 8.0）以及常见干扰物质（如维生素D2、胆固醇、脂肪酸等）对检测体系的影响。通过单因素实验和正交实验确定最佳检测条件，使检测体系的灵敏度、选择性和稳定性达到最优。
5. 实际样品检测
（1）样品预处理：对于血清样品，先在4℃下以3000 - 5000 rpm离心10 - 15分钟，去除沉淀，取上清液用磷酸盐缓冲液（PBS）按1:10 - 1:100比例稀释；对于食品样品，如奶制品，先将样品均质化，加入适量乙醇超声提取30 - 60分钟，再离心取上清液，用旋转蒸发仪浓缩后复溶于PBS中。
（2）检测与验证：将处理后的实际样品加入到优化后的检测体系中，按照标准曲线测定方法进行检测，计算样品中维生素D3的含量。采用加标回收实验评估检测方法的准确性，在样品中加入已知量的维生素D3标准品，测定回收率，要求回收率在90% - 110%之间。同时，使用LC - MS/MS等权威方法对同一样品进行检测，对比两种方法的检测结果，验证本方法的可靠性。
拟解决的问题
1. 检测灵敏度低：传统检测方法的信号检测方式和分子识别元件限制了灵敏度。例如ELISA依赖酶催化显色反应，信号放大倍数有限；HPLC检测受限于检测器的检测下限。本研究利用富勒烯与荧光标记适体间高效的荧光共振能量转移（FRET），当适体与维生素D3结合后，荧光恢复信号强，结合优化的适体筛选技术，可使检测限降低至10⁻¹² mol/L 以下，比传统方法提高1 - 2个数量级。
2. 检测时间长：现有方法如HPLC需复杂的样品前处理和色谱分离过程，整个检测流程可能需要数小时；ELISA也需要多次孵育和洗涤步骤，耗时1 - 2小时。本项目通过优化适体与维生素D3的结合反应动力学，以及简化检测流程，实现5 - 15分钟内完成检测，满足快速检测需求。
3. 选择性差：复杂样品中存在多种与维生素D3结构相似的物质，如维生素D2、类固醇激素等，传统方法难以有效区分。基于适体对维生素D3独特的三维结构识别，其解离常数（KD）可达10⁻⁹ - 10⁻¹² mol/L，能特异性结合维生素D3，有效排除其他物质干扰，选择性系数大于100。
预期成果
1. 开发新型荧光传感器：成功构建基于富勒烯猝灭和适体特异性识别的荧光传感器，传感器可制成便携的检测试剂盒或集成化的检测芯片，操作简单，只需将样品加入检测体系，在小型荧光检测仪上即可读取结果，成本相比现有高端检测设备降低50%以上。
2. 明确检测性能参数：确定检测限达到10⁻¹² mol/L，线性范围为10⁻¹² - 10⁻⁶ mol/L，灵敏度比现有方法提高1 - 2个数量级；选择性方面，对常见干扰物质的选择性系数大于100；稳定性上，在4℃保存3个月，检测性能无明显下降。
3. 实际样品检测验证：在临床血清样品检测中，与LC - MS/MS检测结果的相关性系数达到0.95以上；在食品样品检测中，加标回收率在90% - 110%之间，证明该传感器在临床诊断和食品安全监测领域具有良好的准确性和可靠性。
 
一、准备阶段
（一）资料收集与调研
1. 全面搜集维生素D检测相关的文献资料，深入了解各类传统检测方法的原理、优缺点及应用现状。重点关注基于适体和核酸外切酶的检测技术研究进展，梳理相关研究的关键成果与技术瓶颈。
2. 整理分析不同荧光标记物和适体的特性、合成方法及应用案例，为实验选择合适的荧光标记适体探针提供理论依据。
（二）实验材料与仪器准备
1. 根据实验需求，采购维生素D标准品、荧光标记的适体探针、核酸外切酶I、各类缓冲液及其他化学试剂，确保试剂的纯度和质量符合实验要求。
2. 筹备荧光分光光度计、离心机、恒温振荡器、移液器等实验仪器，并完成仪器的调试与校准工作，保证仪器能够正常运行。
二、实验阶段
（一）检测方法的建立与优化
1. 开展荧光标记适体探针与维生素D结合的条件探索实验，研究不同温度、时间、pH值等因素对结合效果的影响，确定最佳结合条件。
2. 优化核酸外切酶I辅助信号放大的反应条件，包括酶的用量、反应时间、温度等，通过对比实验，找到使信号放大效果最佳的参数组合。
3. 考察体系中其他物质对检测结果的干扰情况，如常见的金属离子、生物分子等，评估检测方法的选择性和抗干扰能力。
（二）方法学验证
1. 制作维生素D浓度与荧光信号强度的标准曲线，确定检测方法的线性范围。依据标准曲线，计算检测限和定量限，评估方法的灵敏度。
2. 对同一浓度的维生素D样品进行多次重复检测，计算相对标准偏差（RSD），验证检测方法的重复性。同时，在不同实验条件下（如不同时间、不同操作人员）进行检测，考察方法的重现性。
3. 在已知浓度的样品中加入不同量的维生素D标准品，进行回收率实验，检验检测方法的准确性。
三、数据分析与论文撰写阶段
（一）数据分析
1. 运用专业的数据处理软件，对实验得到的大量数据进行统计分析，包括数据的整理、图表绘制等。
2. 通过数据分析，验证检测方法的性能指标是否达到预期目标，对实验结果进行深入讨论，分析可能存在的问题及原因。
（二）论文撰写
1. 开始撰写学术论文，按照论文的规范格式，依次完成引言、材料与方法、结果与讨论、结论等部分的撰写。
2. 对论文进行反复修改和完善，重点检查数据的准确性、实验描述的逻辑性、结论的可靠性等，确保论文质量。
四、成果总结与汇报阶段
（一）成果总结
1. 全面总结整个研究过程中的成果，包括成功建立的检测方法、取得的关键实验数据、研究过程中解决的技术问题等。
2. 整理实验过程中的原始数据、实验记录、图片图表等资料，进行归档保存，为后续的研究和成果展示提供支撑。
（二）汇报展示
1. 制作汇报PPT，将研究成果以简洁明了、图文并茂的方式呈现出来。
2. 在相关学术会议或项目汇报中进行成果汇报，与同行进行交流和讨论，听取意见和建议，进一步提升研究成果的影响力。
在魏胤老师深入研究的“基于富勒烯适配体传感器高选择性检测维生素D的研究”课题中，已具备多方面坚实基础。
1.富勒烯性质研究：对富勒烯的结构、物理化学性质有深入了解，知晓其具有独特的电子云分布、良好的导电性和生物相容性等，这些性质使其适合作为传感器的功能材料，为传感器的设计提供理论依据。
2. 适配体技术原理：熟悉适配体的筛选、结构与功能关系等知识。明白如何通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选出对维生素D具有高亲和力和特异性的适配体，以及适配体与维生素D结合的分子机制。
3.传感器构建理论：已掌握各类传感器的构建原理，如电化学传感器、光学传感器等，清楚如何将富勒烯与适配体结合，实现对维生素D的特异性识别和信号转换，为设计基于富勒烯适配体的维生素D传感器提供理论指导。
4.适配体制备与表征：已掌握适配体的合成、纯化技术，以及对适配体的结构和性能进行表征的方法，如核磁共振、圆二色谱等，确保所使用的适配体具有正确的结构和良好的活性，能够特异性地识别维生素D。
5.魏胤老师在富勒烯材料应用、适配体传感器开发或维生素D检测等相关领域开展过前期研究工作，取得了一定的研究成果，发表了相关的学术论文，这些成果为当前课题的深入研究提供了技术积累和参考依据。
6.此前已搭建起基础检测平台，验证了检测方法的可行性，对检测过程中的非特异性吸附等问题进行研究并采取相应优化措施，降低背景信号干扰，提高检测的准确性 。
实验缺少高精度的仪器，如用于表征富勒烯适配体传感器性能的电化学工作站、表面等离子体共振仪等。解决方法是申请专项经费购买或联系有此类设备的科研机构进行合作，以借用设备完成相关测试。实验材料可能会有所不足，高质量的富勒烯、特异性适配体以及维生素D标准品等可能供应不足或质量不稳定。解决方法是与信誉良好的供应商建立长期合作关系，确保材料的稳定供应和质量；也可以尝试自行合成或纯化部分材料，以降低成本并提高材料的可控性。在实验过程中，可能会遇到一些复杂的技术问题，如传感器的修饰和组装技术、数据处理和分析方法等。解决方法是邀请相关领域的专家进行技术指导，或派研究人员参加专业培训课程，学习先进的技术和方法。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 8000.00 无 5000.00 3000.00
1. 业务费 3000.00 无 1500.00 1500.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 无 1500.00 1500.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 5000.00 无 3500.00 1500.00
结束

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