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硫胺素对酒精所致海马神经元损伤的影响—基于星形胶质细胞的研究

申报人：王靖涵 申报日期：2025-03-18

基本情况

2025创新项目
硫胺素对酒精所致海马神经元损伤的影响—基于星形胶质细胞的研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
研究表明硫胺素对酒精所致的神经损伤具有一定的保护作用。星形胶质细胞在酒精所致海马损伤中扮演着重要角色。然而，关于硫胺素对酒精所致海马神经元损伤的具体作用机制，尤其是通过调节星形胶质细胞来发挥作用的机制尚不明确。本研究拟从细胞水平分析硫胺素在酒精性海马损伤中的作用以及星形胶质细胞的调节作用。首先分离并培养星形胶质细胞和海马神经元，建立共培养体系；然后分别给予酒精、硫胺素以及酒精+硫胺素处理，并设置对照组；通过细胞生物学、形态学、电生理记录、相关基因qRT-PCR检测等手段，分析硫胺素对海马神经元酒精损伤、星形胶质细胞共培养海马神经元酒精损伤的影响，评估硫胺素的保护作用及可能机制。本研究将阐明硫胺素是否能够减轻海马神经元酒精性损伤，以及星形胶质细胞在其中发挥的作用，为预防和治疗酒精相关神经损伤提供新的策略和理论依据。
2023.03—2025.03在指导老师带领下于本校公共科研平台参与实验：
1、酒精对小鼠海马神经元功能的影响
相关成果：Mechanisms of alcohol interference with hippocampal neurogenesis and its repair strategies. 1/6 (投稿中)
2、基于SNP、代谢组、蛋白质组技术研究精神分裂症发病机制
相关成果：
The association of SNP rs3775291 with schizophrenia is influenced by age. 7/13 （投稿中）
Hypothesis of the pathogenesis of schizophrenia based on proteomics. 5/8 (投稿中)
3、基于代谢组学技术分析番茄红素加重酒精所致急性胃损伤的机制研究
1.贺林院士新医学临床转化工作站科研基金项目，JYHL2021MS15，番茄红素加重乙醇所致急性胃损伤的机制研究，2022.01-2024.12，10万元，在研，主持
2.山东省自然科学基金青年项目，ZR2021QC148，定向提高三孢布拉氏霉CarA活力及其结构-功能关系分析，2022.01-2024.12，27万元，在研，主持
3.山东省医药卫生科技发展计划项目，2019WS359，番茄红素联合奥氮平治疗精神分裂症的疗效及其机制，2020/06-2022/06，2万元，已结题，主持
4.国家级大学生创新训练计划项目，201910443014，利用代谢组学分析三丙胺促进三孢布拉氏霉生成番茄红素的作用机制，已结题，指导老师
    指导教师一直从事应用动物模型和细胞分析酒精作用的相关研究，并负责我校公共科研平台管理工作，同时作为脑片膜片钳与离子成像系统、激光共聚焦显微镜等大型科研仪器的技术支持，对该方向有深入的了解，并有一定前期研究基础，能够为本项目提供各方面支持。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
王靖涵 临床医学院（附属医院） 临床医学（本科-临床医学院） 2022 分子实验
栾烨堃 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2024 细胞实验
魏姿雨 临床医学院（附属医院） 临床医学（超声医学方向） 2022 动物饲养、细胞培养
刘继锋 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 电生理实验
曹墨涵 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 分子实验
徐艺嘉 医学影像与检验学院 医学影像学（本科） 2023 动物饲养、细胞培养

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
王燕龙 科研处 否

立项依据

1、明确硫胺素、乙醇和硫胺素+乙醇对星形胶质细胞的影响；
2、明确硫胺素调节的星形胶质细胞对酒精所致海马神经元损伤的影响;
3、初步分析硫胺素在星形胶质细胞介导的酒精所致海马神经元损伤中的作用机制。

1、细胞分离培养
1.1 动物饲养繁育
    6周龄C57BL小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。于济宁医学院实验动物中心培养，保持12小时光/暗周期，温度为22°C±1°C。适应一周后进行扩繁。
1.2 皮层星形胶质细胞原代培养
    皮层星形胶质细胞从新生24h内小鼠中制备，雌性和雄性星形胶质细胞分别在不同的培养瓶中培养。星形胶质细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，在37°C、5%CO₂/95%空气的湿润培养箱中培养10-16天。然后将两个培养瓶（一个为仅含雌性星形胶质细胞，另一个为仅含雄性星形胶质细胞）进行胰蛋白酶处理；来自雌性和雄性星形胶质细胞培养瓶的细胞悬浮液混合后，接种到含有圆形玻璃盖玻片的24孔板中（每孔1×10⁵个细胞）。这样制备的培养物为平衡的混合性别培养物。星形胶质细胞再培养3天，然后换成无血清DMEM，补充0.1%牛血清白蛋白（BSA，Sigma Aldrich）和青霉素/链霉素，培养24小时，随后进行乙醇、硫胺素、乙醇加硫胺素或对照处理，处理液在DMEM/0.1%BSA培养基中配制，处理24小时。然后从星形胶质细胞培养物中移除含有处理液的培养基，换成无处理的DMEM/0.1%BSA。
1.3 海马神经元细胞原代培养
    海马神经元从新生1-2d的小鼠海马组织中制备，在冰浴的PBS中分离海马，用PBS洗涤3次，剪碎用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30分钟，用FBS终止消化，轻轻吹打，100μm滤网过滤，收集滤液，300g离心5分钟，用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。这些培养中使用了相同数量的雌性和雄性小鼠。
1.4 皮层星形胶质细胞-海马神经元共培养
    神经元以每片盖玻片1×10⁴个神经元的浓度接种在星形胶质细胞单层上，持续16小时，从星形胶质细胞培养物中移除处理液后2小时开始。
2、药物处理
2.1 乙醇和硫胺素处理
    接种在24孔板中玻璃盖玻片上的星形胶质细胞用1 mL含有25、50或75 mM乙醇或对照（无乙醇）培养基的DMEM/0.1%BSA培养基培养24小时。乙醇处理在密封的培养箱中进行，培养箱中有一个含有与培养物中相同酒精浓度的水的培养皿；每个培养箱中包含一种乙醇浓度处理的星形胶质细胞。5%CO2/95%空气通入培养箱，然后密封37℃培养24小时。硫胺素处理组，将星形胶质细胞培养物用1 mL含有0（对照）、10、50或100 mM硫胺素的DMEM/0.1%BSA培养基培养24小时来完成。为了测试乙醇和硫胺素对神经突起生长的联合效应，星形胶质细胞用75 mM乙醇、100 mM硫胺素、75 mM乙醇+100 mM硫胺素或对照（无处理）DMEM/0.1%BSA培养基培养24小时。
2.2 乙醇浓度测定
    采用高效液相色谱仪（HPLC）检测处理开始和结束时培养基中的乙醇浓度。配制不同浓度乙醇标准溶液，C28色谱柱30℃、0.8-1.5mL/min流速、紫外检测器210nm检测，记录峰面积绘制标准曲线。然后将培养基与乙腈溶液混合后进行测定，根据标准曲线计算样本中乙醇的浓度。确保在暴露期间乙醇没有显著蒸发。
3、硫胺素对海马神经元的影响
3.1 渗透压
    研究表明，渗透压的变化会影响神经突起的生长[1]。因此，我们测定了对照培养基、含有100 mM硫胺素的培养基在24小时培养开始和结束时的渗透压，使用低温冰点渗透压仪测量渗透压。每个时间点的样本来自三个独立的重复实验；每个样本运行三次，结果以mmol/kg表示。
3.2 细胞活性
    使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）实验（Sigma Aldrich）检测暴露于硫胺素的海马神经元的活性。将细胞与含有0.5 mg/mL MTT的500 mL DMEM/0.1%BSA培养基共同孵育2小时。然后从海马神经元单层中移除含有MTT的培养基，加入500 mL DMSO，用酶标仪检测570 nm吸光度值；数据以对照组的百分比表示。
3.3 免疫荧光染色
    用磷酸缓冲液冲洗，4%多聚甲醛固定海马神经元，并用β-Ⅲ微管蛋白抗体进行免疫染色，随后用Alexa Fluor 488二抗进行染色。
3.4 形态学观察
    使用激光共聚焦显微镜观察神经元形态。仅选择满足以下条件的细胞进行分析：有三个或更多神经突，且所有神经突的长度均大于细胞体；不与其他神经元重叠；完全位于底层星形胶质细胞之上；为锥体神经元；细胞完整。同时采用Neurolucida软件对神经突进行追踪，并通过Neurolucida Explorer进行分析。对每个细胞进行三项测量：最长神经突的长度、次要神经突的平均长度和神经突的数量。
3.5 电生理记录sEPSCs
    采用膜片钳记录各组海马神经元细胞自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的幅值、频率和半衰减时间。将各组细胞培养液更换为37℃温浴后的细胞外液。在显微镜下找到胞体饱满、边界清晰、表面无凹陷的细胞进行记录。玻璃电极电阻为５-10ＭΩ并注入电极内液，使用微操控制电极接近细胞，待封接电阻稳定于1ＧΩ、1min后，给予少量负压破膜。破膜完成后进行串联电阻及膜电容补偿，在电压钳模式下观察sEPSCs的变化，记录采用gapfree模式，钳制电压为-70mV，在Igorpro软件上选择程序进行实验记录，Clampfit软件分析数据。
3.6 相关基因表达量分析
    收集各组细胞提取RNA，采用PrimeScriptTM RT试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA。对海马神经相关基因（Dnai1，Cfap206，Dnah1，Mlf1，Smad3，Plk5，Krt8，Car3和Vim）[2]进行qRT-PCR检测。分析酒精处理前后，海马神经元细胞相关基因表达量的变化。
4、硫胺素对星形胶质细胞共培养海马神经元的影响
4.1 渗透压
    我们测定对照培养基、含有100 mM硫胺素的培养基在24小时培养开始和结束时的渗透压，以及在星形胶质细胞上培养2小时的培养基的渗透压，对应于与星形胶质细胞共培养时神经元所经历的培养基。使用Vapro压力渗透压计5520（Wescor公司）测量渗透压。每个时间点的样本来自三个独立的重复实验；每个样本运行三次，结果以mmol/kg表示。
4.2 细胞活性
    使用MTT检测暴露于硫胺素或乙醇的星形胶质细胞的活性。将细胞与含有0.5 mg/mL MTT的500 mL DMEM/0.1%BSA培养基共同孵育2小时。然后从星形胶质细胞单层中移除含有MTT的培养基，加入500 mL DMSO，并检测570 nm吸光度值；数据以对照组的百分比表示。
4.3 免疫荧光染色
    星形胶质细胞-神经元共培养后，用磷酸缓冲液冲洗，4%多聚甲醛固定细胞，并用β-III微管蛋白抗体进行免疫染色，随后用Alexa Fluor 488二抗进行染色。
4.4 形态学观察
    使用激光共聚焦显微镜观察神经元形态。仅选择满足以下条件的细胞进行分析。同时采用Neurolucida软件对神经突进行追踪，Neurolucida Explorer分析。测量每个细胞的最长神经突长度、次要神经突平均长度和神经突数量。
4.5 电生理记录sEPSCs
    采用膜片钳记录各组星形胶质细胞共培养的海马神经元细胞sEPSCs的幅值、频率和半衰时间。将细胞培养液更换为37℃温浴后的细胞外液。在显微镜下找到胞体饱满、边界清晰、表面无凹陷的细胞进行记录，在电压钳模式下观察sEPSCs的变化，采用gapfree模式记录，钳制电压为-70mV，Clampfit软件分析数据。
4.6 相关基因表达量分析
    收集各组细胞提取总RNA并反转为cDNA，对海马神经相关基因进行qRT-PCR检测。分析酒精处理前后，以及星形胶质细胞处理前后相关基因的表达量变化，明确星形胶质细胞介导调控海马酒精损伤的关键基因。
5. 星形胶质细胞在硫胺素影响海马神经元酒精损伤中的作用
    结合上述研究分析硫胺素如何通过星形胶质细胞影响海马神经元酒精损伤，初步探讨硫胺素作用的靶基因。
参考文献：
[1]Cubillán L, Obregón F, Lima L. Neurites outgrowth and amino acids levels in goldfish retina under hypo-osmotic or hyper-osmotic conditions. Int J Dev Neurosci. 2012;30(1):55-61. doi:10.1016/j.ijdevneu.2011.08.005
[2]Choi MR, Han JS, Chai YG, Jin YB, Lee SR, Kim DJ. Gene expression profiling in the hippocampus of adolescent rats after chronic alcohol administration. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2020;126(4):389-398. doi:10.1111/bcpt.13342
    近年来，因嗜酒和酒精滥用造成的伤害正日益成为全球性医学和社会问题，我国酒精滥用亦日趋严重。我们的前期研究发现，酒精除了对小鼠胃和肝脏造成损伤外，也会导致海马锥体细胞减少（图1）。大脑是酒精损伤的最主要器官之一，酒精中毒者均出现不同程度的学习和记忆障碍[1]。酒精性脑损伤的临床表现为记忆缺损并伴有一种或一种以上认知功能受损的精神行为异常，同时可伴有震颤、谵妄、痉挛发作等神经功能障碍[2]。目前研究认为酒精导致学习记忆功能障碍的主要机制是酒精毒性造成海马组织结构破坏及其相关信号通路失调，尤其是导致海马神经元大量丢失[3]。
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图1.酒精和高剂量番茄红素对小鼠不同组织的影响（未发表）
    硫胺素（维生素B1）是影响脑能量代谢的关键营养素。临床研究表明，大剂量硫胺素治疗酒精中毒性脑病的疗效显著[4],对慢性酒精中毒性胼胝体变性急性期患者，采用大剂量硫胺素治疗可使患者尽快苏醒,并有效减少后遗症的发生[5]。由此可见，硫胺素对酒精性脑病具有良好的治疗作用。星形胶质细胞是哺乳动物大脑中最丰富的神经胶质细胞类型，通过与神经元突触的动态、双向相互作用，成为大脑发育和生理功能的关键调节器[6]。已有研究证明，酒精会导致星形胶质细胞损伤，进而影响海马区神经突起的生长[7]。因此，基于星形胶质细胞研究硫胺素对酒精所致海马神经元损伤的影响，为进一步认识酒精性脑病发病机制及优化治疗方案提供了新的思路。
    发育期酒精暴露所引起的认知和行为后果，可能在一定程度上源于神经可塑性和连接性的改变，这一观点得到了啮齿动物临床前研究和人类成像研究的证实[8,9,10]。星形胶质细胞在大脑发育的各个阶段均发挥着关键作用，其不仅参与血脑屏障的发育，还高度参与突触的形成、功能成熟和修剪过程[11,12]。研究表明，乙醇对神经可塑性的影响可能是通过星形胶质细胞介导的[13]。此外，星形胶质细胞在神经突生长中也起重要作用，并介导乙醇对神经元发育的影响[7,14,15]。在体外培养条件下，神经元只有在与星形胶质细胞共培养时，才能更快地发育并达到完全的形态和功能成熟[16,17,18]，这进一步突显了星形胶质细胞在神经发育中的关键作用。
    硫胺素是维持细胞完整性所必需的维生素，其缺乏会导致线粒体能量代谢异常，进而引发氧化应激、神经炎症、神经发生减少、血脑通透性增加、乳酸中毒和星形胶质细胞功能完整性改变[19]。研究表明，酒精降低了小鼠脑内硫胺素水平[20]。临床上，对有数十年饮酒史且胼胝体受损患者补充硫胺素，结果显示患者状况明显好转[21]。Hakim等人研究发现星形胶质细胞是脑中乳酸生成的主要来源，硫胺素缺乏患者乳酸性酸中毒的增加与脑中局灶区域PH的降低有关[22]。此外，研究还表明，硫胺素缺乏导致星形胶质细胞肿胀与水通道蛋白-4（AQP-4）水平改变有关[23]。然而，目前尚未见基于星形胶质细胞研究硫胺素对酒精所致海马神经元损伤影响的相关研究。本研究将从细胞水平明确硫胺素是否能够减轻酒精对星形胶质细胞介导的海马神经元损伤，并进一步分析其作用机理，为预防和治疗酒精相关神经损伤提供新的策略和理论依据。
参考文献：
[1]周永健.急、慢性酒精中毒[J].肝博士,2018,(05):15-16.
[2]李舜伟.认知功能障碍的诊断与治疗[J].中国神经精神疾病杂志,2006,(02):189-191.
[3]Alfonso-Loeches S, Guerri C. Molecular and behavioral aspects of the actions of alcohol on the adult and developing brain. Crit Rev Clin Lab Sci. 2011;48(1):19-47. doi:10.3109/10408363.2011.580567
[4]李凤芹.大剂量维生素B1治疗慢性酒精中毒性脑病临床分析[J].中国社区医师(医学专业),2012,14(17):88.
[5]钟洪智,钱德才,胡佳.慢性酒精中毒性胼胝体变性急性期临床诊疗分析[J].局解手术学杂志,2010,19(06):504-505.
[6]Allen NJ, Eroglu C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 2017;96(3):697-708. doi:10.1016/j.neuron.2017.09.056
[7]Guizzetti M, Moore NH, Giordano G, VanDeMark KL, Costa LG. Ethanol inhibits neuritogenesis induced by astrocyte muscarinic receptors. Glia. 2010;58(12):1395-1406. doi:10.1002/glia.21015
[8]Lebel C, Mattson SN, Riley EP, et al. A longitudinal study of the long-term consequences of drinking during pregnancy: heavy in utero alcohol exposure disrupts the normal processes of brain development. J Neurosci. 2012;32(44):15243-15251. doi:10.1523/JNEUROSCI.1161-12.2012
[9]Medina AE. Fetal alcohol spectrum disorders and abnormal neuronal plasticity. Neuroscientist. 2011;17(3):274-287. doi:10.1177/1073858410383336
[10]Wozniak JR, Mueller BA, Bell CJ, et al. Global functional connectivity abnormalities in children with fetal alcohol spectrum disorders. Alcohol Clin Exp Res. 2013;37(5):748-756. doi:10.1111/acer.12024
[11]Allen NJ, Lyons DA. Glia as architects of central nervous system formation and function. Science. 2018;362(6411):181-185. doi:10.1126/science.aat0473
[12]Farhy-Tselnicker I, Allen NJ. Astrocytes, neurons, synapses: a tripartite view on cortical circuit development. Neural Dev. 2018;13(1):7. Published 2018 May 1. doi:10.1186/s13064-018-0104-y
[13]Guizzetti M, Zhang X, Goeke C, Gavin DP. Glia and neurodevelopment: focus on fetal alcohol spectrum disorders [published correction appears in Front Pediatr. 2015 Apr 21;3:27. doi: 10.3389/fped.2015.00027.]. Front Pediatr. 2014;2:123. Published 2014 Nov 11. doi:10.3389/fped.2014.00123
[14]Guizzetti M, Moore NH, Giordano G, Costa LG. Modulation of neuritogenesis by astrocyte muscarinic receptors. J Biol Chem. 2008;283(46):31884-31897. doi:10.1074/jbc.M801316200
[15]Zhang X, Bhattacharyya S, Kusumo H, Goodlett CR, Tobacman JK, Guizzetti M. Arylsulfatase B modulates neurite outgrowth via astrocyte chondroitin-4-sulfate: dysregulation by ethanol. Glia. 2014;62(2):259-271. doi:10.1002/glia.22604
[16]Dotti CG, Sullivan CA, Banker GA. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J Neurosci. 1988;8(4):1454-1468. doi:10.1523/JNEUROSCI.08-04-01454.1988
[17]Kaech S, Banker G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 2006;1(5):2406-2415. doi:10.1038/nprot.2006.356
[18]Pfrieger FW, Barres BA. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 1997;277(5332):1684-1687. doi:10.1126/science.277.5332.1684
[19]Abdou E, Hazell AS. Thiamine deficiency: an update of pathophysiologic mechanisms and future therapeutic considerations. Neurochem Res. 2015;40(2):353-361. doi:10.1007/s11064-014-1430-z
[20]Xu H, Liu D, Chen J, et al. Effects of Chronic Voluntary Alcohol Drinking on Thiamine Concentrations, Endoplasmic Reticulum Stress, and Oxidative Stress in the Brain of Crossed High Alcohol Preferring Mice. Neurotox Res. 2019;36(4):777-787. doi:10.1007/s12640-019-00032-y
[21]Iwai T, Matsuo K, Morii-Kitani F, et al. Marchiafava-Bignami disease with hyperintensity on late diffusion-weighted imaging. Acta Radiol Short Rep. 2014;3(7):2047981614543284. Published 2014 Aug 18. doi:10.1177/2047981614543284
[22]Hakim AM. The induction and reversibility of cerebral acidosis in thiamine deficiency. Ann Neurol. 1984;16(6):673-679. doi:10.1002/ana.410160609
[23]Chan H, Butterworth RF, Hazell AS. Primary cultures of rat astrocytes respond to thiamine deficiency-induced swelling by downregulating aquaporin-4 levels. Neurosci Lett. 2004;366(3):231-234. doi:10.1016/j.neulet.2004.04.095
    目前已有研究表明硫胺素对酒精所致的神经损伤具有一定的保护作用，且星形胶质细胞在其中扮演着重要角色。然而，关于硫胺素对酒精所致海马神经元损伤的具体作用机制，尤其是通过调节星形胶质细胞来发挥作用、及其作用机制尚未完全明确。
    本研究拟从细胞水平分析硫胺素是否能够减轻酒精对星形胶质细胞介导的海马神经元损伤，并初步探讨其作用机制，为预防和治疗酒精相关神经损伤提供新的策略和理论依据。
1、技术路线
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2、拟解决的问题
1）明确硫胺素对海马神经元酒精性损伤的影响；
2）明确星形胶质细胞在硫胺素调节海马神经元酒精性损伤中的作用。
3）为预防和治疗酒精相关神经损伤提供新的策略和理论依据。
3、预期成果
1）明确硫胺素是否能够减轻海马神经元酒精性损伤，以及硫胺素在这个过程中的作用；
2)  基于以上成果发表高水平论文1-2篇。
本项目拟按如下计划进行：
2025/06/01-2025/12/31
细胞培养及共培养体系的建立与优化
2026/01/01-2026/05/31
进行预实验，药物处理及相关指标检测、形态学分析
2026/06/01-2026/12/31
电生理实验、相关基因表达量分析
2027/01/01-2027/05/31
实验结果分析，论文修改及投稿
1）熟练掌握酒精对小鼠作用的相关实验方法
    前期通过参与番茄红素对乙醇诱导胃损伤的影响实验，以及作用机制。我们已经熟练掌握小鼠造模、解剖、眼球取血、组织匀浆、各种生化指标检测、ELISA等实验技术。我们将小鼠随机分为正常对照组、番茄红素对照组、胃损伤对照组、20mg/kg 奥美拉唑阳性对照、番茄红素实验组（50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg）。对粘膜损伤程度（图 2）、胃液总量、胃液总酸度、胃动素，胃组织中的超氧化物歧化酶、丙二醛、NO、IL-6、质金属蛋白酶-9，以及肝组织中的过氧化氢酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶进行了检测，同时取胃组织作病理分析。
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图2 番茄红素对小鼠胃黏膜的影响（已发表）
    此外，我们前期采用非靶向代谢组学技术分析酒精的作用机制。共筛选出29种关键差异代谢物，主要包括有机酸及其衍生物、有机含氧化合物、脂质和类脂分子（图3）。我们发现，高剂量番茄红素显著降低了胃组织中DA的活性，通过改变糖酵解、能量代谢和氨基酸代谢相关基因的表达量，使TCA循环途径代谢物水平降低，磷酸和脯氨酸-羟脯氨酸（Pro-Hyp）水平升高，从而损伤胃黏膜（图4）。
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图3 番茄红素和酒精处理后小鼠血清中的差异表达代谢物（未发表）
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图4 关键代谢物及相关基因的差异表达（未发表）
    此外，高剂量番茄红素还显著增加了脑组织中5-HT、β-EP和GSH的含量，降低了谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和尿嘧啶水平，因此，酒精引起的脑组织海马锥体细胞减少进一步加剧。然而，它还显著降低了肝脏中的ALDH活性，增加了丙氨酸-天冬氨酸（Ala-Asp）和葡萄糖含量，降低了硬脂酸和2-甲基戊二酸含量，从而减轻了酒精引起的肝细胞囊泡性脂肪变性和水样变性（图5）。低剂量番茄红素对脑和肝脏具有保护作用。我们的研究初步阐明了番茄红素在酒精诱导的胃损伤中的作用和机制，为番茄红素的日常和临床应用提供了参考。
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图5 5-羟色胺、β-EP、ALDH、GSH水平(A)及肝脑组织组织学形态变化(B)（未发表）
2）熟练掌握酒精对海马损伤相关的实验方法
    前期，项目负责人查阅了大量酒精导致脑损伤的相关研究，并撰写综述《Mechanisms of Alcohol Interference with Hippocampal Neurogenesis and Its Repair Strategies》（1/6，投稿中）。发现酒精暴露通过多种方式影响海马神经发生，并且对胎儿期、青春期和成年期的影响不同，图6所示为胎儿期。胎儿期海马体的形成对酒精暴露最敏感，会导致齿状回体积减小、海马神经元丧失、神经营养因子水平降低等多种缺陷，并且会持续到成年。青春期酗酒对海马体产生的损害大于成年期。同时对修复策略进行了综述，为酒精性脑损伤的诊断和治疗提供新的思路。
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图6 酒精对胎儿期海马的影响（未发表）
    此外，为了本项目的顺利进行，指导老师在公共科研平台建立了膜片钳电生理平台。而且我们前期对应用膜片钳记录小鼠脑组织皮层神经细胞电流相关实验进行了摸索，现已熟练掌握细胞内外液配制、渗透压检测、电极拉制、微操使用、细胞培养、全细胞记录等电生理相关技术。图7所示为记录到的钠电流和动作电位。
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图7 小鼠大脑皮层神经细胞钠电流和动作电位
2.1.1 工作基础扎实
    本课题组相关成员年级梯度合理，主要实验人员前期均参加过与小鼠相关的实验项目，可以熟练操作多种仪器设备，为本项目的实施奠定基础。
2.1.2 实验室设备完善
    本项目依托贺林院士新医学临床转化工作站和公共科研平台，具备项目实验研究所需的全部设备和实验条件，包括：SPF级动物房、细胞生物学实验室、分子生物学设备（ThermoFisher 7500 FAST 型快速荧光实时定量 PCR 仪、酶标仪、电泳仪）、酶学分析设备（新芝JY92-IIN超声波细胞粉碎机、eppendorf台式冷冻超速离心机、Bio-Rad蛋白电泳转移系统）、成像系统（徕卡激光扫描共聚焦显微镜、Nikon eclipse Ti-U荧光倒置显微镜、proteinsimple FluorChemQ全自动凝胶成像系统）、电生理平台（MultiClamp 700B脑片膜片钳、电极拉制仪、脑组织切片仪、低温冰点渗透压仪）、检测仪器（岛津高效液相色谱仪、BD AriaⅢ 分选型流式细胞仪、eppendorf BioSpectrometer分光光度计）、常规实验仪器（立式压力 蒸汽灭菌器、海尔超低温-80℃冰箱、Scotsman AF103制冰机、超净工作台）等。平台条件完善，全部实验设备均已具备，为项目的顺利实施提供保障。
2.2尚缺少的条件及解决方法
    无。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 10000.00 10000.00
1. 业务费 4000.00 无 0.00 4000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 4000.00 版面费 0.00 4000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 16000.00 小鼠、试剂耗材 10000.00 6000.00
结束

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