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多维度解析归芍地黄丸抗帕金森病的作用机制： 网络药理学预测-分子对接筛选-实验验证的整合研究

申报人：谭新浩 申报日期：2025-03-17

基本情况

2025创新项目
多维度解析归芍地黄丸抗帕金森病的作用机制： 网络药理学预测-分子对接筛选-实验验证的整合研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
帕金森病（Parkion's Disease，PD）是一种以中脑黑质多巴胺能神经元变性为特征的神经退行性疾病，现有西药治疗难以有效阻断病情进展。中医药以其多成分、多靶点、多途径的优势，在PD治疗中展现出独特潜力，尤其是复方中药如归芍地黄丸已在临床治疗中取得显著疗效。然而，其具体作用机制尚不明确。本研究团队通过构建归芍地黄丸活性成分与帕金森病（PD）相关靶点的相互作用网络，并运用分子对接、分子动力学模拟技术，旨在筛选出关键的活性成分及其作用靶点。本课题将揭示这些成分和靶点之间的多成分、多靶点协同作用的分子机制，为后续的实验验证和临床应用提供坚实的科学基础，进而推动中医药在帕金森病治疗领域的现代化进程。
2022级临床药学专业学生，科研基础扎实，实践能力强。深度参与校级创新项目《通天口服液治疗帕金森病的潜在机制研究》，构建了“数据驱动-靶点识别-机制验证”的研究框架。展现出科研热情、快速学习能力、复杂问题解决潜力及对前沿技术的敏感性，具备优秀可培养潜质。其核心能力（数据整合分析、靶点机制探索、实验验证设计执行）与本次申报项目高度契合，可为项目实施提供坚实技术支撑和高效执行保障。
张静在中医药科研领域成果丰硕，主持和参与10余项课题，包括中医药资源管理局、日照市科技局及校级创新项目等。她在Tissue & Cell、PLOS ONE、Front Pharmacol、Eur J Pharm Sci及中国病理生理杂志等国内外优秀期刊发表多篇论文，展现了深厚的专业造诣。多次指导学生参加全国“药苑论坛”，获特等奖、二等奖、三等奖各1次，还指导学生在山东省第十四届“挑战杯”竞赛中获银奖，充分体现了她在培养学生创新能力方面的卓越才能。
指导教师正在主持一项有关PD发病机制研究的项目，对本次大学生创新项目的文献调研、选题、开题以及后续的相关实验研究可全程提供帮助。项目申请成功后，会从理论、技术层面进行指导，全力支持此项目的开展；为后续科学研究奠定理论和技术基础。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
谭新浩 药学院 临床药学（本科） 2022 统筹实验项目及文章撰写
孔萌博 药学院 临床药学（本科） 2023 动物实验相关指标检测
王莹莹 药学院 临床药学（本科） 2022 文献汇总及PD模型小鼠的制备
李首富 药学院 临床药学（本科） 2022 网络药理学分析、分子对接及分子动力学模拟

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张静 药学院 否

立项依据

①明确活性成分与靶点：运用网络药理学、分子对接及分子动力学模拟技术，系统筛选归芍地黄丸治疗帕金森病（PD）的活性成分及其潜在作用靶点，揭示药物-疾病的分子关联。
②解析协同作用机制：从多成分、多靶点、多通路层面，深入剖析归芍地黄丸干预PD 的协同作用机制，阐释其延缓疾病进展、改善症状的科学内涵。
③提供理论支撑：为归芍地黄丸治疗PD的后续基础实验验证和临床精准用药提供理论依据，助力推动中医药在PD治疗领域的创新发展与应用。
1.网络药理学分析
（1）归芍地黄丸活性成分和帕金森病交集靶点的获取
①利用中药系统药理学分析平台（TCMSP，https://TCMSP w.com/tcmsp.php）筛选归 芍地黄丸组方中当归、白芍、熟地黄、山荣萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻化学成分和作用靶点。根据文献报道的最佳毒理动力学ADMT规则（OB≥30%，DL≥0.18）筛选出主要有效成分。将所得的有效成分在TCMSP的Related Targets中获得药物靶点，将所得的靶点通过Uniprot数据库查询靶点对应的基因。对其中无对应靶点的药物小分子在PubChem数据库中搜索各个候选成分，得到所有化合物的SMILE化学方程式，然后上传至SwissTargetPrediction靶点预测数据库，用来预测各种组分的潜在作用靶标，补充的靶点同样通过Uniport数据库获得靶点对应的基因，由此获得药物靶点基因。
②通过访问OMIM（https://www.omim.org/）、TTD（https://db.idrblab.net/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）以及GeneCards（https://www.genecards.org/）这四个疾病相关数据库，我们以“Parkinson’s Disease”作为关键词进行了数据检索。在处理这些数据时，我们首先对OMIM数据库检索结果进行了去重处理，然后复制了TTD数据库的数据。对于DisGeNET和GeneCards数据库的数据，我们应用了“MEDIAN”函数进行中位数筛选，鉴于这两个数据库中靶点数量较多，我们选取了评分高于或等于中位数的靶点作为关键靶点。最后，我们将所有数据库中的基因数据进行整合、去重和合并，形成了一个综合的疾病数据库，并绘制了多元维恩图。
③将所得的药物与疾病基因导入微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn）利用平台的jvenn绘图，药物基因作为第一列，疾病基为第二列，获得药物－疾病交集基因。
（2）PPI网络的构建及核心靶点的筛选
将交集基因导入String数据库（https://www.string-db.org），选择“Multiple Proteins，Homo Sapiens”作为筛选条件，将得到的交集基因用于构建蛋白质相互作用网络（PPI）。在PPI中设置参数以隐藏未连接的节点，并筛选出置信度大于0.4的节点，以生成TSV文件。接着，在Cytoscape 3.9.1中打开并导入该TSV文件，进行分析处理。首先，使用Cytoscape 2.2对网络进行筛选，基于Degree、Betweenness和Closeness三个指标计算PPI网络，并利用数据过滤器Filter添加相同的三个过滤条件，删除小于这些数值的靶点，从而得到关键靶点。最后，利用Cytoscape中的cytoHubba插件对网络进行运算分析，选取排名前六的蛋白，并导出数据，将这六位蛋白的基因作为核心靶点。
（3）GO富集分析和KEGG富集分析以及靶点的组织表达可视化
将获得的重要靶点导入Metascape网站中，选择H.sapiens为运算条件，选择 Custom Analysis作为分析条件。Enrichment界面设置富集分析条件， 每一次的富集分析只能选择一种功能分析，包括Biological processes、Morecular Function、Cellular Components和 KEGG Pathway。将获得的数据导入微生信平台绘制气泡图进行可视化。综合分析结果，利用网络药理学方法，我们初步筛选出归芍地黄丸治疗帕金森病（PD）的关键靶点以及潜在的作用途径。
（4）分子对接验证
在PubChem数据库中检索并下载小分子的3D结构文件，并在PDB数据库（https://www.rcsb.org/）中获取核心靶点蛋白的3D结构。使用PyMOL软件移除蛋白中原有的配体，并将结果保存为PDB格式。使用AutoDock 1.5.7软件时，先对核心成分加氢、设为配体、选择扭转键，并对靶点去水、加氢、设为受体，保存为PDBQT格式。在AutoDock中，通过“Grid>Grid Box”设置盒子包围蛋白，进行分子对接模拟并计算结合能。最后，将复合物导入Pymol软件进行可视化分析。
（5）分子动力学模拟
采用Gromacs 2022进行分子动力学模拟。通过Gromacs的pdb2gmx工具和AutoFF网页获得力场参数。在模拟过程中，受体蛋白的分子参数则采用CHARMM36力场，配体的分子参数使用CGenff力场。将系统周围加上1 nm的TIP3P型立方体水盒子进行溶剂化。利用gmx genion工具，在体系中添加了离子，以实现系统的电中性。长程静电相互作用通过The Particle Mesh Ewald（PME）方法进行处理，截断距离设置为1 nm。所有键的约束通过SHAKE算法完成，采用Verlet蛙跳算法将分子动力学模拟过程中的积分步长设置为1 fs。在分子动力学模拟前，体系经过能量优化。能量最小化过程包括3000步最陡下降法优化，接着进行2000步的共轭梯度法优化。优化步骤如下：首先约束溶质并对水分子进行能量最小化；接着约束抗衡离子并进行能量最小化；最后在无约束情况下对整个系统进行能量最小化。模拟运行条件为310 K的温度和恒压下的NPT系统，模拟时间为100 ns。在模拟过程中，使用g-rmsd、g-rmsf、g-hbond、g-Rg和g-sasa工具分别计算均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、氢键（HBonds）、回旋半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）。
综合分析表明，通过网络药理学、分子对接以及分子动力学模拟的研究，进一步验证了归芍地黄丸在治疗帕金森病（PD）方面的靶点是可靠的。该药物能够通过多种成分、途径和靶点协同作用，有效治疗帕金森病，从而为后续的动物实验提供了坚实的理论基础。

2.实验研究
本课题组计划通过动物实验探究归芍地黄丸对PD模型小鼠运动功能的改善作用以及对多巴胺能神经元损伤的改善作用。
动物实验
①分组情况：首先，将C57BL/6J雄性小鼠分为五个组别：正常对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。从第1天至第14天，对低、中、高剂量组分别进行灌胃，使用相应浓度的归芍地黄丸溶液，每次灌胃体积为0.1 mL/10g。在第1天至第7天期间，正常对照组和模型组均接受等体积的生理盐水灌胃。到第8天，正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水，而模型组、低、中、高剂量组则腹腔注射15 mg/kg的MPTP进行造模，共注射4次，每次间隔2小时。从第9天至第14天，对照组和MPTP组继续接受等体积的生理盐水灌胃。整个实验过程遵循济宁医学院动物伦理委员会的相关规定。
②行为学测试：在造模后的第13天，我们分别进行了爬杆实验和旷场实验，以观察造模和给药后小鼠的肢体活动情况。随后，在造模后的第14天，我们又进行悬尾实验和胶布移除实验，进一步观察小鼠的运动能力。
③取材方案：实验结束后，小鼠经3%戊巴比妥钠麻醉，开胸暴露心脏。刺破右心耳，向左心室灌注生理盐水（约体重两倍量）。随后取脑组织，分离中脑黑质和纹状体，冻存于-80℃，用于后续WB实验和生化检测。另一组小鼠在生理盐水灌注后，注入相同体积的4%多聚甲醛，随后进行取材并固定，以便进行免疫组织染色。
④形态学检测：首先，通过苏木素-伊红（HE）染色对小鼠黑质部进行组织结构和细胞形态变化的观察，以研究药物对MPTP诱导的帕金森病（PD）小鼠模型的改善效果；其次，通过免疫组织荧光实验对黑质和纹状体部进行TH表达含量的检测，进一步分析药物对MPTP诱导的PD小鼠模型的改善作用。
⑤组织学检测：通过定量聚合酶链反应（qPCR）检测纹状体中多巴胺（DA）的含量以及酪氨酸羟化酶（TH）的表达量，评估药物对帕金森病（PD）小鼠模型中DA含量和TH蛋白表达的影响；随后执行蛋白印迹（Western blot，WB）实验，以确定药物对PD小鼠纹状体中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）蛋白表达水平的作用，从而探究该药物对多巴胺能神经元的潜在改善效果，并评估其是否具备抗神经炎症的特性。
⑥肝毒性检测：确保化合物用于疾病治疗的安全性至关重要。首先，我们利用ADMETlab网站对归芍地黄丸可能对肝脏产生的毒性进行预测；接着，通过观察肝脏的大体形态学变化来评估其外观；进一步，使用ALT、AST试剂盒检测肝脏功能指标的具体变化；最终，通过HE染色技术观察肝脏组织的形态和结构变化，以全面探究该药物是否对肝脏产生不良反应。
经过综合分析，动物实验表明归芍地黄丸能够有效改善帕金森病（PD）模型小鼠的运动功能，并对多巴胺能神经元的损伤具有修复作用。此外，该药物符合网络药理学中多靶点、多成分、多途径的治疗原则，以改善PD小鼠模型的状况。同时，实验也证实归芍地黄丸对肝脏无不良副作用。
神经性退行性疾病死亡率仅次于心血管疾病，其危害早在2006年就被世界卫生组织关注。帕金森病作为该类疾病的典型代表，在老年人群中发病率极高[1]。在老龄化加剧的社会背景下，患有帕金森病的患者也给社会带来极大的社会经济负担。并且近年来帕金森病的发病率呈现快速上升的趋势，根据大数据推测到2030年，中国PD患者人数将会迅速上升预计占据全球PD患者的50%，早做预防和探索新的治疗机制和药物方案势在必行[2]。PD治疗包括药物方法和非药物方法[3]。然而，迄今为止，对于所有PD患者，治疗都是对症的，没有药物被证明具有明确的PD疾病改善作用[4]。
PD是我国第二大神经系统退行性疾病，在中老年发病率较高，其发病的行为特征具有静止性震颤、肌强直、运动迟缓姿势平衡障碍等特点[5]。长期服用左旋多巴后治疗效果显著下降，伴随 症状波动、运动障碍等运动并发症加剧恶化，以及情感障碍加重等非运动并发症、“剂末现象”、“开关现象”等[6]。目前帕金森病的西药治疗并未着重于信号转导、细胞凋亡等导致多巴胺能神经元消亡的可能的机制（图1），不能有效阻断病情的发展及治愈疾病，因此探寻新的治疗手段迫在眉睫。

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    图1 帕金森病（PD）的发病机制图

中医药历史悠久，且在PD治疗过程中有多靶点、多途径、减毒增效、整体调控、安 全有效等独特优势[7]。当前中药治疗帕金森病主要着重于单一药物、成分、靶点的开发，与中药治疗最基本的理念背道而驰——整体观，因此疗效欠佳。其中复方中药治疗帕金森疗效比单一运用某单一药物治疗帕金森更具有疗效，多味药物联合治疗帕金森在临床已经取得良好的治疗效果，其中归芍地黄丸已经在临床用药，治疗效果显著但其作用机制依旧不明确。
中医药及其他传统中医疗法在治疗或是辅助治疗帕金森上已经发挥出显著的效果：提 高临床疗效、延缓病程进展、减轻临床症状，在医疗界已取得广泛关注和认同[8]。现代医学对帕金森病的治疗以口服药物为主，其中最常用的药物是左旋多巴，体内芳香L-氨基酸脱羧酶对左旋多巴具备催化加工的作用，进而将左旋多巴转变为多巴胺，可以提高帕金森病患者脑内多巴胺水平的目的，进而达到代替治疗的目的，但长期服用后存在较为严重的副作用，如易导致患者出现开关现象、异动症等不良反应，减弱治疗效果[9]。
多巴胺受体位于突触后膜，具有多种亚型。其中麦角类和非麦角类多巴胺受体激动剂 可以选择性作用多巴胺受体不同亚型，达到左旋多巴类似的生理学作用，但在单独应用时 疗效欠理想、并且费用较高，同样伴随症状波动以及并发症的发生[10]。另一种治疗帕金森的药物是抗胆碱能药物，抗胆碱能药物主要通过调节乙酰胆碱的活性，来改善帕金森病患者的运动功能，但是使用后往往出现认知功能下降等并发症[11]。同样治疗帕金森的儿茶酚-O-甲基转移酶催化多巴胺转变成3-甲氧酪胺，3-甲氧酪胺随后经单胺氧化酶-B氧化转化为高香草酸，导致体内多巴胺的消耗[12]。因此，单胺氧化酶-B型抑制剂以及儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂均能通过阻止多巴胺的降解，间接使体内多巴胺的水平增加，从而有效地改善患者运动障碍等并发症的出现，并且具有潜在的神经保护作用[13]。虽然治疗帕金森病药物的联合应用能够作用于多个靶点，在帕金森早期症状上如运动波动、运动障碍等并发症，确实有显著的治疗效果，但随着用药时间和剂量的增加会出逐渐现耐受作用，药物的治疗效果逐渐下降，并且还可能促进精神障碍、自主神经功能障碍等非运动症状的发生[14]。西药治疗帕金森短期内或许效果明显但其长期的使用引发的副作用丝毫不比帕金森本身对患者的伤害低，而利用中药既能有效减缓帕金森的发病进程，其药理毒副作用也比西药来的要小[15]。
临床治疗中中医结合西药治疗帕金森比单一运用某一药物治疗帕金森具有更好的疗效，其中归芍地黄丸在临床治疗中具有显著的疗效，极大程度上延缓了帕金森病的发病进程。归芍地黄丸的组方中地黄现代药理具有抗氧化、镇静作用，能有效降低代谢率，减少氧耗量，其中地黄寡糖可促进骨髓红系母细胞的增殖，增加红细胞数及血红蛋白含量，利 于携氧[16]，携带氧气量提升可以提高脑部的活力对于帕金森的疾病发展可能具有阻碍作 用。茯苓多糖的现代药理作用可促进造血、提高血清中SOD活性，减少MDA含量，增强机体抗氧化损伤和抗衰老能力[17]。而帕金森的致病机理中包含了氧化应激，茯苓多糖 的药理作用上能够应对该机理，并且茯苓多糖还具有催眠作用，可降低代谢率，而帕金森的并发症中也包括失眠，长期的睡眠不足会使人的免疫力下降，茯苓多糖包含的药理作用正是对症下药在一定程度上减轻病痛。
丹皮酚现代药理作用表现出镇静、催眠、抗惊厥、增强免疫、抗氧化和抗钙超载引起的细胞损伤等多种作用，对脑、肾、心等重要器官缺血再灌注损伤具有保护作用[18,19]。帕金森病的主要发病机理是由于黑质神经元的死亡而导致，丹皮酚对细胞损伤的多种机制，极有可能对黑质神经元起到保护作用。山茱萸总苷具备抗氧化损伤的功能，可抑制心肌细胞的细胞凋亡，保护缺氧心肌细胞。此外，山茱萸总苷的抗氧化损伤可能对黑质神经元具有保护作用[20]。山药多糖具有减少神经细胞缺氧性凋亡的作用[21]。当归中阿魏酸的现代药理作用具备抗脂质过氧化的能力，在消除自由基，抑制氧化反应和自由基反应的能力上具有独特的能力，并且阿魏酸对自由基的药理功能可以保护生物膜磷脂，进而达到保护膜脂质免受自由基对组织侵害的目的[22]。芍药主要有镇静催眠、镇痛、抗炎等药理作用，对帕金森的一些并发症状如抑郁，失眠等有较好的治疗作用[23]。
网络药理学是基于数据分析及研究药物有效成分、靶点与疾病间的复杂关系，从这一 复杂生物网络的角度理解病证和药物作用机制的新兴学科，涵盖了中药、生物靶点、证候、疾病等多种因素，具有中医药“整体观”的特性[24]。
综上所述，复方的药物对治疗帕金森病及并发症都具有治疗作用，各种活性有效成分的药理作用对探究归芍地黄丸治疗帕金森的机制意义重大[25]。因此本课题组综合利用网络药理学、分子对接及分子动力学模拟的方法，系统筛选归芍地黄丸治疗PD的相关活性成分及潜在作用靶点，深入解析其多成分、多靶点、多通路协同作用机制（图2），以期为后续基础实验验证与临床精准用药提供理论支撑。
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                                                                                                             图2 归芍地黄丸治疗PD机制图

参考文献
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①方法创新：突破性整合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟与动物实验技术，构建“数据预测-分子机制解析-动物实验验证”的全流程研究体系，打破传统单一方法局限，为复方中药复杂作用机制的系统性研究提供标准化、可复制的新范式。​
②成果创新：首次系统揭示归芍地黄丸治疗PD的活性成分群、核心作用靶点及多通路协同调控网络，填补该经典复方在PD治疗机制领域的研究空白，为开发基于中药复方的新型PD治疗方案提供开创性理论依据。
③机制创新：精准定位抗氧化、抑制细胞凋亡、抗炎等关键信号通路为归芍地黄丸干预PD的核心作用路径，通过KEGG富集分析与动物实验的交叉验证，首次实现中药复方作用机制从“虚拟预测”到“实证研究”的闭环，为后续靶向药物设计、信号通路精准调控研究提供直接的理论支撑与实验参照，开辟PD治疗机制研究的新方向。
1.技术路线
（1）整体技术路线图

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                                                                                                               图3 整体技术路线图

（2）基于生物信息学探究归芍地黄丸治疗帕金森病的作用机制

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                                                                                                                       图4 技术路线图1

①活性成分筛选：通过TCMSP数据库检索归芍地黄丸八味药材（当归、白芍等），依据ADME规则（OB≥30%、DL≥0.18）初筛活性成分；对无靶点成分通过PubChem获取SMILES结构，经SwissTargetPrediction补充靶点预测，最终确定76个活性成分（如山柰酚MOL000422、槲皮素MOL000098）。
②疾病靶点筛选：整合OMIM、TTD、DisGeNET及GeneCards四大数据库中“Parkinson's Disease”相关靶点，采用中位数筛选策略，合并去重后获2836个PD疾病靶点。
③成分-靶点网络图的构建：利用微生信平台将药物靶点（396个）与疾病靶点（2836个）取交集，绘制韦恩图，确认230个共有靶点作为关键作用靶标。
④PPI网络分析与核心靶点筛选：交集靶点导入STRING构建蛋白质互作网络（置信度>0.4），经Cytoscape 3.9.1的cytoHubba插件按Degree/Betweenness/Closeness综合排序，筛选出核心靶点。
⑤GO/KEGG富集分析：核心靶点导入Metascape网站进行功能注释。GO分析显示主要富集于磷代谢调控（GO:0010562）、细胞凋亡等生物过程；KEGG通路分析揭示PI3K-Akt（hsa04151）、IL-17（hsa04657）、TNF（hsa04668）为前三大通路，提示抗炎/抗凋亡为主导机制。
⑥分子对接：从PubChem下载成分3D结构，PDB获取靶点蛋白（如AKT1）；PyMOL处理蛋白结构后，经AutoDock1.5.7设置GridBox进行对接，结合能评估验证成分-靶点结合稳定性。
⑦分子动力学模拟：采用Gromacs 2022进行100 ns模拟：蛋白用CHARMM36力场，配体用CGenFF力场，TIP3P水模型溶剂化体系；通过RMSD（<0.2 nm）、RMSF、Rg等指标分析复合物动态稳定性，证实对接构象的生物学合理性。
（3）归芍地黄丸对帕金森病的治疗作用验证

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                                                                                                             图5 技术路线图2

①行为学测试：MPTP造模后第13天进行爬杆实验（运动协调性）和旷场实验（自主活动），第14天进行悬尾实验（抑郁行为）和胶布移除实验（运动功能），量化归芍地黄丸对PD模型小鼠行为障碍的改善作用。
②组织取材：小鼠麻醉后经心灌注生理盐水，取脑分离中脑黑质和纹状体，部分冻存于-80℃（用于WB、qPCR），部分4%多聚甲醛固定（用于HE染色及免疫荧光）。
③形态学分析：黑质组织经HE染色观察神经元结构损伤，TH免疫荧光检测多巴胺能神经元存活数量，评估药物对MPTP诱导的神经元变性的保护效应。
④组织学检测：qPCR检测纹状体DA含量及TH mRNA表达，WB分析TNF-α、IL-1β蛋白水平，验证归芍地黄丸通过调节炎症因子和神经递质合成途径发挥神经保护作用。
⑤肝毒性评估：ADMETlab网站预测成分肝毒性风险，检测血清ALT/AST水平，结合肝脏HE染色观察组织形态学变化，综合评价药物安全性。
（4）归芍地黄丸具体调控机制通路

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                                                                                                                   图6 技术路线图3

①ELISA试剂盒：使用TNF-α及IL-1β的ELISA试剂盒检测纹状体组织匀浆液中的炎症因子水平。取各组小鼠纹状体样本，按试剂盒说明裂解组织、离心取上清，加入96孔板孵育后，通过酶标仪测定450 nm吸光度值，定量分析模型组与给药组的炎症因子差异，验证归芍地黄丸的抗神经炎症作用。
②qPCR实验：提取纹状体组织总RNA（TRIzol法），逆转录合成cDNA。以GAPDH为内参，设计TH及DA合成相关基因（如DDC、TH）的特异性引物，通过SYBR Green荧光定量PCR检测mRNA表达。采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量，评估归芍地黄丸对多巴胺能神经元功能相关基因的调控作用。
③Western blot实验：裂解纹状体组织提取总蛋白，BCA法定量。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭后，分别孵育TH、TNF-α、IL-1β及PI3K/Akt通路关键蛋白（如p-AKT、AKT）一抗（4℃过夜）。TBST洗膜后孵育HRP标记二抗，ECL显影，Image Lab软件分析条带灰度值，定量蛋白表达变化，揭示归芍地黄丸对多巴胺合成及炎症通路的调控机制。
2.拟解决的问题
①通过网络药理学分析预测出相关靶点以及信号通路，解决了PD病理机制复杂难 以着手研究的问题，为以后PD研究以及中医药治疗PD奠定了坚实的基础。
②运用网络药理学方法分析归芍地黄丸治疗PD的作用机制，极大的减少了化学成分筛选的流程，更加精细地预测有效成分的作用靶点及通路。
③通过动物实验验证了复方中药归芍地黄丸对PD和多巴胺能神经元的改善作用，为临床用药提供了理论依据。
3.预期成果
①证实归芍地黄丸主要是通过抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等多种途径保护黑质多巴胺能神经元，从而治疗帕金森病。
②通过实验考察，进一步确定归芍地黄丸治疗PD的价值所在，为以后的实验研究以及临床应用提供理论和实验依据。
③发表课题相关SCI论文1篇；完成研究报告1篇。
①2025.06～2025.12前期准备：查阅中药，归芍地黄丸以及PD的相关文献，设计具体实验流程，对归芍地黄丸有效成分进行研究，对PD疾病以及相关其他疾病进行初步研究。
②2025.12～2026.06网络药理学、分子对接及分子动力学模拟：探究归芍地黄丸治疗PD的有效成分、有效靶点和有效途径，获取PD疾病靶点，绘制网络关系图，富集分析核心靶点初步探究作用机制。分子对接和分子动力学模拟进一步预测其作用机制。
③2026.06～2026.12动物实验：分步进行行为学、形态学以及组织学实验，探究归芍地黄丸有效成分对MPTP制备的小鼠模型的治疗效果表现及相关治疗机制的探讨。
④2026.12～2027.06准备结项材料：整理数据和图片等相关材料，撰写论文。

1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
（1）药物活性成分的获取与“药物-成分-靶点”网络的构建
利用网络药理学从TCMSP数据库中筛选出类药性>0.18、口服利用度>30%的药物活性成分。结果显示，地黄含2种有效成分，当归2种，白芍13种，泽泻10种，茯苓15种，牡丹皮11种，山茱萸20种，山药16种。去除重复项后，共得到76种独特有效成分。其中，蓝色圆圈表示靶点基因，其他圆圈代表药物，倒三角表示药物共有成分，棱形代表单味中药，边表示连接。归芍地黄丸数据表明，一种草药可对应多个化合物，一种化合物可对应多个靶点，靶点也可对应多个化合物，体现了中药多化合物、多靶点的特点。最终，归芍地黄丸筛选出396个有效靶点。

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                                                                                                   图7 药物-成分-靶点网络

（2）交集基因的获取与“药物-成分-靶点-疾病”网络的构建
本研究发现归芍地黄丸与帕金森病存在230个交集靶点基因，表明其可能通过调控这些靶点基因的表达来治疗帕金森病，但具体靶点基因仍需进一步探究。通过构建药物成分-药物靶点-疾病靶点网络图并进行网络拓扑学分析，发现β-谷甾醇（MOL000358，degree=82.0）、山奈酚（MOL000422，degree=101.0）、槲皮素（MOL000098，degree=122.0）、豆甾醇（MOL000449，degree=93.0）、海风藤酮（MOL000322，degree=24.0）和四氢鸭脚木碱（MOL008457，degree=25.0）是归芍地黄丸中最重要的化合物，也是网络中的关键节点，具有显著的抗帕金森作用。
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                                                                                              图8 药物-疾病靶点交集网络图

（3）PPI网络的获取与核心靶点的筛选
为探索归芍地黄丸主要活性成分治疗帕金森病的作用机制，基于共同靶点构建了药物靶点-帕金森靶点相互作用网络，229个靶点间存在4828种联系，平均连接数为21.08，显示归芍地黄丸具有治疗帕金森病的潜力。通过Cytoscape分析，结合Closeness>0.002296771173333、Degree>42.1659388646288、Betweenness>216.087336244537的筛选条件，并利用cytoHubba插件运算，确定TP53、CASP3、TNF、IL1B、AKT1、IL6为关键治疗靶点。
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                                                                                                                       图9 PPI网络图

（4）富集分析预测归芍地黄丸治疗PD作用机制
富集分析和通路研究结果表明，归芍地黄丸可能通过增强PI3K/Akt信号通路活性和抑制TNF表达来改善帕金森病（PD）症状，为其治疗PD的潜在机制提供了新见解。通过Metascape分析归芍地黄丸与PD的共同靶点，发现主要生物过程（BP）富集包括正调控磷代谢、磷酸盐代谢、磷酸化、蛋白磷酸化、蛋白修饰、细胞对氮化合物及激素的反应等，涉及多个核心靶点（如AKT1、CASP3、IL6、IL1B、TNF、TP53），揭示了归芍地黄丸对PD的多重协同作用。KEGG分析显示209条显著富集通路，其中PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路和C型凝集素受体信号通路等抗炎通路的激活可抑制炎症因子水平，从而发挥治疗帕金森病的作用。
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                                                                                                       图10 GO和KEGG富集分析

（5）分子对接挖掘归芍地黄丸活性成分与核心蛋白结合稳定性
分子对接实验结果表明，归芍地黄丸中的六个活性小分子均能够与核心靶点蛋白发生结合，但各成分与靶点之间的结合能力存在显著差异。具体而言，海风藤酮与AKT1靶点的结合尤为紧密，显示出较高的亲和力；豆甾醇与IL6靶点的结合也较为牢固，表明其可能对IL6的调控具有重要作用；β-谷甾醇与TNF靶点的结合紧密，暗示其在抑制TNF表达方面可能发挥关键作用；槲皮素和山奈酚均与AKT1靶点结合紧密，进一步强调了AKT1在归芍地黄丸治疗机制中的重要性；而四氢鸭脚木碱与TP53靶点的结合紧密，提示其可能通过调控TP53来发挥其生物学效应。这些结果为归芍地黄丸中各活性成分在分子水平上对帕金森病相关靶点的作用机制提供了有力的证据，并为后续的药物开发和优化提供了重要的参考依据。
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                                                                                                   图11 活性小分子结构

                                                                                                   表1 活性小分子数据

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                                                                                                                图12分子对接热图
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                                                                                                  图13 分子对接可视化
即目前有关该课题网络药理学及分子对接的工作已完成，为后续实验的进行提供了依据。
（1）具备的条件
①项目指导老师长期从事心脑血管药物研究，拥有2项发明专利、1项实用新型专利，发表10余篇中文核心和SCI论文。熟练掌握PD小鼠模型构建、SH-SY5Y细胞培养等技术，为课题提供理论和技术支撑。项目参与人员经实验动物学、分子生物学等培训，能熟练操作动物模型制备、高效液相、qPCR及WB技术，且工作时间充足，为项目完成提供技术和时间保障。
②本项目将在济宁医学院日照校区医药生物创新平台上完成，该平台设备先进，具备开展上述实验的必要实验场所、实验条件和仪器设备，包括细胞培养场所、实验操作场所、小鼠培育场所、关键指标监测仪器设备、关键实验操作设备和基本实验条件。
③项目前期的预实验和准备工作十分充分，为项目的顺利开展奠定了坚实基础。我们已经完成了相关文献的全面调研，详细设计了实验方案，并订购了部分关键试剂。项目具有坚实的理论基础，技术路线清晰可行，整体可行性高。
（2）尚缺少的条件
在项目开展中，我们面临资金和技术挑战。关键试剂（如MPTP和TH抗体）价格昂贵，增加了经济压力，阻碍了研究进展，亟需材料支持以推进课题。此外，项目后期需进行大规模全原子分子动力学模拟，这需要高性能GPU并行计算集群支持，但本地算力无法满足精度和时效要求。因此，我们急需解决算力不足问题，以保障项目后期顺利实施。
（3）解决方法
为解决资金和技术难题，我们已通过导师联系山东大学分子模拟实验室，初步达成合作协议，计划在项目第3个月利用其设备开展关键测试，并预留2000元预算支付机时费。同时，已申请本校超算中心“创新项目支持计划”免费配额，用于辅助验证关键参数，且确认符合申报资格。我们希望通过申请国家级大学生科技创新训练项目解决资金瓶颈，快速启动研究，完善实验论证，明晰作用机制，寻找帕金森病的有效治疗靶点，为后续研究奠定基础。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 11000.00 9000.00
1. 业务费 2000.00 业务费 1000.00 1000.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 共聚焦显微镜、分子动力学模拟费用 1000.00 1000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 0.00 无 0.00 0.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 18000.00 实验动物购买、饲养；血清、抗体、试剂盒等实验耗材购买 10000.00 8000.00
结束

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