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电针通过调控肠道菌群-TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3轴抑制神经炎症改善糖尿病周围神经病变的作用机制

申报人：徐子堃 申报日期：2025-03-17

基本情况

2025创新项目
电针通过调控肠道菌群-TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3轴抑制神经炎症改善糖尿病周围神经病变的作用机制 学生申报
创新训练项目
医学
中医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
糖尿病周围神经病变（DPN）为内分泌科常见的难治性疾病之一，致残率高，严重危害患者健康，防止或延缓出现 DPN 已成为临床研究热点和重要科学问题。近年研究发现肠道菌群失调可通过“肠-神经轴”加剧神经炎症，TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路是介导炎症反应的关键通路。课题组前期研究表明，电针可改善 DPN 大鼠的的炎症反应水平，保护坐骨神经功能，同时还可调整肠道菌群结构，但其通过调控肠道菌群抑制神经炎症的具体机制尚未阐明。鉴于此，本课题以“肠道菌群-神经炎症”为切入点，拟采用组织形态学观察、Elisa、 Western blot、RT-qPCR等方法，构建“穴位刺激-菌群调控-信号通路-病理表型”的完整证据链，阐明电针通过重塑肠道微生态，抑制TLR4/MyD88介导的NF-κB活化及NLRP3炎症小体形成，从而阻断炎性因子级联释放，从而发挥对 DM 坐骨神经结构和功能的保护作用，减少 DPN 的发生或延缓其相应进程。研究结果不仅将为电针治疗 DPN 提供实验证据和理论支持，促进电针在 DPN 治疗上的推广和应用，同时也为防治 DPN 的发生和发展提供新的靶点和思路。
已跟随指导老师完成本项目的预实验，熟练掌握糖尿病周围神经病变大鼠的模型制造、行为学检测等实验技术。

主持厅局级课题 2 项；参与国家级课题 1 项，省部级课题 1 项， 厅局级课题 4 项，校级课题 2 项。

指导老师将从课题立项、实验开展、论文撰写等方面给予学生指导、帮助，全力支持，确保项目顺利结题。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
徐子堃 中西医结合学院 针灸推拿学（本科） 2022 动物实验
付函菲 中西医结合学院 针灸推拿学（本科） 2022 指标检测
付喜乐 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 数据分析
肖文怡 中西医结合学院 针灸推拿学（本科） 2022 指标检测
崔皓翔 中西医结合学院 针灸推拿学（本科） 2022 动物实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
颜晓 中西医结合学院 否

立项依据

1.验证电针对DPN大鼠症状改善情况、坐骨神经结构和功能的保护效果及对肠道菌群、炎症反应的影响。
2.从肠道菌群抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路介导的神经炎症反应角度验证电针防治DPN的关键机制。
围绕目标一，我们拟开展如下实验：
         1.研究电针对DPN大鼠症状改善情况、坐骨神经功能和结构保护效果及起效途径：(1)采用快速血糖仪检测大鼠血糖；(2)观察DPN大鼠电针治疗后的行为学变化以及检测坐骨神经传导速率，评价坐骨神经功能；(3)采用HE染色染色观察坐骨神经组织形态，采用LFB髓鞘染色分析坐骨神经脱髓鞘现象，采用透射电镜观察坐骨神经的超微结构。（其中(1)(2)两条以及电镜观察坐骨神经的超微结构已完成，详见研究基础）
         2.探究电针对DPN大鼠肠道菌群的影响：提取大鼠粪便基因组并进行16S rRNA基因测序,分析正常组与模型组大鼠肠道菌群组成结构的差异，以及电针干预对模型组大鼠肠道菌群的影响。（已完成，详见研究基础）
         3.探究电针对DPN大鼠炎症反应的影响：(1)采用酶联免疫吸附法检测血清、坐骨神经组织中的炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）；(2)采用Western blot、RT-qPCR检测大鼠坐骨神经中上述炎症因子蛋白及mRNA表达。（血清中IL-1β、TNF－α、IL-6的表达检测已完成，详见研究基础）
围绕目标二，我们拟开展如下实验：
        1.评价电针对TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路关键分子表达的影响：采用Western blot、RT-qPCR、ELISA技术检测大鼠坐骨神经组织中TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3的表达情况。
        2.评价肠道菌群抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路在电针抑制DPN坐骨神经炎症反应中的关键作用，揭示其具体作用机制：通过设置差异肠道益生菌群干预组、电针+TLR4激活剂组、TLR4激活剂组、对照组、模型组、电针组，然后对大鼠进行坐骨神经保护效果、肠道菌群、炎症因子、TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路关键分子表达情况等上述检测。
具体研究方法
1.实验动物及分组
        健康SD大鼠，雄性，SPF级，实验动物饲养及观察在济宁医学院动物实验中心（SPF 级）进行，整个实验操作需要遵循中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，围绕目标1动物分为正常组、模型组、电针组，围绕目标2动物分为正常组、模型组、电针组、差异肠道益生菌群干预组、电针+TLR4激活剂组、TLR4激活剂组，并根据检测指标确定各组大鼠所需具体只数。
2.模型制备
        除正常组外，其余各组均进行造模。采用STZ腹腔注射诱导DM大鼠模型，即禁食不禁水12h，按照60mg/Kg的剂量于大鼠左下腹腹腔注射1%STZ溶液。注射完72h后尾静脉取血测量随机血糖，凡随机血糖≥16.7 mmol/L则为DM模型大鼠[1]。4周后大鼠进行机械痛阈测定，重复测3次，每次间隔5min，取平均值进行记录，阈值降低视为DPN模型建立[2]。
3.干预方法
        电针组：先按照2mg/kg剂量予以0.9%的氯化钠溶液腹腔注射，再灌胃与差异肠道益生菌群干预组等体积的0.9%的氯化钠溶液。2h后再用自制鼠衣捆绑固定大鼠进行电针干预，穴位选取为“足三里”（双侧）、“三阴交”（双侧）、“脾俞”（双侧）、“肾俞”（双侧），穴位定位参考《大鼠穴位图谱的研制》[3]。具体干预方法，采用0.30 mm×15 mm不锈钢毫针，“足三里”穴直刺3-5mm，“三阴交”穴直刺2mm，“脾俞”、“肾俞”穴斜刺3-5mm。选择HANS LH202H型电针治疗仪，连续波，频率2 Hz，电流强度1mA，刺激时间10min/次，同侧“足三里”、“三阴交”连接同一输出的两个电极。
        差异肠道益生菌群干预组：先按照2mg/kg剂量予以0.9%的氯化钠溶液腹腔注射，再进行差异肠道益生菌群灌胃，2h后再用自制鼠衣捆绑固定10min。
        电针+TLR4激活剂组：先按照2mg/kg剂量予以LPS腹腔注射，再灌胃与差异肠道益生菌群干预组等体积的0.9%的氯化钠溶液，2 h后进行电针干预，操作方法同电针组。
        TLR4激活剂组：先按照2mg/kg剂量予以LPS腹腔注射，再灌胃与差异肠道益生菌群干预组等体积的0.9%的氯化钠溶液，2h后再用自制鼠衣捆绑固定10min。
        正常组：先按照2mg/kg剂量予以0.9%的氯化钠溶液腹腔注射，灌胃与差异肠道益生菌群干预组等体积的0.9%的氯化钠溶液，2h后再用自制鼠衣捆绑固定10min。
        模型组：先按照2mg/kg剂量予以0.9%的氯化钠溶液腹腔注射，灌胃与差异肠道益生菌群干预组等体积的0.9%的氯化钠溶液，2h后再用自制鼠衣捆绑固定10min。
        上述干预于DM大鼠造模成功后开始，均隔日1次，每周3次，共计干预8周。
4.血糖及行为学检测
        (1)血糖检测：采用快速血糖仪检测大鼠尾尖全血，在电针干预前和开始后4周、8周分别测量。
        (2)热痛阈测定[4]：将大鼠放置于55 ℃恒温的RB-200智能热板仪上，记录自大鼠足底接触恒温的热板到因受热刺激而产生明显的抬足或舔后足动作所需的时间（单位：s），当时间超过30s时要及时终止，避免造成组织损伤。每只大鼠进行3次重复测量，每次间隔15min，最终结果取平均值。干预前，干预4周、8周时每组均各测定一次。
        (3)机械痛阈测定[5]：将大鼠放于透明笼子内，并置于升高的铁网架上，等待15min使大鼠适应环境，再用Von Frey电子测痛仪轻触大鼠后肢足底中部，刺激力度由小到大，当大鼠出现缩足反射时，记录下此时电子测痛仪上所显示数字（单位：ｇ），每只大鼠进行3次重复测量，每次间隔大于30s，最终结果取平均值。干预前，干预4周、8周时每组均各测定一次。
5.坐骨神经取材及传导速率检测
        (1)坐骨神经取材：治疗结束后大鼠腹腔注射5%戊巴比妥钠麻醉，俯卧位固定，术野脱毛，于坐骨神经走行切开皮肤，分离股四头肌肌肉组织至坐骨切迹，显露坐骨神经，用玻璃分针仔细分离双侧坐骨神经，全程注意用液体石蜡油保护坐骨神经，分离动作需轻、细，以免损伤神经。上至坐骨切迹，下至足踝部，充分暴露坐骨神经，分离后立即测定。
        (2)坐骨神经传导速率检测：将电极间距为2mm的7联排钩状电极连接到 BL-420E+生物机能实验系统，以钩状电极轻轻勾住坐骨神经，从近端至远端依次为一对刺激电极(连接刺激输出通道) 、第1对参考电极 +记录电极 (连接1通道) 、第2对参考电极+记录电极(连接2通道)。实验参数设定: 模式细电压、方式单刺激、延时5.0、波宽0．05ms、强度1.0V、波间隔99。给予电刺激后，记录从坐骨神经近端到远端产生动作电位的潜伏期(Δt) ，两个记录电极间的距离(Δs) 固定，则 NCV = 记录电极之间的距离/动作电位潜伏期之差，重复电刺激3次取平均值[6] 。
6.坐骨神经组织形态学观察
        (1)HE染色：取出固定于多聚甲醛固定液中的坐骨神经组织,梯度酒精上行脱水，再于二甲苯中透明，先在铁模具中加入一些液态石蜡，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态，制作成石蜡组织块。将包埋好的组织置于石蜡切片机上切片，约4-10μm，覆盖于载玻片上。将包含有完整组织的切片置于40℃温水的摊片机中。再将捞出组织的载玻片置于架子上，于 60℃烤片3h。夹持载玻片在二甲苯中脱蜡，每次15min，共3次，然后依次在 100%，95%，85%和75%乙醇，每级放置5-10min，最后转移至蒸馏水中。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色5min，流水冲洗，放置于 1%盐酸乙醇中分化10s，切片由蓝色变红色，流水冲洗返蓝，吸干水分，最后于伊红水溶液染色3-5 min。染色后的切片再经无水乙醇脱水、二甲苯透明5min，吹干，盖上盖玻片中性树胶封固，普通光镜400倍视野下观察坐骨神经组织形态学改变并拍摄照片。
        (2)透射电镜下观察大鼠坐骨神经超微结构：以2.5%戊二醛固定，磷酸缓冲液漂洗3 次，再以1%四氧化锇固定样本1小时，经梯度乙醇脱水，丙酮处理，置换，包埋，聚合后，将样品制成600nm厚切片，用甲苯胺蓝染色，在光学显微镜下观察并选取相应部位制成70nm厚的超薄切片，将超薄切片置于200目的铜网上，采用饱和醋酸双氧铀和枸橼酸铅二重电子染色法染色，染色时间分别为20min和15min，然后透射电镜观察并拍照。
7.炎症因子相关指标检测
        (1)采用酶联免疫吸附法检测血清、坐骨神经组织中的炎症因子（caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF－α、IL-6），具体操作方法以及结果计算均严格按照试剂盒说明书进行。
        (2)Western blot检测炎症因子的蛋白表达情况：用IP裂解液，PMSF，蛋白酶抑制剂混合物（Cocktail）提取坐骨神经组织总蛋白，用 BCA 法测其总蛋白浓度，加入5×SDS缓冲液，混匀煮样，-80℃保存备用。采用Western blot 检测法，以GAPDH为内参，各组上样量约50ug，经电泳、转膜、 封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、ECL 化学发光显影，取得caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF－α、IL-6免疫印迹条带。用Image Lab软件分析处理条带灰度值，以目的蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值即其相对光密度值。
        (3)RT-qPCR检测炎症因子的mRNA表达情况：用Trizol试剂提取坐骨神经组织总RNA。以mRNA为模版进行逆转录生成cDNA，-20℃保存备用。应用荧光定量试剂盒进行caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF－α、IL-6 mRNA 检测，采用引物设计软件 Primr premier 与 Omiga 对caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF－α、IL-6扩增引物进行设计。以GAPDH为参照，结果采用 2-ΔΔCT计算各组目的mRNA表达变化。
8.TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路关键分子表达检测
        (1)酶联免疫吸附法检测信号轴关键分子蛋白表达情况：采用ELISA试剂盒检测TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3的蛋白表达，具体操作按照试剂盒进行。
        (2)Western blot检测信号轴关键分子蛋白表达情况：采用Western blot检测大鼠坐骨神经组织中TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3的蛋白表达，操作同上。
        (3)RT-qPCR检测信号轴关键分子mRNA表达情况：采用RT-qPCR检测大鼠坐骨神经组织TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3的mRNA表达，操作同上。
9.统计学分析
        本研究所有数据采用 SPSS 22. 0 统计分析软件进行统计分析，实验数据以 ±s表示，在检验数据正态分布及方差齐性的条件下，多组间数据比较采用方差分析，各组组间差异的比较用 LSD-t 检验，数据相关分析采用 Spearman 相关 ，以 P<0.05为差异有统计学意义。
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1.寻求安全有效防治糖尿病周围神经病变（DPN）的方法并阐明其机制，具有重要的临床价值和社会意义
        糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种严重的内分泌代谢性疾病，其发病率呈现显著增加趋势，且发病年龄逐渐降低[1]。糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是DM最常见的慢性并发症之一，临床数据显示约50%～90%的DM患者会出现DPN，该病起病隐匿，早期症状易被忽视，是一组以感觉神经和自主神经症状为主要临床表现的周围神经病，随着病情进展可引起糖尿病足溃疡、骨折、坏疽和截肢等严重后果[2-4]。课题组前期预实验结果显示，经STZ诱导的DM大鼠在2-4周会出现热痛阈、机械痛阈阈值降低，产生明显的感觉异常，即出现早期DPN症状（具体详见研究基础），与文献报道结果一致[5]。因此通过在DM早期干预，防止或延缓出现DPN已成为临床研究热点和重要科学问题。
        中医认为DM多由先天禀赋不足、后天饮食不节所致，若消渴日久可致脾肾亏虚、燥热偏盛、阴津损伤，从而使得经络瘀阻、气血津液输布异常，而致瘀血、痰浊、脂膏内生或皮肉筋骨等失去濡养，出现DPN症状。电针是传统针灸与现代电刺激的结合，持续的电刺激能够增加单纯针刺的疗效，可促进神经传导、改善局部微环境，又可抑制神经异位放电、促进病变神经修复再生、提高背根神经节和雪旺细胞髓鞘化率等，即而兴奋神经纤维，从而缓解局部症状，故电针疗法在DPN的治疗上有着其他疗法无法替代的优势[6-8]。本研究选取背俞穴之“脾俞”“肾俞”补益脾肾、滋阴润燥，滋先天培后天，同时选取下肢部腧穴“足三里”“三阴交”，刺之既能疏通经络，又可发挥补中气，健肝脾肾的作用。四穴同用共奏补脾肾、疏经络、调营卫、消膏脂、祛痰浊之功，标本兼顾。现已有Meta分析表明，电针治疗DPN的有效率优于使用西药等常规疗法的治疗[9]。课题组前期临床研究也已证实本研究治疗方案可降低DPN患者的多伦多临床评分系统（TCSS评分）、密歇根糖尿病神经病变评分（MDNS评分）（具体详见研究基础），具有良好的治疗效果。但其作用机制未明，限制了在国内外的临床应用和推广。
2.TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路介导的神经炎症反应为DPN重要的发病机制
        长期高糖脂环境下，葡萄糖和脂蛋白与神经元及微血管内皮细胞上的各种转运受体相互结合，启动炎症信号机制，分泌多种细胞因子形成炎症浸润，内皮细胞损伤导致神经纤维营养供给不足。无髓鞘神经纤维常首先发生轴突变性，继而出现有髓鞘神经纤维脱髓鞘，大量炎症介质浸润使得神经纤维再生受到抑制，神经元受损或死亡后可使疼痛感受器密度降低造成感觉丧失，敏化局部伤害性感受器造成痛觉过敏，并激活脊髓中枢的胶质细胞，引起疼痛、麻木、痛觉过敏以及肌无力等症状，影响神经功能，引发DPN。炎症介质的长期保护性应激和因此造成的恶性循环激活多条炎症信号通路相互作用，使病理状态持续存在[10-11]。
        TLR4介导信号通路能够通过依赖与非依赖途径诱导NF-κB蛋白活化，NF-κB激活后促进下游释放大量肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子，进一步加重机体炎症反应，对坐骨神经造成损伤，加速DPN的发生与发展［12-13］。研究发现与健康组相比，DPN 患者在单核细胞中TLR4的表达明显升高，表明TLR4关键基因对DPN的发病机制有着巨大的意义[14]。NLRP3炎症小体作为目前炎症反应研究的最深入的一种炎症小体，其介导的炎症反应与DPN的发病相关，抑制 NLRP3炎症小体可显著改善DPN的临床症状［15-16］。经典的 NLRP3炎症小体激活途径包括启动和激活两个阶段, 启动阶段主要由TLR4识别胞外病原体相关分子模式(PAMPs) 或损伤相关分子模式 (DAMPs), 通过下游Myd88激活IκB激酶并使IκB发生磷酸化和降解, NF-κB活化并易位进入细胞核,最终诱导NLRP3和IL-1β前体的表达；激活阶段是细胞识别DAMPs或 PAMPs刺激信号后，NLRP3募集ASC与其形成PYD-PYD的共同体，同时ASC通过CARD结构域与 pro-caspase-1 形成 CARD-CARD 结构，从而激活caspase-1裂解pro-IL-1β和pro-IL-18等前体细胞因子，产生成熟的促炎因子IL-1β和IL-18[17-18]。故TLR4/Myd88/NF-κB通路对于NLRP3炎症小体介导炎症反应具有重要作用。
        因此TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路介导的神经炎症反应在DPN的发生发展过程中具有重要作用。
3.肠道菌群失衡对DPN的发生发展有重要影响
        近年来，关于糖尿病患者肠道稳态破坏与DPN进展的关系得到证实，通过调节肠道菌群、恢复肠道稳态从而改善糖脂代谢紊乱、调节免疫炎症成为阻止DPN进展的重要着手点[19-20]。肠道菌群失衡可导致大量淀粉样蛋白、脂多糖(LPS)和炎症相关分子的分泌，破坏肠黏膜屏障，促进小胶质细胞的激活，引发中枢神经系统的神经炎症，可能导致神经退行性变[21]。临床研究发现，DPN患者存在明显的肠道菌群紊乱，可能与胰岛素抵抗有关，这些变化在DPN的发展中同样起重要作用[22]。动物研究发现，筋脉通改变了DPN大鼠肠道微生物群落的整体组成，回调了9种在正常组显著富集的差异性肠道微生物，并可能通过富集p-Actinobacteria、p-Proteobacteria和c-Actinobacteria参与发挥坐骨神经髓鞘保护作用[23]。
        因此调整肠道菌群失衡状态可成为阻止糖脂毒性、神经炎症损伤的第一道屏障，并达到防治DPN的目的。
4.以肠道菌群调控 TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路为切入点，在前期研究基础上进一步阐释电针防治DPN的效应机制
        DPN的病理改变分为无髓神经纤维的轴突变性和有髓神经纤维的节段性或弥漫性再生和脱髓鞘。暴露于神经组织的抗原成分引起的炎症反应是脱髓鞘的主要原因[24]。研究表明，在DPN的发生发展过程中炎症反应会促进氧化应激，而氧化应激也会加剧炎症反应[25]。另外在DPN血脂异常情况下，长链脂肪酸可穿透血神经屏障，也引发神经源性炎症[26]。课题组前期预实验发现，电针可改善DPN大鼠的炎症反应水平，保护坐骨神经功能（具体详见研究基础），但其上下游分子机制还需进一步探索。
        Toll样受体４（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子Kappan B（NF－κB）/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（NLRP3）信号通路被证实为细胞内参与炎症反应最重要的信号通路。预实验研究发现，电针可明显改善DPN模型大鼠的粪便性状、含水量以及肠道菌群，而研究表明肠道菌群失调又可通过作用于宿主的各种信号分子影响炎症因子的释放，推进DPN的进程。
        综上所述，根据课题组前期临床及实验结果并结合相关文献研究，课题组提出科学假说（见图 1）：电针通过调控肠道菌群抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路，进而抑制炎性因子的释放，缓解坐骨神经炎症反应，发挥对DM坐骨神经结构和功能的保护作用，减少DPN的发生或延缓其相应进程。本项目拟运用分子生物学技术与方法，从整体-组织-分子三水平逐步进行验证，通过分析各指标变化和相互间的关系及影响以揭示上述科学假说。
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图1：科学假说示意图
参考文献
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1.研究思路创新
        本研究在针灸治未病理论指导下，仅仅围绕“DPN坐骨神经结构和功能”的病理特点从不同层次上阐明其作用机制。即通过整体水平、组织水平、分子水平层面的研究，探讨电针改善DPN坐骨神经结构和功能的作用机制，为防治DPN的发生发展提供新的思路。
2.研究内容创新
        课题组前期临床研究证实本研究治疗方案对DPN患者的神经功能改善确有疗效，动物预实验结果又显示电针电针可能通过协同调控益生菌定植与致病菌抑制重塑肠道菌群稳态，改善DPN大鼠的炎症反应水平，保护坐骨神经功能。基于以上研究基础结合文献研究，创新性提出电针通过调控肠道菌群-TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3轴抑制神经炎症，发挥对坐骨神经结构和功能的保护作用，从而防治DPN，并运用现代生物学技术从整体-组织-分子三水平逐步验证，深入探究电针防治DPN的机制，解释了其科学内涵。
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1.拟解决的问题
(1)验证电针对DPN症状改善情况、坐骨神经结构和功能的保护作用及对肠道菌群、炎症反应的影响
        综合利用行为学、组织形态学、分子生物学进行电针对 DPN坐骨神经结构和功能的保护作用及对肠道菌群、炎症反应影响的多角度验证，为机制探索提供证据。
(2)探讨肠道菌群在电针法效应机制中发挥的作用
        通过对比差异肠道益生菌群灌胃与电针法对DPN大鼠肠道菌群的影响，阐释肠道菌群在电针法发挥效应机制中的作用。
(3)探讨TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路在电针法效应机制中发挥的作用
        通过腹腔注射TLR4激活剂LPS激活TLR4的表达，正向分析与反向验证相结合，分析各指标变化和相互间的关系及影响，探讨TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路在电针法效应机制中发挥的作用。
2.预期研究成果
(1)理论性研究成果
        本项目在前期研究基础上，以神经炎症反应为切入点，进一步明确电针通过调节肠道菌群抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路对DPN坐骨神经炎症反应的调控作用，初步揭示了电针防治DPN的效应机制，为其临床应用与推广提供科学依据，具有重要的理论价值和临床意义。
(2)经济、社会效益
        ①DPN不仅影响患者的生活质量，而且给家庭和社会带来巨大的经济负担，运用电针在DM早期进行干预治疗，可预防DPN的发生以及明显延缓DPN进程，提高患者的生活质量，可产生一定的社会效益，此外还减轻了患者的长期经济负担，具有一定的经济价值。
        ②可促进医疗器械制造业、益生菌、益生元等相关产业的发展，形成更加完整的医疗健康产业链，为山东省经济增长提供新的动力。
        ③随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，健康产业正成为新的经济增长点。本项目的研究成果将为我省健康产业的发展提供新的思路和方法，推动相关产业的发展和创新。
(3)学术交流、人才培养、成果转化
        ①发表学术论文1～2篇；
        ②参加国内外学术交流 1～2 次；
        ③培养本科生4～6名。

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1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
(1)临床研究结果
        前期临床研究发现，电针可增强DPN患者的临床疗效，后期又通过随机对照试验进一步观察了电针对DPN患者的疗效，将60例DPN患者随机分为治疗组（电针+甲钴胺注射）和对照组（单纯甲钴胺注射），分别给予相应治疗。4周后通过TCSS评分和MDNS评分评价疗效，治疗后，两组TCSS评分和MDNS评分均降低，且治疗组较对照组降低程度更明显，差异有统计学意义（Ｐ＜0.01）。 研究证实本电针治疗方案可改善DPN患者的临床症状。见表1。
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(2)预实验结果
①各组大鼠体质量、随机血糖、行为学相关指标、坐骨神经传导速率比较
        干预4周、干预8周后，模型组较正常组大鼠体质量、机械痛阈（MWT)、热痛阈(TWL)、坐骨神经感觉神经传导速度（SCV)及运动神经传导速度（MCV）显著降低（P＜0.01），血糖显著升高（P＜0.01）；电针组较模型组体质量、MWT、TWL、SCV、MCv均显著升高（P＜0.01），血糖显著降低（P＜0.01）。（见图1）
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②各组大鼠坐骨神经超微结构比较
        正常组大鼠的坐骨神经髓鞘呈现规整的层状分布，其结构均匀、致密且排列有序，轴突保持完整形态，轮廓清晰可辨。模型组大鼠坐骨神经髓鞘肿胀变形形成不规则结构，与轴突之间出现广泛的分离现象，髓鞘厚度呈现明显的不均匀性，轴突发生变性改变；电针组大鼠坐骨神经髓鞘结构相对均匀，形态也趋于规则，同时髓鞘与轴突之间的广泛分离情况得到了改善。见图 2。
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③肠道菌群分析
a.测序质量评估及肠道菌群多样性分析
        稀释曲线可以反应测序质量（见图3A）,随着测序数据量的增大，各组样本趋于平缓，表明测序数据量渐进合理，提示样本量足够，并间接反应样本中物种的丰富程度。Alpha多样性代表样本物种的均匀度和丰富度，主要包括 Chao1 指数和 Shannon 指数（见图3B/C）。与正常组比较，模型组Chao1 指数显著降低(P＜0.01）；与模型组比较，电针组Chao1 指数显著升高(P＜0.01）。基于Weight Unifrac 距离的Beta多样性显示（见图 3D）模型组和电针组样本距离较大，说明菌群组成有明显差异；电针组与正常组的距离小于模型组与正常组的距离，电针组的样品逐渐趋向正常组；组内聚合度正常组最高，电针组次之，模型组最低。结果表明，模型组大鼠肠道菌群丰度明显降低，电针对肠道菌群丰度有升高作用，可调节肠道菌群结构从而减轻DPN引起的菌群变化。
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b.大鼠肠道菌群结构分析
        根据实验物种注释结果，共检测到198个菌门，501个属，22765个菌种。统计3组大鼠菌群样本在门水平丰度上排名前10的物种并绘制丰度柱状图（见图4A），各组优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidota），二者比值（F/B）是反应肠道菌群稳态的重要指标，模型组大鼠F/B值较正常组下降，电针组大鼠F/B值较模型组升高（见图4B）。结果表明电针可一定程度纠正DPN大鼠的肠道菌群紊乱，维持稳态。
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c.组间差异属种筛选
        通过 LEfSe 软件分析组间丰度差异显著的物种，将各组别 LDA 得分＞3.0且P＜0.05的菌群视为差异菌群，绘制 LDA 值分布柱状图及进化分支图（见图5）。正常组的优势属种为宿主关联乳杆菌属（Ligilactobacillus）、真杆菌属（Eubacterium）、鼠宿主关联乳杆菌（Ligilactobacillus_murinus）；模型组的优势属种为普雷沃氏菌属（Prevotella），厌氧生活螺菌属（Anaerobiospirillum），塞加塔氏菌属（Segatella），人普雷沃氏菌（Prevotella_hominis），粪便塞加塔氏菌（Segatella_copri）；电针组的优势属种为宿主关联乳杆菌属、假解黄酮菌属（Pseudoflavonifractor），鼠宿主关联乳杆菌。与正常组相比，模型组普雷沃氏菌属、塞加塔氏菌属、人普雷沃氏菌、粪便塞加塔氏菌丰度增加（P＜0.05），宿主关联乳杆菌属、假解黄酮菌属、真杆菌属、鼠宿主关联乳杆菌丰度降低（P＜0.05），经电针治疗后以上肠道菌群丰度得到回调（P＜0.05）。结果表明电针可显著重塑DPN大鼠肠道菌群结构，表现为宿主关联乳杆菌属、假解黄酮菌属及鼠宿主关联乳杆菌丰度的上调，而普雷沃氏菌属、塞加塔氏菌属等丰度被特异性抑制，上述菌群可能为DPN防治的关键微生物靶标。（见图6）

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图5：LAD 值分布柱状图及进化分支图
注：图 A，C，E 为线性判别分析 (LDA) 值分布柱状图，展示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小，在文章中，当 LDA＞3.0，认为组间存在显著性差异。图 B，D，F为进化分支图，无显著差异的物种统一着色为白色，差异物种跟随组进行着色，黄色节点表示在正常组中起到重要作用的微生物类群，绿色节点表示在模型组别中起到重要作用的微生物类群，红色节点表示在电针组中起到重要作用的微生物类群。

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④各组大鼠脂质代谢指标比较
        与正常组比较，模型组大鼠的血清TC、TG、NEFA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠的血清TC、TG、NEFA含量显著降低（P＜0.01）。见表2。
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⑤各组大鼠氧化应激指标比较
        与正常组比较，模型组大鼠坐骨神经SOD含量显著降低（P＜0.01）、MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠坐骨神经SOD含量显著升高（P＜0.01）、MDA含量显著降低（P＜0.01）。见表3。
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⑥各组大鼠血清炎症因子水平比较
        与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠血清TNF-ɑ、IL-1β、IL-6含量显著降低（P＜0.01）。见表4。
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        依托单位实验室的软件、硬件设备具备完善的科研条件，所需试剂、抗体和药物均可购买。科研平台拥有分选式流式细胞仪、分析式流式细胞仪、活细胞工作站、普通和梯度PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、倒置显微镜、免疫荧光倒置显微镜和成像系统、超净工作台、病理图像成像和分析系统等常规设备。实验动物中心拥有SPF级动物房（SYXK（鲁）20180002），为科研所需实验动物的饲养、繁殖提供了保障。平台和仪器设备能够为病理学、细胞和分子生物学等基础研究和应用提供有力保障。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 5500.00 14500.00
1. 业务费 6000.00 无 500.00 5500.00
（1）计算、分析、测试费 3000.00 指标检测 500.00 2500.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 发表论文 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 14000.00 购买实验动物及耗材 5000.00 9000.00
结束

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