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舒肝解郁胶囊对四氯化碳所致急性肝损伤的生物信息学及实验验证

申报人：侯捷 申报日期：2025-03-17

基本情况

2025创新项目
舒肝解郁胶囊对四氯化碳所致急性肝损伤的生物信息学及实验验证 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目研究舒肝解郁胶囊对CCl4诱导的急性肝损伤（ALI）的保护作用及分子机制。急性肝损伤是高死亡率的全球性健康问题，现有治疗药物副作用显著。舒肝解郁胶囊是中药复方，传统用于抗抑郁，但其在肝损伤中的疗效尚不明确。本研究结合生物信息学和实验验证，首先通过动物实验评估其对肝功能指标、组织病理学变化及细胞凋亡的影响，然后运用网络药理学、分子对接和分子动力学模拟技术挖掘关键活性成分与靶点，揭示其通过调控PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡的机制。最后项目还将通过细胞和动物实验进一步验证该机制的科学性与可靠性。本项目有望拓展舒肝解郁胶囊的临床应用，为中药复方治疗肝损伤提供理论依据和研究思路，具有重要科学意义和临床应用价值。
  项目负责人侯捷：2023级药学专业学生，学习刻苦、认真，成绩优异。曾参与2024年校级大学生创新训练项目，期间已熟练掌握科研全流程的能力。可熟练运用网络药理学靶点挖掘、GEO数据分析、机器学习（SVM/随机森林）模型构建及分子对接验证技术；协同参与动物模型的制备、ELISA/免疫组化检测；持续拓展单细胞转录组分析等前沿技术。具备从数据挖掘、靶标识别到机制验证的完整研究经验。现有技能体系与攻关经验可为项目提供可靠的技术支撑与高效的执行保障。
  指导教师：张静，在中医药科研领域成果丰硕，主持和参与了中医药资源管理局、日照市科技局以及济宁医学院校级大学生创新项目等10余项课题。她凭借扎实的专业基础和敏锐的科研洞察力，在Tissue & Cell、PLOS ONE、Front Pharmacol、Eur J Pharm Sci及中国病理生理杂志等国内外优秀期刊，等发表多篇学术论文，展现了其在中医药研究领域的深厚造诣。多次指导大学生参加全国“药苑论坛”，带领团队获得创新成果特等奖、二等奖和三等奖各1次，充分体现了她在培养学生创新能力方面的卓越才能。此外，还指导学生参加山东省第十四届“挑战杯”竞赛并荣获银奖，为学生搭建了展示科研成果的平台。
  指导教师对本项目高度重视，并给予了全方位的支持。在项目筹备阶段，指导教师凭借其丰富的科研经验和专业知识，为项目选题、研究方案设计、技术路线规划等方面提供了关键指导，帮助项目组明确了研究方向和重点。在项目实施过程中，定期组织项目组成员开展学术讨论，及时解决项目中遇到的难题。此外，指导教师还将利用其现有的科研平台和资源，为项目提供实验场地、仪器设备以及相关试剂耗材等支持，确保项目的顺利开展。同时，指导教师也将积极协助项目组成员进行科研成果的总结与发表，推动项目成果的转化与应用。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
侯捷 药学院 药学（本科） 2023 网络药理学分析及分子对接
孟佳佳 药学院 药学（本科） 2023 ALI模型小鼠模型的制备
张晓玉 药学院 药物制剂（本科） 2023 细胞实验相关指标的检测
王淑涵 药学院 药物制剂（本科） 2022 统筹整个实验项目及文章撰写
董相仪 医学信息工程学院 生物医学工程（本科） 2023 动物实验相关指标的检测

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张静 药学院 否

立项依据

本研究旨在基于多技术融合策略，系统探究舒肝解郁胶囊（SJYC）治疗四氯化碳（CCl₄）诱导急性肝损伤的作用机制：
  ①明确药效学基础：通过构建CCl₄诱导的急性肝损伤动物模型，综合评价SJYC对肝功能生化指标（如ALT, AST）及肝组织病理学损伤的改善作用。
  ②预测核心作用靶点与通路：运用网络药理学方法，筛选SJYC治疗急性肝损伤的潜在活性成分、核心作用靶点及关键信号通路（如PI3K/AKT通路），并预测“成分-靶点-通路”相互作用网络。
  ③验证关键互作模式：采用分子对接与分子动力学模拟技术，从结构生物学层面精细解析SJYC关键活性成分与核心靶点（特别是凋亡及PI3K/AKT通路相关靶点）间的相互作用模式与结合稳定性。
  ④实验验证核心机制：整合动物模型及体外细胞模型（如建立CCl₄诱导的肝细胞损伤模型），多层次验证SJYC是否通过调控PI3K/AKT信号通路抑制肝细胞凋亡，从而发挥肝脏保护作用。
1.通过动物实验验证舒肝解郁胶囊对肝损伤的改善效果
（1）实验动物
  40只健康雄性小鼠，体重22±2 g。所有涉及动物的实验操作均严格遵守实验动物福利伦理原则实验过程中将严格遵循“3R”（替代Replacement、减少Reduction、优化Refinement）原则，最大限度地减少动物使用数量和痛苦，确保人道对待实验动物。
（2）分组设计
  ①对照组（n=8）：灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na，10 ml/kg/d），连续9天；末次给药2 h后腹腔注射花生油（10 ml/kg）。
  ②模型组（n=8）：灌胃0.5% CMC-Na（10 ml/kg/d），连续9天；末次给药2 h后腹腔注射0.2% CCl₄（10 ml/kg，溶于花生油）。
  ③低剂量组（n=8）：灌胃舒肝解郁胶囊（60 mg/kg/d），其余同模型组。
  ④中剂量组（n=8）：灌胃舒肝解郁胶囊（120 mg/kg/d），其余同模型组。
  ⑤高剂量组（n=8）：灌胃舒肝解郁胶囊（240 mg/kg/d），其余同模型组。
（3）检测指标
  ①一般体征观察与器官指数
  体重变化：每日记录小鼠体重，观察药物对食欲和代谢的影响。
  肝重与肝系数：处死后称量肝重，计算肝系数（肝重/体重×100%），反映肝脏肿大程度。
  ②血清生化指标：ALT/AST检测：取血清样本，采用南京建成生物工程研究所ELISA试剂盒，检测丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）活性，评估肝细胞损伤程度。
  ③组织病理学分析
  HE染色：肝组织经多聚甲醛固定、石蜡包埋后切片，苏木精-伊红染色观察肝细胞形态、炎症浸润及坏死情况。
  TUNEL染色：检测肝细胞凋亡，通过免疫荧光显微镜观察凋亡细胞数量，评估药物对细胞死亡的抑制作用。
  总结分析，舒肝解郁胶囊对CCl₄诱导的急性肝损伤具有显著保护效应：降低肝脏肿大（肝系数升高）、抑制肝酶释放（血清ALT/AST升高）、减轻肝组织病理损伤，并最终抑制肝细胞凋亡。
2.运用网络药理学、分子对接和分子动力学模拟挖掘舒肝解郁胶囊对ALI的具体作用机制
（1）活性成分筛选与靶点预测
  ①数据来源：使用中药数据库与分析平台（TCMSP）和中医百科全书（ETCM）筛选贯叶金丝桃和刺五加成分，TCMSP 筛选条件为OB（口服生物利用度）≥30%、DL（类药性）≥0.18。
  ②SwissADME验证：进一步筛选肠道吸收高且类药性≥3个“YES”的成分，挑选出的成分通过PubChem得到Isomeric SMILES，通过 SwissTargetPrediction 网站得到概率＞0的靶点。
（2）疾病靶点与交集分析
  ①疾病数据库：DisGeNET、GeneCards、OMIM中检索“急性肝损伤”，获得相关靶点。
  ②交集靶点：通过Venny工具筛选药物与疾病共同靶点，获得交集靶点。
（3）网络构建与分析
  ①PPI网络：使用STRING构建蛋白互作网络，Cytoscape可视化，使用CentiScaPe插件，结合Betweenness、Closeness和Degree筛选出前10的核心靶点。
  ②成分-靶点-疾病网络：显示舒肝解郁胶囊多成分与关键靶点高度关联。
（4）通路富集分析
  通过GO富集分析，可以大致了解细胞中基因富集的生物学功能、途径和位置。KEGG是一个用于基因功能系统分析的数据库，其中包括最新的基因功能注释。结合GO和KEGG富集分析，可以从宏观角度获取基因的功能信息，挖掘出药物和疾病之间的信号通路。
（5）分子对接
  分子对接的主要目的是验证舒肝解郁胶囊中的活性成分是否通过PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡，从而对急性肝损伤发挥保护作用。通过模拟舒肝解郁胶囊活性成分与PI3K/AKT信号通路靶点的结合，揭示了其可能的保肝机制。这一研究为中药复方的药理机制研究提供了新的思路，并为开发新型保肝药物提供了理论依据。
（6）分子动力学模拟
  在分子对接的基础上，开展分子动力学模拟研究，通过模拟舒肝解郁胶囊活性成分与PI3K/AKT信号通路靶点结合后的动态过程，观察其结构稳定性与相互作用变化，分析关键参数以评估结合亲和力和作用机制，为深入理解其保肝作用的分子基础提供动态结构信息。
总结分析，结合网络药理学、分子对接和分子动力学模拟技术，揭示了舒肝解郁胶囊多成分（如山奈酚、槲皮素）通过多靶点调控PI3K/AKT通路，抑制肝细胞凋亡。这一发现与前期动物实验结果高度一致，进一步证实了舒肝解郁胶囊在肝损伤保护中的潜在价值。
3.细胞实验与动物实验结合验证舒肝解郁胶囊调控PI3K/AKT信号通路的具体机制
（1）在细胞水平验证舒肝解郁胶囊活性成分对PI3K/AKT通路相关基因的调控作用
  ①细胞类型：选择小鼠肝细胞系（AML12细胞）。
  ②细胞分组
  对照组：正常培养未作处理。
  模型组：通过CCl₄（2 mM，24 h）处理诱导肝细胞损伤。
  阳性对照组：CCl₄处理基础上加入已知肝保护剂（水飞蓟素，50 μM）。
  有效剂量组：CCl4处理前或同时加入舒肝解郁胶囊提取物进行干预（120μg/mL）。
  ③检测指标
  PI3K/AKT信号通路相关基因：检测PI3K的mRNA表达水平，评估信号通路的激活状态；检测AKT的mRNA表达水平，评估信号通路的激活状态；检测GSK-3βmRNA的表达水平，作为AKT下游靶基因，评估信号通路的下游效应。
  细胞凋亡相关蛋白：检测Bcl-2表达水平，评估细胞凋亡的抑制程度；Bax与Bcl-2相对，检测其表达水平，评估细胞凋亡的促进程度；Cleaved Caspase-3作为凋亡执行蛋白，检测其表达水平，评估可以细胞凋亡的最终执行情况；β-actin作为内参蛋白，用于校正蛋白上样量。
（2）动物实验验证舒肝解郁胶囊通过调控PI3K/AKT信号通路抑制肝细胞凋亡的分子机制
  ①实验动物
  32只健康雄性小鼠，体重22±2 g。所有涉及动物的实验操作均严格遵守实验动物福利伦理原则实验过程中将严格遵循“3R”（替代Replacement、减少Reduction、优化Refinement）原则，最大限度地减少动物使用数量和痛苦，确保人道对待实验动物。
  ②分组设计
  对照组（n=8）：灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na，10 ml/kg/d），连续9天；末次给药2 h后腹腔注射花生油（10 ml/kg）。
  模型组（n=8）：灌胃0.5% CMC-Na（10 ml/kg/d），连续9天；末次给药2 h后腹腔注射0.2% CCl₄（10 ml/kg，溶于花生油）。
  阳性对照组（n=8）：CCl₄造模后给予水飞蓟素（100 mg/kg）。
  有效剂量组（n=8）：灌胃舒肝解郁胶囊（120mg/kg/d），其余同模型组。
  ③检测指标
  PI3K/AKT信号通路相关蛋白：检测PI3K表达水平，评估信号通路的激活状态；检测AKT总蛋白和磷酸化蛋白（p-AKT）水平，磷酸化状态是其活性的重要标志；检测GSK-3β总蛋白和磷酸化蛋白（p-GSK-3β）水平，作为AKT下游靶点，其磷酸化状态反映AKT的活性。
  凋亡通路相关基因：Bcl-2作为抗凋亡基因，检测其mRNA表达水平，评估细胞凋亡的抑制程度；Bax作为促凋亡基因，与Bcl-2相对，检测其mRNA表达水平，评估细胞凋亡的促进程度；Caspase-3作为凋亡执行基因，检测其mRNA表达水平，评估细胞凋亡的最终执行情况。GAPDH作为内参基因，用于校正mRNA上样量。
  综合细胞实验与动物实验结果表明，舒肝解郁胶囊对四氯化碳（CCl₄）诱导的急性肝损伤具有显著的保护作用，其机制主要通过调控PI3K/AKT信号通路抑制肝细胞凋亡。这一发现与生物信息学分析的结果高度一致，进一步验证了其在肝损伤治疗中的潜在价值。
1.急性肝损伤研究现状
  全球大部分的急性肝损伤发生在亚太地区，据估计，全世界有超过10%的人患有这种疾病。在中国，每年仅由药物引起的肝损伤发生率估计为每10万人23.80例。最近几年肝损伤发病率呈上升趋势，严重时可引起肝硬化以及其他临床综合症，严重危害生命安全[1]。急性肝损伤是指患者在原来无慢性肝病基础上，受到放射线损伤、药物毒性损伤、免疫损伤、病毒感染等一种或多种原因短时间内突然发生大量的肝脏细胞损伤导致肝功能受损状况，临床上常表现为乏力、食欲下降、恶心呕吐ALT/AST与DBIL升高、黄疸、腹胀腹泻、皮下出血点等症状[2]。急性肝损伤是指在短时间内突发性的肝功能异常的疾病。肝损伤可以由药物、病毒、免疫损伤等原因所引起；其中氧化应激、炎症反应、细胞纤维化、细胞凋亡等是主要发病机制。由于急性肝损伤的发病机制复杂，目前尚无理想的急性肝损伤治疗方案[3]。
  急性肝损伤病因包括药物性、中毒性、创伤性、感染性、缺血性、妊娠相关性、物理性及其他肝损伤。肝脏是主要解毒器官，负责清除病原体、有毒化学物质和代谢废物，维持体内平衡[4]。肝脏是主要解毒器官，清除病原体、毒素和代谢废物以维持平衡。其长时间暴露于病毒、过量饮酒、脂肪堆积、代谢物和胆汁淤积会导致肝损伤，引发炎症和肝脏变性[5]。其中氧化应急和炎症在急性或慢性肝损伤中是致病的主要原因，在自由基和脂质的过氧化反应活性氧发挥重要作用从而导致细胞的死亡.由多种原因引起的肝脏功能异常，包括病毒感染、滥用药物或酒精、摄入有毒物质等[6]。广泛或持续的肝损伤可导致肝功能衰竭或肝硬化。肝损害的性质已被广泛研究，但急性的机制仍远未分类[7]。
  急性肝损伤（ALI）通常由化学毒素、药物等引起，由于ALI在短时间内的死亡率很高，因此对患者的生命构成严重威胁。大多数ALI病例的基本特征是肝细胞死亡，引发大量炎症细胞浸润，伴随肝功能丧失，伴有血清转氨酶活性急剧升高。如果不及时治疗，ALI可能会发展为肝衰竭，并导致其他器官的病变[8]，CCl4诱导的相应损伤（图1）的生化和组织学事件与人类的肝硬化非常相似。口服或管饲喂养可诱发可重复、明显的急性肝损伤，有助于研究肝脏致病或保护机制[9]。
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图1 CCl4诱导的肝损伤与体内相关酶关系
（2）舒肝解郁胶囊研究现状
  舒肝解郁胶囊是由贯叶金丝桃和刺五加两味中药组成的中药复方药剂，具有疏肝解郁、补肾安神功效，同时还能用于主治情绪低落、失眠、紧张，同时还是我国第一用与临床治疗轻中度抑郁症的中药（图2）。 既往研究表明，舒肝解郁胶囊疗效不弱于单纯西药，其不良反应更容易耐受，可作为基础用药[10]。舒肝解郁胶囊是由贯叶金丝桃和刺五加组成的中成药，具有舒肝祛压 、祛热、祛湿、消肿、舒胸的功能[11]。在中医看来，具有“补气、补脾、补肾、镇静神经”的功能[12]。在中医临床上用于治疗抑郁症、神经衰弱等神经功能性的疾病。
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图2 舒肝解郁胶囊多靶点药理机制与临床应用图谱
  刺五加为五加科植物刺五加的干燥根和根茎，在很多地方都有所生长[13-15]。在药理学上表明刺五加具有扩张人体大脑血管，降低组织耗氧量，降低脑血栓形成[16-17]，抗疲劳、镇静、增强细胞和体液免疫的作用和传统抗抑郁药相比，疗效基本一致，但可以大幅减少副作用。此外还可以治疗冠心病、脑梗死及脑梗死后抑郁、老年功能性失眠和更年期综合征等疾病[18]。另一方面，刺五加的研究也取得了显著进展，除了已知的扩张脑血管[19]、降低组织耗氧量[20]等作用外，科研人员发现其对机体免疫调节系统的多方面影响[21-22]，以及在改善大脑微循环[23]、促进神经细胞功能修复[24]等方面的作用更为复杂且多样，这些新发现拓展了刺五加在治疗相关疾病中的应用前景，也为舒肝解郁胶囊的药理作用增添了更多科学内涵。
  贯叶金丝桃是藤黄科植物贯叶金丝桃的干燥地上部分，始载于《本草纲目》在我国药材资源十分丰富，主要分布于河北、山东、贵州、陕西等地，同时在许多国家也有所应用，具有抗氧化、镇痛、抗炎、抗抑郁的功效[25]，其中在抗抑郁方面相较于传统药物减轻了副作用[26]。舒肝解郁胶胶囊，在中国医院广泛用于治疗抑郁症，其疗效已证明用于重度抑郁症、老年抑郁症和中风后抑郁症[27]。
总体而言，舒肝解郁胶囊作为一款具有独特优势的中药复方药物[28-29]，在抗抑郁及相关神经功能性疾病治疗领域展现出广阔的发展潜力[30]，随着后续研究的持续推进，有望在临床应用和药物研发等方面取得更多突破性进展，为更多患者带来福祉。
（3）参考文献
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1.创新点
①研究视角与应用领域的创新
  本项目聚焦于经典中药复方舒肝解郁胶囊（SJYC）在肝脏保护领域的新应用探索。突破其传统用于抗抑郁的认知局限，系统揭示并验证了SJYC对CCl₄诱导急性肝损伤的显著保护效应，并阐明其核心机制在于调控PI3K/AKT信号通路以抑制肝细胞凋亡。该研究为拓展SJYC的临床应用场景提供了重要的实验依据和理论基础，同时丰富了具有“疏肝解郁”功效中药在肝损伤治疗领域的现代科学内涵。
②方法学的创新
  多维度技术整合，通过SwissTargetPrediction、Metascape等工具快速锁定核心靶点（如Akt1、Bcl-2），提升研究效率。首次将木犀草素、松柏醛等成分与凋亡相关靶点（Bcl-2、CCND1）结合能量化，验证其分子互作可行性。
③科学理论的创新
  提出“多成分-多靶点-多通路”协同模式，阐明贯叶金丝桃（木犀草素）与刺五加（松柏醛）的协同作用，揭示中药复方“多成分协同增效”的分子逻辑。本研究首次将Bcl-2家族成员（包括Bcl-2和BCL2L1）以及细胞周期调控相关靶点（如CCND1和CDK2）与肝损伤治疗联系起来。通过深入的机制研究，揭示了这些关键靶点在肝脏病理生理过程中的重要作用，尤其是它们在调节细胞凋亡和细胞周期进程中的功能。这些发现不仅为肝病的靶向治疗提供了全新的方向，还为开发更精准、更有效的治疗策略奠定了坚实的理论基础。
④研究模式的创新
  构建“成分-靶点-通路”一体化分析框架，通过Cytoscape可视化网络，直观呈现“山奈酚→Akt1→PI3K/AKT通路→抑制凋亡”的作用链条，实现从微观靶点到宏观通路的全链路解析。结合KEGG富集分析，锁定PI3K/AKT通路为核心机制，并通过动物实验反向验证，形成“假设驱动→数据验证”的研究闭环。
2本课题的主要特色
①传统中药复方的现代化解析
  采用“实验验证+计算模拟”双轨策略，将传统中药（舒肝解郁胶囊）的药效机制从经验性描述提升至分子水平解析，推动中药研究向精准化、科学化转型。通过整合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟等计算工具，系统性挖掘复方中多成分（如山奈酚、槲皮素）与多靶点（AKT1、Bcl-2）的协同作用机制。
②跨学科技术融合
  结合CCl₄诱导的经典肝损伤模型，综合肝功能指标（ALT/AST）、组织病理学（HE染色）及细胞凋亡检测（TUNEL），全面评估药物疗效。再利用TCMSP、GeneCards等数据库预测活性成分与疾病靶点，通过STRING构建PPI网络，结合Autodock验证分子亲和力，形成“数据挖掘→靶点预测→实验验证”闭环。
③临床转化导向
  本研究深入探究了舒肝解郁胶囊的保肝功效，并揭示了其剂量依赖性特征。实验结果表明，高剂量（240 mg/kg）的舒肝解郁胶囊在肝脏保护方面表现出最佳效果，显著优于其他剂量组，这一发现为临床用药剂量的优化提供了直接且有力的科学依据，能够帮助临床医生更精准地制定用药方案，从而提高治疗效果。
1. 总体技术路线
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图3 总体技术路线图
（1）通过动物实验验证舒肝解郁胶囊对四氯化碳（CCl₄）诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用
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图4 技术路线图1
  ①小鼠一般状态观察：在给药期间，每日记录小鼠的体重，并观察其毛色、饮食及活动情况。
  ②肝脏大体观察及肝脏系数测定：取出小鼠肝脏，用PBS清洗后吸干表面多余液体，观察肝脏外观并称重拍照。肝脏系数（%）= 肝脏质量（mg）/ 小鼠体重（g）×100%。
  ③血清中ALT和AST含量检测：通过摘取眼球取血，室温静置30-60分钟后，用4℃离心机以3000 RPM离心15分钟，分离上层血清并保存于-80℃。使用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按照说明书检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的含量。
  ④肝组织HE染色：取肝组织进行多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红（HE）染色。染色步骤包括脱水、水化、苏木精染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水透明等，最后封片后在显微镜下观察肝组织病理学变化。
  ⑤TUNEL检测细胞凋亡：从4℃冰箱中取出石蜡切片，恢复至室温后进行脱蜡、水化处理。使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显色法）进行凋亡细胞检测，DAPI染色后用共聚焦显微镜观察。
  ⑥数据统计与分析：将实验数据输入GraphPad Prism 9.5进行统计分析，结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行组间比较，p <0.05表示差异具有统计学意义。
  通过上述技术路线，实验系统地评估了舒肝解郁胶囊对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用，并为后续的机制研究提供了实验依据。
（2）运用网络药理学挖掘研究舒肝解郁胶囊对四氯化碳（CCl₄）诱导的急性肝损伤的潜在作用机制
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图5 技术路线图2
  ①药物活性成分筛选：通过中药数据库与分析平台（TCMSP）和中医百科全书（ETCM）筛选舒肝解郁胶囊中两种主要中药成分（贯叶金丝桃和刺五加）的有效成分。根据口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）筛选潜在活性成分，并结合SwissADME数据库评估成分的胃肠道吸收和类药性，选择符合“三个YES”标准的成分。
  ②潜在靶点预测：通过SwissTargetPrediction网站预测这些成分的潜在靶点，筛选概率大于0的靶点。
  ③疾病靶点收集与筛选：在DisGeNET、GeneCards和OMIM数据库中，以“急性肝损伤”为关键词检索相关基因，删除重复靶点后，将药物靶点与疾病靶点进行交集分析。
  ④构建靶点-成分-疾病网络图：将关键靶点、活性成分和疾病结合，直观展示药物的作用机制。表明舒肝解郁胶囊可能通过PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡，从而对四氯化碳诱导的急性肝损伤发挥保护作用。
  ⑤靶点网络构建：将交集靶点输入STRING网站，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。将PPI网络数据导入Cytoscape 3.10.0软件进行可视化，并构建药物活性成分与靶点的网络图。
  ⑥GO和KEGG富集分析：使用Metascape数据库对PPI网络中的靶点进行GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。发现PI3K/AKT信号通路、细胞凋亡通路等与肝损伤密切相关。
通过网络药理学方法，结合数据库筛选、靶点预测、PPI网络构建和GO/KEGG富集分析，系统地揭示了舒肝解郁胶囊对急性肝损伤的潜在作用机制，为后续的实验验证提供了理论依据。
（3）运用分子对接和分子动力学模拟技术，分析药物与核心靶点之间的稳定性
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图6 技术路线图3
  ①分子对接：首先，从RCSB PDB数据库下载人源PI3K/AKT通路靶标蛋白的晶体结构。舒肝解郁胶囊候选活性成分的3D结构从PubChem数据库获取，经OpenBabel工具转换为pdbqt格式。使用Autodock软件进行分子对接实验，验证舒肝解郁胶囊中的活性成分是否通过PI3K/AKT通路的关键靶点（如Akt1、CCND1、Bcl-2等）发挥作用。计算活性成分与靶点的结合能，发现木犀草素、山奈酚、槲皮素等成分与靶点结合良好，表明这些成分可能通过PI3K/AKT通路抑制细胞凋亡，从而发挥保肝作用。
  ②分子动力学模拟：本研究利用Gromacs 2022软件开展分子动力学模拟。受体蛋白采用CHARMM36力场，配体使用CGenff力场，力场参数通过pdb2gmx工具和AutoFF 网页获取。系统在1 nm的TIP3P水盒子中溶剂化，并通过gmx genion添加离子以达到电中性。长程静电相互作用采用PME方法处理，键约束通过SHAKE算法实现，积分步长设为1 fs。能量优化过程包括3000步最陡下降法和2000步共轭梯度法，依次对溶质、抗衡离子及整个系统进行优化。模拟在310 K、NPT条件下进行，总时长为50 ns，期间利用g-rmsd、g-rmsf、g-hbond、g-Rg和g-sasa等工具，计算RMSD、RMSF、氢键、回旋半径和溶剂可及表面积等参数。
（4）细胞实验与动物实验结合验证舒肝解郁胶囊调控PI3K/AKT信号通路的具体机制

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图7 技术路线图4
  ①细胞实验
  将AML12细胞分为四组：（1）对照组，正常培养未作处理；（2）模型组，通过CCl₄诱导细胞损伤以模拟ALI病理状态；（3）治疗组，在模型组基础上加入不同浓度的新研制药物进行干预；（4）阳性对照组，模型组基础上加入已知PI3K/AKT通路调节剂。
  模型组和治疗组需进行损伤诱导，随后治疗组加入药物继续培养24-48小时。细胞处理后，裂解细胞提取总蛋白和总RNA，分别用于Western Blot（WB）和qPCR分析。WB实验重点检测凋亡通路相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3）以及PI3K/AKT信号通路蛋白（p-AKT、PI3K）的表达水平；qPCR则分析PI3K、AKT的mRNA表达，同时检测凋亡通路相关基因（Bax、Bcl-2、Caspase-3）的转录水平。
  ②动物实验
  采用C57BL/6小鼠，分为四组：（1）对照组，健康小鼠未诱导ALI；（2）模型组，建立ALI模型；（3）治疗组，ALI模型小鼠接受新研制药物干预；（4）阳性对照组，ALI模型小鼠接受标准治疗药物。
  造模后，处死小鼠并取肝组织，一部分液氮速冻用于WB分析，另一部分保存于RNA保护剂中用于qPCR。WB和qPCR的检测指标与细胞实验一致，重点分析肝组织中PI3K/AKT通路及凋亡通路的蛋白和mRNA表达变化。
  WB检测蛋白表达水平，qPCR验证基因转录变化，联合分析可全面阐明舒肝解郁胶囊通过PI3K/AKT通路抑制肝细胞凋亡的分子机制。若WB显示p-AKT上调且Bax下调，qPCR中Akt1和Bcl-2基因表达升高、Bax表达降低，则机制假设得到双重支持。
2. 拟解决的问题
  ①验证舒肝解郁胶囊对CCl₄诱导的急性肝损伤的保护作用，包括对肝组织病理变化、肝功能指标和细胞凋亡的影响。
  ②揭示其作用机制，特别是通过PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡的潜在机制。
  ③评估其作为急性肝损伤治疗药物的潜在应用价值，为后续的临床研究提供理论支持。
3.预期成果
  ①我们预期验证舒肝解郁胶囊对CCl₄诱导的急性肝损伤的保护作用，并揭示其通过PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡的作用机制。这些成果不仅为舒肝解郁胶囊的临床应用提供理论依据，还将推动中药在急性肝损伤治疗中的研究和应用。
  ②预期发表课题相关 SCI 论文 1 篇；完成研究报告 1 篇。
  ①2025年6月—2025年12月：进行深入文献调研并完成具体实验设计。此阶段将系统梳理目标干预物在急性肝损伤（ALI）领域的研究现状，重点关注其与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等病理过程以及PI3K/AKT等相关信号通路的关联证据。基于此前的初步结果与文献分析，将详细设计后续验证实验的具体流程。
  ②2026年1月-2026年6月：研究工作将重点转入计算生物学验证与机制预测。我们将利用分子动力学模拟技术，详细探究目标干预物与潜在关键靶点蛋白的结合模式、结合能及复合物稳定性，预测其相互作用的分子基础。整合这些模拟结果、已有的文献报道及前期数据，系统筛选并聚焦最可能介导干预物减轻ALI效应的核心靶点蛋白及关键信号通路，特别是PI3K/AKT通路及其关键节点分子。
  ③2026年7月—2026年12月：严格按照前期设计的方案，严谨执行细胞水平和动物水平的实验。最终，整合分析实验获得的生理、病理、生化数据与分子水平的结果，建立目标干预物保护效应与PI3K/AKT信号通路调控之间的因果关系。
  ④2027年1月-2027年6月：统整理、校对和分析所有实验数据，进行最终的统计学处理和综合解读。基于完整的数据链和清晰的机制阐释，撰写结构严谨、逻辑清晰的研究论文，着重阐述目标干预物通过调控PI3K/AKT通路减轻ALI的新发现及其潜在机制。同时完成论文投稿至目标学术期刊，并撰写详细的项目结题报告，全面总结项目目标完成情况、主要研究结果、创新点及其科学意义。
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
（1）舒肝解郁胶囊对CCl4致急性肝损伤小鼠一般状态及肝质量系数的影响
  造模前各组小鼠的体重都有所增加（图8A），毛色、饮食及活动无明显差异。造模后，除模型组小鼠精神状态稍显萎靡，饮食及活动减少外，其余各组变化不明显。另外，与Control组相比，模型组的肝脏质量及肝质量系数均增大（图8B-C），这可能与注射CCl4后引起急性肝损伤有关。与模型组相比较，给药组的肝脏质量及肝质量系数呈下降趋势，这可能与舒肝解郁胶囊的治疗作用有关。
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图8 动物实验相关结果（A）小鼠体重变化曲线；（B）舒肝解郁胶囊对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠肝脏重量的影响；（C）舒肝解郁胶囊对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠肝脏系数的影响。
（2）舒肝解郁胶囊对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏大体和组织形态学的影响
  小鼠肝脏大体观察发现：空白组小鼠肝脏表面光滑，颜色鲜红。模型组小鼠肝脏表面有黄色的突起，颜色变为浅黄色。而给药组随着剂量的增大相较于模型组颜色逐渐变红，肝脏表面逐渐光滑，整体逐渐正常化。
  HE染色结果显示：对照组小鼠肝肝细胞排列整齐，肝索在呈放射状规律排列，无肝细胞脂肪变性坏死和炎症细胞浸润等现象；模型组小鼠肝细胞肿大，细胞数量模糊，细胞排列不整齐并伴有炎性细胞浸润；与模型组比较，舒肝解郁胶囊各剂量组给药后可改善肝细胞形态结构，可不同程度地减轻炎性细胞浸润和肝细胞坏死，细胞形态基本趋于正常（图9）。
  上述结果表明，舒肝解郁胶囊能改善CCl4致小鼠的肝组织病理损伤。
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图9 舒肝解郁胶囊对小鼠肝脏大体和小鼠肝脏组织病理学的影响
（3）舒肝解郁胶囊对CCl4诱导急性肝损伤血清中ALT和AST的影响
  检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平是评估肝细胞损伤程度的关键指标。当肝细胞受损或破裂时，这些酶会释放入血，导致血清中ALT和AST活性显著升高。因此，测定它们的含量是判断肝脏健康状况和药物保肝效果的直接且常用的方法。与对照组相比，模型组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的含量均显著升高（p<0.0001）。与模型组相比，给予舒肝解郁胶囊处理后，随着给药剂量的增加，小鼠血清ALT和AST水平呈现剂量依赖性降低（图10）。这些结果表明，舒肝解郁胶囊对CCl4诱导的小鼠肝细胞损伤具有显著的保护作用。
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图10 舒肝解郁胶囊对血清中ALT和AST活性的影响
（4）舒肝解郁胶囊活性成分治疗急性肝损伤的机制探究
  通过TCMSP和ETCM数据库筛选舒肝解郁胶囊中贯叶金丝桃和刺五加的有效成分，基于OB≥30%和DL≥0.18筛选出潜在活性成分，并结合SwissADME评估其胃肠道吸收和类药性，确定了山奈酚、木犀草素、槲皮素等活性成分及其靶点。收集急性肝损伤相关靶点（DisGeNET、GeneCards、OMIM），与药物靶点进行交集分析，获得共同靶点（图11A）。利用STRING构建PPI网络，通过Cytoscape筛选核心靶点（图11B）。GO富集分析显示靶点涉及氧化应激、细胞凋亡等过程（图11C），KEGG分析揭示PI3K/AKT信号通路、细胞凋亡通路等关键通路与肝损伤密切相关（图11D）。
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图11 网络药理学分析结果(A)药物与疾病靶点韦恩图； (B)核心靶点的获取； (C)GO富集分析 ；(D)KEGG富集分析。
（5）分子对接验证舒肝解郁胶囊活性成分与靶点结合稳定性
  为了验证舒肝解郁胶囊中的活性成分是否通过PI3K/AKT通路来抑制细胞凋亡，因此根据活性成分和PI3K/AKT通路的相关基因筛选，分别选取度值前五名进行分子对接，结果表明舒肝解郁胶囊的两种成分（贯叶金丝桃和刺五加）可以和PI3K/AKT通路中的靶点Akt1、CCND1、Bcl-2、GSK3β和EGFR对接成功（图12）。说明舒肝解郁胶囊有可能有影响PI3K/AKT通路并抑制细胞凋亡来治疗急性肝损伤的潜力。
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图12 分子对接结果展示 (A)分子对接结合能(kcal/mol)； (B)Akt1-catechin； (C)Bcl2-kaempferol； (D)CCND1-isofraxidin (E)GSK3β-catechin。

（1）已具备的条件
① 完善的实验平台与关键设备
  本项目借助本校药理生物医药平台，为实验的顺利进行奠定了基础。该平台配备了：细胞培养室、SPF级动物房及动物实验操作区、分子生物学实验室、显微成像室等；拥有完成核心实验的关键仪器设备，如：多功能微孔板检测仪（用于ALT/AST等肝功能检测）、实时荧光定量PCR仪（qPCR）、Western Blot设备、倒置荧光显微镜（用于细胞形态观察及凋亡检测）等。现有设备状态良好，能够满足本项目动物实验、分子生物学检测及细胞实验的基本需求。
② 经验丰富的执行团队与扎实的前期基础
  项目组成员系统学习过药理学、分子生物学、中药学等专业课程，具备扎实的理论基础。同时又熟练掌握本项目涉及的关键实验技术，如：CCl4诱导肝损伤模型的构建与操作、组织样本处理与病理切片制备（HE染色）、血清生化指标检测（ALT/AST）、Western Blot检测关键蛋白表达、qPCR检测基因表达等。
  前期预实验已初步验证了舒肝解郁胶囊对CCl4肝损伤模型的保护趋势（如显著降低ALT/AST水平），并完成了相关文献调研、实验方案详细设计与部分试剂订购，项目理论基础扎实，技术路线可行。
③ 独特的数据分析资源与导师支持体系
  实验室具备高性能计算工作站及专业生物信息学软件（如AutoDock Vina, Cytoscape等），可高效完成网络药理学分析、分子对接等任务。依托实验室建立的成熟药物靶点数据库及肝脏疾病相关组学数据库访问权限，为本项目的靶点预测与机制研究提供重要数据支撑。项目得到指导教师的全程指导，确保实验设计科学、技术难题及时解决。
（2）尚缺少的条件
  项目后期需开展大规模全原子分子动力学模拟（需GPU并行计算集群支持），当前本地算力无法满足计算精度与时效要求。
（3）解决方法
  已通过导师联系山东大学分子模拟实验室，初步达成合作协议，计划在项目第3个月利用其设备进行关键测试。（预算预留2000元机时费）同步申请本校超算中心“创新项目支持计划”免费配额，用于关键参数的辅助验证（已确认符合申报资格）。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 10000.00 10000.00
1. 业务费 2000.00 业务费 1000.00 1000.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 分析测试费用 1000.00 1000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 0.00 无 0.00 0.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 18000.00 实验动物购买、饲养；血清、抗体、试剂盒等实验耗材购买 9000.00 9000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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