济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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水环境中致病性副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）快速检测方法的建立

申报人：刘川源 申报日期：2025-03-17

基本情况

2025创新项目
水环境中致病性副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）快速检测方法的建立 学生申报
创新训练项目
医学
公共卫生与预防医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
针对V. parahaemolyticus快速检测的需求，整合现有靶点并通过模拟不同水环境温度条件，分析9种常见水生病原菌的蛋白表达差异，筛选出V. parahaemolyticus在多种温度下稳定表达的特异性蛋白作为新型检测靶点，建立基于RPA-LFD技术的高效检测方法，通过提升检测效率（快速性）与准确性（灵敏度/特异性），降低食源性疾病爆发风险，减少经济损失。所建立的检测技术将服务于水产养殖病害防控、海鲜食品安全监管及水环境公共卫生监测。
无
1. 水产养殖细菌病原现场精准检测技术的创建及预警应用（国家重点研发计划“海洋渔业”专项项目）
2. 山东省高等学校青年创新团队项目（山东省教育厅）
3. POCT产品研发项目（横向课题）
指导教师前期已对该项目提出理论可行的方案，为我们提供理论指导和实验操作指导为我们争取各种资源实验设备及实验材料等，保障项目顺利进行。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
刘川源 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 统筹项目编写工作，和过NCBIRPA-LFD检测特异性、灵敏度验证，实际样本检出率验证，并负责查阅文献，整合已报道的V. parahaemolyticus检测靶点，通获取基因序列，并进行多重比对.
孙颢哲 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 进行不同水环境温度条件（16℃、28℃、37℃）的菌体培养实验准备工作，包括实验设备调试、试剂准备、天然蛋白获取等。
董可欣 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 根据HPLC-MS/MS结果，筛选高丰度的特异性蛋白，通过NCBI 获取蛋白对应基因序列，并选取高特异度区段设计RPA引物及探针。
姜沣轩 公共卫生学院 预防医学（本科） 2024 协助各项实验进行，并撰写论文。

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
辛鲁生 公共卫生学院 否
李印龙 公共卫生学院 否

立项依据

针对V. parahaemolyticus快速检测的需求，整合现有靶点并通过模拟不同水环境温度条件，分析9种常见水生病原菌的蛋白表达差异，筛选出V. parahaemolyticus在多种温度下稳定表达的特异性蛋白作为新型检测靶点，建立基于RPA-LFD技术的高效检测方法，通过提升检测效率（快速性）与准确性（灵敏度/特异性），降低食源性疾病爆发风险，减少经济损失。所建立的检测技术将服务于水产养殖病害防控、海鲜食品安全监管及水环境公共卫生监测。 
1 .V. parahaemolyticus现有检测靶点的整合
查阅文献，整合已报道的V. parahaemolyticus检测靶点，通过NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 获取蛋白对应基因序列，并选取高特异度区段设计RPA引物及探针。
2. V. parahaemolyticus检测新靶点的筛选
模拟不同水环境温度条件（16℃、28℃、37℃），通过SDS-PAGE分析9种常见水生病原菌 (P. damselae, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. campbellii, V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. splendidus, V. kanaloae, E. tarda) 的蛋白表达差异。差异蛋白带通过HPLC-MS/MS鉴定，根据HPLC-MS/MS结果，筛选高丰度的特异性蛋白，通过NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 获取蛋白对应基因序列，并选取高特异度区段设计RPA引物及探针。
3. RPA引物探针的设计
参照RPA引物设计原则，通过Primer Primer 5.0 软件设计RPA引物及探针，上下游引物长度为35bp，下游引物5’末端用Biotin标记，探针长度48bp，探针5’末端用FAM进行标记，3’末端引入3-Cspacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点（AP位点），AP位点前保留31bp的碱基，AP位点之后有16bp的碱基。引物序列通过BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 进行特异性比对。
4. RPA-LFD的特异性和灵敏度验证
以ddH2O为空白对照，上述8种近缘水生病原菌为阴性对照，验证RPA-LFD检测的特异性。以平板计数为108的V. parahaemolyticus 梯度稀释后提取核酸为反应模板，ddH2O为空白对照，验证RPA-LFD检测的灵敏度。
5. 实际样本检测出率测定
采集典型水环境样本（近海水、养殖场废水），经菌体富集后，使用核酸释放剂提取检测模板进行RPA-LFD及16S测序鉴定，验证实际样本的检测结果。
国内研究进展：RPA-LFD已广泛应用于病原检测 ，如非洲猪瘟病毒（ASFV）、禽流感病毒（H5/H7亚型）的检测。针对结核分枝杆菌、布鲁氏菌等，目前已存在多靶标RPA-LFD试剂盒，提升检测效率。 RPA-LFD技术在水产养殖业和食品安全等领域也被广泛应用，如检测嗜水气单胞菌、鲤春病毒血症病毒（SVCV）等，实现病害控制；用于检测食源性病原菌沙门氏菌、李斯特菌等，实现食品安全监管。
国外研究进展：RPA-LFD检测的病原覆盖范围更广，如检测疟原虫、登革热病毒、利什曼原虫等 ；也可用于耐药菌检测，如针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、碳青霉烯酶基因（blaNDM-1）等，实现快速耐药性筛查。
RPA-LFD技术在病原检测领域展现了强大的应用潜力，国内外研究均聚焦于技术优化、场景适配及成本控制。未来需加强跨学科合作，解决标准化与临床验证问题，以进一步推动其在公共卫生、食品安全和跨境防疫中的广泛应用。
1 靶点筛选策略的创新
首次通过模拟水环境温度梯度（16℃、28℃、37℃），分析V. parahaemolyticus与8种近缘水生病原菌的蛋白表达差异，筛选出V. parahaemolyticus在多种温度下稳定表达的特异性蛋白作为检测靶点，确保检测方法对水环境（如海水、养殖水体）中温度波动的耐受性。相较于传统依赖单一毒力基因的检测方法，该策略从环境适应性和功能蛋白稳定性角度出发，显著提升了靶点的特异性，有效避免交叉反应，为病原菌检测提供了更可靠的分子标志物。
2 检测技术的优化与整合
利用RPA技术（37-42℃恒温扩增）替代传统PCR，结合（LFD）实现可视化结果判读，无需精密仪器和电泳步骤，将检测时间缩短至30 min以内，适用于基层现场和资源匮乏地区。
3 核酸现场快速提取技术的创新
优化一种可用于现场快速提取核酸的核酸释放剂，简化核酸提取过程，符合现场快速检测的需求。

          技术路线     summernote-img

拟解决的问题
突破传统检测方法的局限
传统微生物学检测方法操作繁琐、耗时久；免疫学检测方法难以制备特定抗体，且对抗体特异性要求高；核酸检测方法（如PCR）虽特异性和灵敏度高，但依赖精密仪器，无法满足现场快速检测需求。
准确区分致病性菌株
自然环境和水产品中多数副溶血性弧菌无致病性，准确鉴定致病性菌株对保障食品安全至关重要。筛选出V. parahaemolyticus在多种温度下稳定表达的特异性蛋白作为新型检测靶点，并结合毒力基因的检测，建立RPA-LFD检测方法。以实现对目标菌株的高灵敏度快速鉴定，降低食源性疾病爆发风险，减少经济损失，对水产养殖病害防控、海鲜食品安全监管及水环境公共卫生监测具有深远意义。
 预期成果
建立高效检测体系
基于RPA-LFD技术，构建高效的V. parahaemolyticus现场快速检测体系。
 精准鉴定病原
准确鉴定水环境中的V. parahaemolyticus，明确其致病性，提高检测的准确性和可靠性。
 学术论文
发表学术论文1-2篇。

第一阶段：文献调研与方案设计
①系统调研国内外水环境中弧菌的检测技术现状，分析传统方法（分离鉴定、培养法、生化鉴定）与新兴技术（分子检测、生物传感器）的优缺点；
②调研已有的V. parahaemolyticus的检测靶点。
第二阶段：实验材料准备与预实验
①采集典型水环境样本（近海水、养殖场废水），建立样本库；
②准备实验材料：引物设计合成、培养基配制、检测试剂盒采购；
③开展预实验，验证基础检测方法。
第三阶段：检测技术开发与优化
①开发目标检测技术：RPA-LFD快速检测，优化反应条件，温度、引物浓度等；
②对比不同方法的灵敏度、特异性及耗时成本，筛选出最优方案；
③引入阳性/阴性对照，排除环境干扰因素。
第四阶段：检测技术验证与数据分析
①对实际水样进行检测，评估技术可靠性；
②与传统培养法对比，验证检测效率。
第五阶段：技术改进与应用拓展
①针对实际应用场景优化检测流程；
②探索技术在水产养殖、公共卫生等领域的应用潜力。
第六阶段：成果总结与结题
①整理实验数据，撰写结题报告与学术论文；
②制作技术推广材料。  
已整合现有检测靶点；
已建立RPA-LFD检测方法，可用于OsHV-1、HaHV-1等病原的检测。

本实验在专业实验室开展，实验设备齐全，条件充足。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 8000.00 无 3500.00 4500.00
1. 业务费 2000.00 无 500.00 1500.00
（1）计算、分析、测试费 1000.00 无 500.00 500.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 1000.00 无 0.00 1000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 6000.00 无 3000.00 3000.00
结束

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