1.国内外研究现状
1.1 荧光探针
荧光探针（fluorescence probe）是指利用荧光信号对被分析物进行识别，从而实现对被分析物定性或定量分析的一类分子[3]。1987 年，诺贝尔奖获得者莱恩教授提出了“超分子化学”，即分子自组装现现象，这是一种基于分子识别，主客体相结合并产生某种特定的新功能的过程。正是基于这种分子识别的思想，人们将荧光信号与识别过程结合了起来，提出了分子荧光探针的概念。荧光分子探针通常包括三部分：荧光基团(Fluorophore)、连接基团(Spacer)、识别基团(Receptor)[4]。近年来，基于荧光探针的生物传感技术操作简单、检测限低、低毒性、高灵敏度和高选择性等多种优势在疾病评价中得到了广泛应用。
1.2 荧光共振能量转移
其中，常见的设计机理包括光致电子转移(PET)、激发态分子内质子转移(ESIPT)、荧光共振能量转移(FRET)、内部电荷转移(ICT)、扭曲分子内电荷转移(TICT)和聚集诱导发射(AIE)[5]。FRET 技术通过将两个荧光染料标记在一个分子探针中，实现荧光信号的能量转移，从而实现对目标物质的检测和定量分析。目前，FRET（荧光共振能量转移）技术作为一种高灵敏度的荧光探测方法，由两个不同的荧光团通过非共轭键连接析物的加入，探针发生两个不同发射光谱荧光强度的相对变化。通常，能量供体发射光谱和能量受体吸收光谱之间存在一定程度重叠，且两者需要满足一定距离时(一般小于 10nm)，FRET 机理才能发生。用激光照射能量供体时，荧光能量从能量供体向受体转移发生非辐射过程，产生受体荧光。从该机理的过程可以看出,这类型的荧光分子与对应的单个供体或单个受体荧光团相比,表现出更大的斯托克斯位移，因此 FRET 技术已被广泛应用于生物传感和分子探针的构建。基于 FRET 技术所研发的 HClO 和黏度探针也层出不穷，但多数不能同时响应二者。
图2 荧光共振能量转移（FRET）原理图
1.3 动脉粥样硬化
动脉粥样硬化性心血管疾病（Atherosclerosis，AS）是很常见的慢性炎症性疾病，主要由脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调等多种因素引发，是全球公共健康的最大威胁之一，目前呈现高发病率、年轻化的趋势[6]。《2020 世界卫生统计报告》中指出，40％的全世界总死亡人数可归因于心脑血管疾病。此外，动脉粥样硬化导致的死亡占心脑血管疾病总死亡的 3/4，预计到 2030 年，心血管疾病的发病率将会持续增长，并达40.5％。一项Ｍeta 分析总结了 21 个国家和地区的 59 项研究，并估算 2020 年全球患有颈动脉粥样硬化的人数近 20 亿，而有颈动脉粥样硬化的国人可能有 2.7 亿。动脉粥样硬化己然成为当前最为突出的公共卫生问题，防治动脉粥样硬化刻不容缓[7]。
图3 动脉粥样硬化的进程
1.4 活性氧和黏度
活性氧化物(Reactive oxygen species,ROS) 广泛指代氧来源的自由基和非自由基，由于它们含有不成对的电子，因而具有很高的化学反应活性[8]。次氯酸（hypochlorous acid,HClO）作为体内重要的 ROS 之一, 凭借其对多种蛋白质侧链和肽的特异性反应，在溶酶体吞噬过程中破坏生物系统中的病原体。因此在生命体系中起着至关重要的作用[9]。HClO 因具有较高的氧化性，过量的表达和产生的位置不当会对机体产生严重的损害，这被称为氧化应激。从而导致许多疾病，如恶性肿瘤，糖尿病，神经炎症，动脉粥样硬化，肝损伤等[10]。常用的检测 HClO方法有比色法、电化学分析法、化学发光法、高效液相色谱法、质谱和毛细管电泳等[11]。
黏度是多种生理活动中的重要参数，例如信号传递、癌症扩散、细胞代谢和迁移[12]。另一方面，在氧化应激条件下，与扩散介导的细胞事件相关的黏度会发生改变。同时，黏度异常会影响代谢产物扩散、信号转导等一系列细胞过程，最终可能加剧氧化应激[13]。因此,开发高度敏感的和选择性的 HClO 和黏度的双响应荧光探针,对于实时和体内监测生命系统中的 HClO 和黏度并研究其在生物学和病理事件中的作用是十分重要的。
1.5 用于检测动脉粥样硬化探针
荧光探针往往具有多种活性位点，可以与动脉粥样硬化相关的生物分子反应，从而从分子和细胞水平提前预测动脉粥样硬化的发展（图4）[14]。同时，荧光探针的成像功能逐渐优化。例如，与常见的单光子成像相比，近红外成像具有更深的组织反射，上转换发光具有更大的抗斯托克斯位移和较弱的背景噪声，聚集诱导发射（AIE）可以克服高凝聚光诱导荧光猝灭的局限性。简而言之，这些优势使荧光探针成为动脉粥样硬化成像的有力工具。
图4 荧光探针在动脉粥样硬化成像中的研究进展
近期，Ji等人设计了一种荧光探针MicroRNA-155 （miR-155），其使用生物标志物对动脉粥样硬化斑块进行精确成像可以促进动脉粥样硬化 （AS） 驱动的心血管疾病的诊断和临床管理[15]。miR-155使用内源性次氯酸（HClO）门控级联信号放大策略，对在泡沫细胞中进行精确的成像，从而能够准确检测体内和离体的动脉粥样硬化斑块。该策略利用硫代磷酸酯（PT）修饰的发夹探针，该探针被 HClO 特异性脱保护并被 miR-155 解笼，触发催化发夹组装 （CHA） 以放大荧光信号。PT-CHA 探针封装在脂质纳米颗粒（LN）中，然后与磷脂酰丝氨酸（PS）结合肽（PBP）偶联，以选择性靶向泡沫细胞，从而在动脉粥样硬化斑块中实现体内 miR-155 成像。主动脉区域 PT-CHA@LN-PBP 的荧光强度在携带 AS 的小鼠、miR-155–/–小鼠和健康小鼠之间显示出明显的差异。此外，荧光强度与斑块面积和 AS 进展密切相关，并且可以区分斑块脆弱风险，曲线下面积（AUC）为 0.94。人体主动脉组织的成像进一步验证了探针区分动脉粥样硬化斑块和正常动脉内膜的能力。这些发现将 PT-CHA@LN-PBP 确立为一种无创、可靠的诊断工具，用于精确评估AS。
图5 MicroRNA-155用于体内动脉粥样硬化的精确诊断[15]
目前的荧光探针主要依赖于针对单一生物标志物的单峰成像，缺乏特异性，由于复杂的细胞内环境，这可能导致潜在的错误信号读数。Cheng等人报道了三种荧光探针（M-1、M-2 和 M-3）的开发，旨在实现线粒体 HClO和粘度的同时检测和成像[16]。光谱分析显示，这些探针对 HClO 和粘度表现出高度特异性，在亚纳摩尔水平上具有出色的灵敏度，并在 2 分钟内快速响应。其中，M−2 在荧光发射 （延伸到近红外区域） 和灵敏度 （低至 0.072 nM） 方面表现出最佳性能，并被选中进行生物学评价。当应用于活细胞时，探针 M-2 在线粒体内表现出高度优先积累和双峰 off-on 荧光反应，允许使用双通道显微镜评估线粒体 HClO 和粘度水平。使用该探针，我们有效地监测了早期 AS 小鼠的异常 HClO 和粘度水平，为早期 AS 诊断提供了高度灵敏和精确的工具。
图6 开发用于HClO和粘度双峰检测的 NIR 探头[16]
2．发展趋势
随着科技的不断发展，荧光探针研究在多个领域中得到了广泛的应用。作为一种具有高度敏感性和高分辨率的检测技术，荧光探针研究不仅在材料科学、环境科学和能源等领域中领域发挥着关键作用，还在生物医学展示出巨大的潜力。在生物医学中，荧光探针技术被广泛用于细胞成像、蛋白质分析和疾病诊断等方面。随着成像设备的不断改进，荧光成像技术将实现更高的空间和时间分辨率。此外，结合其他成像技术，如超分辨显微镜和多光子显微成像等，可以实现更准确的细胞和组织成像，为疾病的早期诊断和治疗提供更多可能性。
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