济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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枯草芽孢杆菌细胞工厂的构建及其在丙谷二肽生物合成中的应用

申报人：李楠 申报日期：2025-03-17

基本情况

2025创新项目
枯草芽孢杆菌细胞工厂的构建及其在丙谷二肽生物合成中的应用 学生申报
创新训练项目
理学
生物科学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
随着中国对医疗卫生行业的重视程度加大以及近年来人们对于活性肽产品兴趣增大, 如何实现小分子肽类化合物的高效生物合成成为热点问题。本项目拟在前期研究的基础上，以具有自主知识产权的α-氨基酸酯酰基转移酶(pAET-7)为研究对象，探索SAET的底物识别机制及催化机制，通过理性分子改造提高其催化能力。其次，以枯草芽孢杆菌 BS168为底盘细胞，通过启动子工程设计 SAET 的高表达载体，并构建丙谷二肽生物合成途径。然后，利用 CRISPRi 技术探索与丙谷二肽中心代谢有关的 7 个关键基因转录水平的改变对其生物合成的影响。基于启动子优化精确调节丙谷二肽合成代谢网络, 使更多物质与能量流向该代谢途径, 进一步提高丙谷二肽合成效率。通过本项目的研究期望为枯草芽孢杆菌底盘细胞的理性设计、动态代谢工程研究及 α-氨基酸酯酰基转移酶的催化机制提供理论与实践基础。
无
指导教师承担科研课题情况
(1)山东省自然科学基金博时基金；
(2) 教育部产学研协同育人项目；
(3) 济宁医学院博士启动基金；
(4) 济宁医学院国家自然科学基金培育基金；
(5) 济宁医学院青年教师扶持基金;
(6) 贺林院士新医学科研基金。
指导情况：本项目指导教师将对本团队给予了全方位的支持与指导。在项目筹备阶段，导师结合自身专业领域经验，深入参与项目规划与方向论证，协助团队完成技术路线设计和可行性分析。在实施过程中，针对关键技术难题提供专业解决方案，并协调实验室设备、校内外专家资源对接等实质性支持。特别是在创新性突破环节，导师鼓励团队大胆尝试新兴技术路径，将定期跟踪项目进展并提供优化建议，同时指导学生完成计划书撰写及实验操作。团队可随时通过线上线下多渠道与导师保持高效沟通，确保项目稳步推进。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
李楠 生命科学学院 生物技术（本科） 2023 设计实验并进行分工
陈赫凡 生命科学学院 生物技术（本科） 2023 优化发酵条件
张菲菲 生命科学学院 生物工程（本科） 2022 撰写研究报告
李硕 生命科学学院 生物工程（本科） 2022 筛选SAET突变体
金军利 生命科学学院 生物技术（本科） 2022 筛选启动子序列
于沐阳 生命科学学院 生物技术（本科） 2024 记录分析实验数据

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
王涛 生命科学学院 否

立项依据

(I) 通过理性改造，获得催化性能得到显著提高的 pAET-7 突变体，并对其进行结构鉴定。筛选得到的突变体满足以下条件：底物特异性( Kcat/Km) >90%, 酶活提高 20%以上，Tm 值提高3-5°C 以上，最适反应温度条件下半衰期延长 30%以上。
(II) 应用微生物代谢工程及合成生物学技术，对模式细胞 BS168 进行理性改造，成功构建高效的微生物细胞工厂，使其丙谷二肽生产效率超过目前的最高水平。  
为了探索 pAET-7 底物识别机制及其多催化性能协同强化的研究，本项目将主要从以下三个方面进行研究：
(I) 确定底物及产物进出 pAET-7 活性中心的转运通道，验证其中参与底物识别的关键结构因素，提高其对目标底物的选择性。利用 CAVER3.0 软件及随机加速动力学模拟对底物和产物在 pAET-7 内的迁移路径进行研究。在此基础上，利用分子动力学模拟探索在该路径范围内对底物识别起关键作用的结构因素，并进行验证。
(II) 基于枯草芽孢杆菌 BS168 构建丙谷二肽的生物合成途径。通过 CRISPR/Cas9 技术将SAET 整合到 BS168 染色体上，构建丙谷二肽物合成细胞工厂。在此基础上使用寡核苷酸退火和金门克隆方法，实现启动子片段的随机组合，构建启动子组合文库；通过工程改造，筛选出能够实现不同基因高效、精准表达调控的启动子。
(III) 基于 CRISPRi 干扰技术，通过研究丙谷二肽生物合成过程中 8 个关键酶表达水平的改变对其产量的影响，平衡丙谷二肽生物合成与细胞生长之间的关系，提高细胞工厂的合成效率。建立了基于木糖诱导的 CRISPRi 代谢干扰系统，通过研究主要基因的转录水平的改变对丙谷二肽生物合成的影响，确立代谢途径优化策略，从而实现对该代谢通路的有效、精准调控。  
1.1 α-氨基酸酯酰基转移酶作为生物催化剂是生物合成活性二肽的有效手段
由于人口老龄化加剧、亚健康人群增多、慢性疾病发病率的持续攀升及健康意识不断增强，人们对天然、营养、功能性食品的诉求日益凸显。2017 年初，国家发展改革委与工业和信息化部联合发布《关于促进食品工业健康发展的指导意见》，其中明确指出“支持发展生物活性肽等保健和健康食品”。当前，活性肽产品呈现出多元化和个性化发展趋势，是食品与药物研发领域最热门的研究课之一1。而其高效合成也成为重要的研究和应用转化方向，特别是更加绿色、可持续性的生物合成技术，受到越来越多的重视。
随着微生物技术的不断发展，目前已发现多种生物催化酶能够以非保护的氨基酸为底物直接催化合成肽键，如非核糖体肽合成(NRPS)、L-氨基酸-α-连接酶(Lal)、α-氨基酸酯酰基转移酶(AET)等，这使得生物法直接制备活性肽成为可能。(1) NRPS 由于分子量十分巨大，分子改造相对较难，这导致重组蛋白一般催化活性比较差，目标产物产率较低，在实际应用中相对较少 2。(2) L-氨基酸-α-连接酶是 ATP-grasp 酶超家族中的重要一员，能够以无保护的 L-氨基酸为底物催化合成二肽化合物。Lals 虽然能直接催化合成肽键，但其催化效率较低，加上其底物谱较广，导致目标产物的产率较低，不能满足生产的需要3-6。(3) AET 能够以氨基酸甲酯为酰基供体，氨基酸为亲核物质催化合成二肽。目前已发现两种来源不同的 α-氨基酸酯酰基转移酶，其中来源于 Siyangensis AJ2458 中的 SAET 具有更高的活性，也是目前丙谷二肽催化合成效率最高的蛋白酶 7-12。但其底物谱同样较广，在催化过程中会导致少量副产物的产生。最近日本研究者基于 SAET 开发出一条工业化生产 Aspartame 的工艺路线，但由于该酶对底物Asp-(OMe)2 的特异性问题，导致产物产率仅为 65%13。从这一案例不仅反映出 SAET 在小分子肽类化合物生物合成中的巨大应用潜力，同时也表明需要对 SAET 进行进一步的结构改造提高其底物特异性，进而改善其催化活性。
本课题组一直致力于探索丙谷二肽的高效生物合成技术。一方面通过理性设计，分子改造 L-氨基酸连接酶，提高其催化活性(山东省自然科学基金支持，ZR2019BB062)。另一方面，我们基于日照地区特殊的地理优势，发掘海洋微生物中潜在的具有较高丙谷二肽合成能力的宿主及相关催化酶。2024 年 09 月，成功从 3000 多份海泥样本中筛选得到一株具有显著二肽合成能力的海洋多粘芽孢杆菌细菌(Paenibacillus sp., 命名为 AG_720)。通过全基因组测序与Pfam 数据库搜索，鉴定出了一种新型的具有丝氨酸活性单元(GxSYxG)结构的蛋白酶，与SAET 的序列一致性达到 41.6%。通过异源表达及酶学性质研究，初步确定其为一种新型的 α氨基酸氨基酸酯酰基转移酶，并命名为pAET-7。相关研究成果(A novel α-Amino acid esteracyltransferase from Paenibacillus sp. capable of catalyzing the biosynthesis of Ala-Gln) 已在发表过程中(Applied Microbiology and Biotechnology, minor revision )。
与其它酶相比，pAET-7 具有催化活力高的最大优点，为了进一步拓展 α-氨基酸酯酰基转移酶的应用潜力，基于前期的研究仍存在如下的问题： (1) pAET-7 最大的劣势在于其底物特异性不高、底物谱较广，在高效催化合成目标产物的同时，还会合成其它二肽、三肽类产物，从而导致摩尔转化率降低； (2) 虽然 AET 在碱性条件下相对稳定，但在酸性条件下及热处理条件下酶活力表现出不稳定性，如何解决其稳定性问题是产业化应用 pAET-7 的另一个关键问题；(3) 在提高 AET 底物特异性的基础上，如何同时实现其催化活性与稳定性的改善仍然是一个棘手的问题。
1.2 如何基于合成生物学的理论与方法理性设计高效的细胞工厂是实现 pAET-7产业化应用的关键
(I) 深入研究 α-氨基酸酯酰基转移酶底物识别的分子基础是通过理性改造提高 pAET-7 底物特异性的前提条件
底物特异性差是限制 pAET-7 用于制备小分子肽类化学品的一个关键因素，探索 AET 的催化机制特别是其底物识别机制，对于实现丙谷二肽的高效生物合成和实现其代谢调控具有重要的导意义。通过生物信息学分析 pAET-7 的同源蛋白发现其都有一个丝氨酸活性部位(GxSYxG)，由于这个部位在丝氨酸酶中是高度保守的，可以推测 pAET-7 也属于丝氨酸酶超家族。AET 在结构上为全 β 类蛋白；核心结构由非常相似的 N 末端结构域和 C 末端结构域构成, 每个结构域是一个由6个β折叠片构成的β 折叠桶。催化三联体中有两个(Asp102及His57)位于 N 端, 但是最重要的 Ser195 位于 C 末端。除此之外，其它重要的功能位点包括稳定催化中间产物的氧离子孔( Gly193 及 Ser195)，底物特异性口袋( Ser189、Gly216 及 Gly226)及主链底物结合位点( Ser214, Trp215 及 Gly216) 也都位于 C 末端。
研究表明 AET 在肽键水解过程中涉及两步催化机制，主要分为 4 个阶段(图 1(1))14。除了 Ser 残基以外，绝大多数的丝氨酸蛋白酶同时需要依赖 His 和 Asp 的功能，但是关于 His 和Asp 的功能目前仍存在一定的争议，需要进一步的研究 14-16。AET 催化形成二肽则相当于是丝氨酸蛋白酶所催化水解反应的逆反应(图 1)9：即以氨基酸为亲核试剂攻击氨基酸甲酯的酯酰基，然后缩合形成二肽。该过程取决于轻微活化的 C-末端酯迅速酯化丝氨酸蛋白酶，酯基酶中间体通过水和添加的亲和试剂进行速度限制的竞争性的脱酯化，以实现二肽产物的瞬时积累。
虽然 SAET 在分类上属于丝氨酸蛋白酶家族，但是其催化机制尚存在许多不明确的地方，例如：质子从催化丝氨酸残基到组氨酸及底物的亲核攻击是连续的还是分步进行的；四面体过渡态中间产物是如何形成的；二肽产物是如何释放的；酶催化过程中是否存在低垒氢键及其重要性等等问题需要进一步的探索。
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(II) 如何利用合成生物学的基本原理优化和改造微生物的遗传体系，是实现高效合成丙谷二肽的关键
随着合成生物学的迅速发展，特别是随着 CRISPR/Cas9 技术的不断完善，越来越多的天然高附加值化学品和大宗化学品可以通过在微生物底盘细胞中构建人工合成途径、动态多层次地调控细胞网络来进行生产。常规基因工程技术和代谢工程技术一般采用加强主要代谢途径，阻断竞争代谢途径以减少代谢分流来提高产品合成效率，但是一些竞争途径的代谢基因敲除经常会对细胞生长造成负面影响，这也是合成生物学研究中的一个共性难题。因此，为了实现丙谷二肽的高效生物合成，我们归纳出如下的关键科学问题：如何基于功能强化的催化酶，在底盘细胞中对内源代谢网络进行重新布线和调控，精确调节物质流及能量流，从而设计出丙谷二肽的最优合成途径，提高微生物细胞工厂的生产效率。
首先，作为一种典型的革兰氏阳性细菌和模式工业微生物，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有非致病性、强大的胞外分泌蛋白能力以及无明显的密码子偏爱性等优点，并且是一种食品安全宿主菌，在功能营养品、精细化学品和酶制剂的生产中具有广泛应用。基于优良的宿主细胞，利用合成生物学的理论与工具进行细胞工厂地设计、重组改造乃至重新合成，对于我国绿色生物制造产业和可持续发展战略至关重要。由于启动子结构决定了下游基因的表达强度及表达模式，因此成为驱动基因表达、调控基因线路、赋能微生物功能、获得高产酶与高性能细胞工厂的合成生物学核心元件；能够在转录水平上实现基因高效、精准表达调控。因此，结合动态代谢调控技术，具有动态调控功能的特殊启动子的发现与改造、全新性能启动子元件的人工智能设计与改造等将成为启动子工程研究的新方向与新前沿。本研究中，为了实现丙谷二肽的高效合成，需要对主要代谢途径及关键目标基因进行优化表达，鉴于此我们期望对核心启动子进行遗传改造，以实现基因转录水平的可控调节乃至表达强度的精细调控。
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启动子工程改造一般采用如下策略(图 2)：一是对目标基因自身的内源启动子进行理性改造(定点/饱和突变改造，或将启动子与特定的转录因子相结合)；另一种方式则是进行启动子替换，彻底改变目的基因的表达谱。在启动子突变方面，常用方法包括随机突变与定点突变等方式对启动子的 UP 区或间隔区进行随机突变，创制不同强度的启动子库，再结合高通量筛选方法获得优选的启动子，用于代谢工程中多基因的差异表达调控。在启动子的替换策略中，可供选用的启动子既可以是广泛应用的启动子(如 P43 启动子)；也可以通过报告基因表达的方式筛选获得目标启动子；还可以利用例如噬菌体启动子、人工构建的杂合启动子等外源启动子。此外，启动子改造研究也经常与核糖体结合位点 RBS 的序列优化相结合。
其次，代谢干扰可以根据需要调节基因转录和蛋白表达水平，进而优化代谢网络提高合成效率，在合成生物学领域具有广泛的应用。CRISPRi 技术是基于 RNA 引导的 DNA 核酸内切酶的Ⅱ型 CRISPR/Cas9 系统发展而来的一种实施代谢干扰的方法，与 CRISPR/Cas9 系统不同之处在于前者的 Cas9 蛋白失去了 DNA 核酸内切酶的活力 17, 18。CRISPRi 体系由 dCas9 蛋白和 sgRNA 两个组件构成：当成熟的 sgRNA 引导 dCas9 蛋白结合在 DNA 的特定位置时，三者形成的复合物能够影响转录延伸、RNA 聚合酶以及转录因子的结合，从而实现调节基因表达水平的目的。CRISPRi 技术具有灵活高效的特点，可以调控任意基因转录水平，已被高效地应用于代谢干扰领域，特别是在 B. subtilis 的代谢调节过程中具有广泛地应用 19-23。Han Yang 等利用CRISPRi 不仅鉴定出了 5-甲基四氢叶酸合成途径中的关键基因，而且成功实现其合成过程的代谢流分配 24。Yao-kang Wu 等通过将基于 CRISPRi 技术的 NOT 门结构与葡萄糖胺-6-磷酸传感器结合起来，成功构建了一种自动的双元调控系统(ADC)25，自动调节目的基因的表达水平、实现反馈调控代谢回路。因此，我们有理由相信，基于 CRISPRi 技术设计和构建性能优良的B. subtilis 底盘细胞生产活性肽具有重要的科学意义与应用价值。
随着中国对医疗卫生行业的重视程度加大以及老龄化现状的加剧, 近年来人们对于活性肽产品兴趣增大, 如何实现小分子肽类化合物的高效生物合成成为热点问题。本项目拟在前期研究的基础上，以具有自主知识产权的α-氨基酸酯酰基转移酶(pAET-7)为研究对象，探索SAET的底物识别机制及催化机制，通过理性分子改造提高其催化能力。其次，以枯草芽孢杆菌 BS168为底盘细胞，通过启动子工程设计 SAET 的高表达载体，并构建丙谷二肽生物合成途径。然后，利用 CRISPRi 技术探索与丙谷二肽中心代谢有关的 7 个关键基因转录水平的改变对其生物合成的影响。基于启动子优化精确调节丙谷二肽合成代谢网络, 使更多物质与能量流向该代谢途径, 进一步提高丙谷二肽合成效率。通过本项目的研究期望为枯草芽孢杆菌底盘细胞的理性设计、动态代谢工程研究及 α-氨基酸酯酰基转移酶的催化机制提供理论与实践基础。
参考文献
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26. 于慧敏，郑煜堃，杜岩; 等, 合成生物学研究中的微生物启动子工程策略. 合成生物学, 2021, 2 (4), 598-611. 
(I) 基于 CRISPRi 和启动子工程技术从分子水平上探索模式工业微生物枯草芽孢杆菌底盘细胞的理性设计、丙谷二肽基因线路构建与动态代谢工程调控，实现其生物合成反应的精准调控和过程优化控制，提高微生物细胞工厂的生产效率，这是本项目的主要特色。也使得本项目更加具有工业应用潜力，为实现重要活性肽功能营养品的工业化生产提供技术与理论支持。
(II) 本项目基于分子内通道效应，从 SAET 的结构角度出发，在充分探索和研究多结构因素与多催化性能参数之间相互关系的基础上，通过理性改造使 SAET 的多催化性能之间共同进化也是本研究另一大理论创新之处。 
技术路线：
本项目将主要按照以下方案对 pAET-7 进行底物识别机制及其功能强化的研究：
3.1.1 pAET-7 底物识别机制及催化机制研究。summernote-img
基于图3，利用已报道 AET 的晶体结构(PDB: 1MPX)为模板，通过 MODELLER 软件构建 pAET-7的同源模型，并进行优化。由于序列一致性较高，因此得到的同源模型具有极高的可信度，并以此模型作为本项目中的研究对象。
① 基于 CAVER3.0 软件及 NAMD 2.13 通过随机加速动力学模拟和拉伸动力学模拟对底物和产物在 pAET-7 内的迁移路径进行研究。计算模拟中采用不同的加速度和阈值来驱动底物/产物的传递，确定可能的通道。在此基础上，继续分析不同通道与蛋白质边缘的距离及通道的宽度，推测出最佳的转运通道。最后，通过对底物及产物的通过几率进行统计，进一步验证并确认该通道的合理性。
② 在此基础上，通过 QM/MM 组合方法进行蛋白-配体复合物的动力学模拟，在高能区域结合伞形采样技术，对底物/产物通过主要通道的能量性质进行了计算分析，获得相对自由能曲线。
③ 利用 CDOCKER 程序，将 L-Ala·OMe、L-Gln 对接到 pAET-7 的活性中心，获得酶-底物复合物结构。然后利用 QM/MM 方法，对配体在活性位点中的结合模式进行优化。以此为初始结构，对其进行 100 ns 分子动力学模拟，分析在转运过程中相关氨基酸的构象变化，探索起关键作用的氨基酸残基。
④ 使用 MM/PBSA 和 MM/GBSA 模型计算底物与酶的结合自由能并将结合自由能按残基进行分解。分析不同的作用力对残基分解结合自由能的贡献，确定不同氨基酸残基对底物结合的影响。
⑤ 通过上述的计算模拟，分析底物与产物在蛋白通道中的迁移机制，并鉴定出其中对底物/产物识别及转运起重要影响的氨基酸残基。通过定点突变及酶活变化进行验证，探索上述得到的氨基酸残基对 pAET-7 底物识别所起的作用，并获得底物特异性显著提高的蛋白酶。并通过 STD-NMR、圆二色谱、荧光光谱表征突变型二级和三级结构的变化情况。
3.1.2 枯草芽孢杆菌细胞工厂的构建及其代谢调控研究summernote-img
基于图4，本项目将主要按照以下方案对枯草芽孢杆菌细胞工厂的构建、代谢调控进行研究：
(1) 基于 BS168 构建丙谷二肽的生物合成途径。
① 利用 RBS Calculator 软件计算出不同强度的 RBS，然后基于使用寡核苷酸退火和金门克隆方法对 P43启动子进行强度改造，筛选出能够调控 SAET 基因表达强度的启动子组合，实现 SAET 的高效、异源、可溶性表达。
② 基于上述研究所获得功能强化的 SAET 蛋白酶突变体，通过重叠 PCR 的方法首先将其置于组成型强启动子 P43'的调控之下，构建 SAET 的表达载体 P43'- SAET。
③ 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑系统敲除质粒 pHY/Cas9，该敲除质粒包括 sgRNA、Cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌复制原点 p15A、温度敏感的复制原点 PE194、氨苄青霉素筛选标记基因和四环素筛选标记基因。通过设计不同的 sgRNA 序列和同源修复臂序列，分别将 P43'-SAET 整合到 BS168 染色体的氨肽酶 papA 和 mapA 位点。
④ 在此基础上，对启动子的 UP 区或间隔区进行改造，同时针对不同基因构建启动子组合文库，用于后续丙谷二肽合成代谢中多基因的差异化表达。通过上述的工作，可以实现丙谷二肽的生物合成途径的构建。
(2) 利用 CRISPRi 技术理性调节丙谷二肽合成途径中关键基因转录水平
① 构建 CRISPRi 基因编辑系统。基于(II)中得到的敲除质粒，首先将原始 Cas9 基因通过定点突变技术引入两个位点突变(D10A 和 H840A)。然后，通过限制性内切酶进行酶切、T4DNA 连接酶连接、转化得到最终质粒 pHY/dCas9。
② 设计不同的 N20 序列，得到分别靶向丙谷二肽生物合成过程中的 7 个关键酶基因的pHY/dCas9 质粒。利用 CRISPRi 技术探究上述几个基因转录和蛋白表达水平对丙谷二肽产量的影响，优化代谢网络，将代谢通量重定向于丙谷二肽合成。
③ 通过组合分析研究这 7 个基因不同的转录水平及 SAET 基因拷贝数对丙谷二肽生物合成的整体影响(生物量、谷氨酰胺/丙谷二肽产率、底物转化率等方面)，从而确定最佳的调控策略、构建更高效的枯草芽孢杆菌工程菌。
④ 在此基础上，基于上述工作中构建的启动子组合文库，通过启动子替换对丙谷二肽代谢途径中 7 个关键酶的表达进行差异化精准调控，实现代谢流的平衡，从而显著提高丙谷二肽的合成水平。
⑤ 通过多个组成型启动子同时表达多个 sgRNA，构建无质粒的工程菌，实现对多个基因的共同调控，提高其工业应用潜力。 
拟解决问题：
(I) 底物选择性是生物催化剂在工业生物催化中的一个关键指标，也是限制 SAET 产业化用的一个核心问题。从 SAET 结构因素出发，深入探索其催化机制，这是对 α-氨基酸酯酰基转移酶底物选择性进行有效改造的必要条件，也是理解蛋白质构效关系规律和选择性调控分子机制的基础科学问题。
(II) 由于细胞代谢网络的复杂性，外源途径基因的不平衡表达以及代谢途径的改造往往会影响宿主细胞的正常生长进而影响目的产物的最终产量，这也是合成生物学研究中的一个共性难题。如何在底盘细胞中动态调控代谢途径流向，实现丙谷二肽生物合成反应的精准调控，是对细胞代谢调控机制、构造智能化细胞工厂、实现精细代谢流调控的一个基础科学问题。 
 预期研究成果：
(I) 获得一种具有自主知识产权的、底物特异性与催化活性显著提高的 pAET-7突变体；
(II) 获得一株具有自主知识产权的、能够高效合成丙谷二肽的工程菌。
(III) 在国内外高水平学术刊物上发表
本项目的研究任务在 2025年 04月至 2027年 03 月两年内完成分阶段完成预定的目标，具体安排如下：
2025年04月至 2025年 11月：
利用 RBS Calculator 软件计算出不同强度的 RBS，然后基于使用寡核苷酸退火和金门克隆方法对 P43 启动子进行强度改造；筛选出能够调控 SAET 基因表达强度的不同序列组合，实现 SAET 的高效、异源、可溶性表达。计算机模拟底物分子进入 SAET 蛋白活性中心的路径，分析路径上可能对其发挥底物选择性具有显著影响的结构因素，并进行虚拟筛选。在此基础上，通过全质粒 PCR 构建突变蛋白库，检测突变体的底物选择性变化，对模拟结果进行验证，筛选得到选择性显著提高的 SAET突变体。
2025 年 12 月至 2026年 05 月：
通过重叠 PCR 的方法构建 pAET7 突变体的组成型表达载体，P43'- pAET7。在此基础上，同时针对不同的基因构建启动子组合文库，通过对丙谷二肽代谢途径中 7 个关键酶的表达进行组合调控，筛选出能够调控关键基因表达强度的不同启动子序列，控制碳通量的流向。基于 CRISPR/Cas9 系统，通过设计不同的 sgRNA 序列构建不同的整合质粒 pHY/Cas9，将 P43'- pAET7 基因整合到 BS168 染色体中氨肽酶 papA 和 mapA 位点，构建丙谷二肽生物合成细胞工厂。在此基础上，通过发酵优化验证丙谷二肽的生物合成能力。
2026年 06月至 2026 年 9月：
构建 CRISPRi 基因编辑系统，得到表达质粒 pHY/dCas9。设计不同的 N20 序列，得到分别靶向谷氨酰胺代谢过程中的 7 个关键酶基因的 pHY/dCas9 质粒。利用 CRISPRi 技术研究这7 个基因转录水平的改变对谷氨酰胺积累及宿主菌代谢情况的影响。
2026年 9月至 2026年 11月：
设计不同的 N20 序列，得到靶向 P43- pAET7 基因的 pHY/dCas9 质粒。基于 CRISPRi 技术，综合分析谷氨酰胺及丙谷二肽合成过程中这 7 个关键酶的转录水平对丙谷二肽产量的影响，确定最佳的调控策略。在此基础上将相应 sgRNA 模块整合在基因组上，构建无质粒的工程菌。
2026年 12月至 2027年 03月：
对得到的工程菌进行 5L 发酵罐发酵实验，通过发酵条件的优化确定最佳的工艺参数，为其进一步的应用奠定基础。最后，总结项目研究成果，撰写研究报告，准备结题验收。 
1.1 L-氨基酸连接酶在丙谷二肽生物合成中的应用研究
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申请人在之前新药研发过程中，得到一株具有高效抗真菌活性的解淀粉芽孢杆菌。全基因组测序及序列比对获得了一种新型的 L-氨基酸连接酶 BaLal_16 的基因序列，并通过密码子优化在大肠杆菌 BL21(DE3)中实现异源表达。在此基础上，分析 BaLal_16 蛋白内部可能存在的疏水性通道，最终确认三条途径为底物与产物最有可能的转运通道。通过分析通道 5，发现该通道入口是由 G14，G311，E273，F271，S184，S185，A183，E109 所组成的疏水区域。其中高保守氨基酸残基 E109 参与底物识别的过程，其构象的变化能够允许大分子量的不带电氨基酸进入该底物的转运通道。而在该通道入口上方的位置有三个氨基酸 L12，N108 和L110，由这三个氨基酸所形成的疏水区域会进一步压缩该通道入口的大小，并改变了通道入口的延伸方向，进而会进一步影响所能进入通道的底物种类。因此，推断通过微调氨基酸 N108与 L110 的大小，改变通道入口的尺寸，进而可以使 Gln 更加顺利的进入通道内部(图 5)。
基于此，分别将 N108 突变为体积更大的 Phe，将 L110 突变成体积更大的 Phe 或者 Tyr，构建单突变体 N108F，L110F，L110Y 及双突变体 NFLY。酶学实验表明，单突变 L110Y 及双突变体 NFLY 的催化活力得到了显著提升，其中 NFLY的酶活力提高了 1.87 倍，为 232.4 ±17.4 U·(mg·h)-1，这表明其对底物 Gln 的选择性得到了提高,其合成丙谷二肽的酶活力较野生型提高了 4.06 倍。在此基础上，我们以大肠杆菌 W3110为底盘细胞，利该突变体为催化酶，构建了大肠杆菌工程菌 W3110/AG。结果表明（图6），在底物浓度丙氨酸 150 mmol/L、谷氨酰胺 150 mM/L，当发酵 26 h 后，丙谷二肽的产量达到 121.2mM, 时空产率达到 4.66 mM/h, 摩尔转化率 80.8%。
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在此基础上，我们以金属有机沸石咪唑骨架结构(ZIF-8)将过表达 BaLal_16 蛋白及多聚磷酸激酶的大肠杆菌固定在其三维纳米孔道中，构建了高效的固定化细胞催化剂 BP@ZIF-8(图 7)。
该催化剂不仅具有较高的催化活性，而且具有良好的热稳定性和可利用性 (图 8)，实现了高效的丙谷二肽催化能力及高效的 ATP 循环再生能力。相较于原始的 BaLal_16，虽然该途径的合成效率有了大幅的提高，但是其丙谷二肽合成能力仍比较低，需要进一步探索更佳的丙谷二肽生物合成途径。另外，大肠杆菌作为一种最简单的模式细胞虽然在生物合成领域具有十分广泛的应用，但是通过我们前期研究发现其特殊的代谢调控模式，将会限制其丙谷二肽的生产能力。因此在后续的研究中，选择合适的宿主菌对于丙谷二肽的生物合成具有十分重要的意义。 
1.2 α-脂酰基转移酶在丙谷二肽生物合成中的应用初探
申请人团队一直致力于活性肽的生物合成研究，特别是丙谷二肽的生物合成技术的改进研究。除了 L-氨基酸连接酶外，团队成员成功获得一种新型的 α-脂酰基转移酶，并初步考察了其在小分子肽类化合物生物合成中的应用。
1.2.1 pAET-7 酶学性质表征及其应用初探summernote-img
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针对来源于 AG_720 的 α-脂酰基转移酶 pAET-7 的基因序列进行了密码子优化，并克隆到不同的载体中，最终筛选出大肠杆菌 BL21(DE3) 作为表达宿主，pET28(a)并作表达载体，过表达 pAET-7(图 9(1,2))。pAET-7 的核苷酸序列由 1860 bp 个编码，619 个氨基酸组成，蛋白分子量约为 115 kDa，SDS-PAGE 电泳结果为 68 kDa，可知与 SAET 一样都是由两个亚基组成。
在此基础上，对其表达条件进行了优化，通过 Ni-NTA 亲和层析法分离纯化重组蛋白(图9(3))，并对其酶学性质、催化应用进行了研究。适合酶表达的诱导条件：温度 20 ℃，诱导时机(OD600=2.0)，IPTG 浓度 0.5 mmol/L，诱导时间 10 h。pAET-7 的最适反应温度 27 ℃，最适pH 8.5，最佳反应条件下的最大比活力达到 1215 U/mg。在催化合成 Ala-Gln 过程中，pAET-7对底物 Ala·OMe 和 Gln 的 Km 值分别为 23.3 mM 和 15.9 mM。同时发现与文献报道类似低浓度的 Co2+及 EDTA 对 pAET-7 催化活力具有促进作用。
在此基础上，考察了谷氨酰胺和丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度对 Ala-Gln 产量的影响，发现随着底物浓度的提高 Ala-Gln 产量也呈现提高的趋势，这表明高浓度的底物不会抑制 pAET-7的催化活性(图 10)，但是在催化过程中同时检测到了相对较高浓度的 Ala-Ala (22 mM) 及少量的 Gln-Gln(~1.5 mM)、Ala-Ala-Gln 及 Ala-Ala-Ala。因此，在后续的研究中需要进一步的详细考察 pAET-7 的底物特异性及其底物识别机理，提高其底物特异性。
1.2.2 定点突变 pAET-7 对其酶学性质的影响
为了降低副产物的浓度，提高其底物特异性，目前团队正在进行 pAET-7 催化机制的研究。首先，利用计算机模拟 L-Ala 和 L-Gln 在底物结合口袋中与靶酶的相互作用方式，探索其中对底物识别有重要影响的关键结构因素(图 11)。在此基础上通过定点突变，验证这些鉴定出的结构因素对 L-Ala 和 L-Gln 的选择性影响 (部分结果如图 12 所示)。通过预实验发现，对特定氨基酸进行改造可以显著地改变 pAET-7 对底物的选择性，但是这种现象背后的普遍性原理需要进一步探索，这将为理性改造 pAET-7 提供理论与应用基础。
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申请人所在单位建有 10 个省级重点实验室，能够满足细胞生物学、分子生物学、生物化学和结构生物学等相关学科的实验要求。学校公共科研平台配套设施齐全、功能完善，具备从事分子生物学、生物化工等相关研究的必备仪器，能够满足本项目分子改造pAET-7的研究、细胞工厂的构建及微生物发酵方面的研究工作。
综上所述，申请人现有的工作条件能够满足本项目的顺利进行。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 16000.00 4000.00
1. 业务费 6000.00 无 6000.00 0.00
（1）计算、分析、测试费 2500.00 无 2500.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 500.00 无 500.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 无 3000.00 0.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 14000.00 无 10000.00 4000.00
结束

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