鬼箭羽降低T1DM小鼠血糖作用及机制研究

申报人：赵锦涛申报日期：2025-03-15

基本情况

所属批次:

2025创新项目

项目名称:

鬼箭羽降低T1DM小鼠血糖作用及机制研究学生申报

项目类型:

创新训练项目

所属学科门类:

医学

所属专业类:

中药学类

项目来源名称:

学生来源于教师科研项目选题

项目归属学院:

项目期限:

二年期

项目简介:

1型糖尿病（T1DM）作为一种与自身免疫相关的疾病，发病率逐年提升，需要终身外源性胰岛素治疗。更迫切的是，患病者多为15岁以下儿童，给其家庭和社会造成了极大负担。因此，探索新的治疗方法提高患儿一生的生活质量显得尤为重要。β细胞衰竭作为T1DM发生和发展的关键驱动因素，涉及多种生物过程，如遗传易感性、内质网应激、氧化应激、胰岛炎症等，大量实验和临床研究表明，通过抑制β细胞凋亡干扰β细胞衰竭为战胜糖尿病提供了一种有前景的方法。鬼箭羽现代研究已证实其在2型糖尿病降血糖方面的潜力，而我们在临床实践中发现其对T1DM也具有显著的降糖效果。所以本项目利用网络药理学与分子对接等技术对鬼箭羽治疗T1DM靶点进行预测，通过细胞和在体实验，重点研究鬼箭羽降低糖尿病小鼠血糖与小鼠体内炎症、胰岛β细胞凋亡的相关性，阐明鬼箭羽治疗1型糖尿病的可能分子机制，为T1DM开发安全有效的治疗药物提供实验依据。

负责人曾经参与科研的情况:

负责人自本科二年级起加入导师科研团队，接受系统性科研培养，深入学习药理学理论知识，精读大量中英文文献，为科研工作打下坚实理论基础。在实验操作层面，不仅熟练掌握网络药理学及分子对接分析技术，还精通小鼠实验流程，包括皮下注射、腹腔注射、灌胃给药以及取材等标准化实验操作。在课题研究中，负责人在导师指导下通过网络药理学、分子对接预测与动物实验验证相结合的方式，探究鬼箭羽降糖机制，并撰写“鬼箭羽降低T1DM小鼠血糖作用及机制研究”课题。

指导教师承担科研课题情况:

无

指导教师对本项目的支持情况:

指导老师在项目发展的重要节点给予团队成员指导与帮助，提出多条建议及整改意见；同时对项目中涉及的实验方案的制定、实验方法的操作以及申报书的撰写等给予详细指导，并指导团队成员进行结果整理与成果转化。

项目级别:

省级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	赵锦涛	药学院	药学（本科）	2023	文献调研，设计实验流程，实验开展，结果整理，文章发表，项目结题	第一主持人
2	刘佳欣	药学院	中药学（本科）	2024	实验开展，结果整理	成员
3	萧雅文	药学院	中药学（3+4贯通培养）	2023	实验开展，数据统计	成员
4	王文慧	药学院	中药学（本科）	2024	结果整理	成员

指导教师

序号	教师姓名	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	孙锦	药学院	否	第一指导教师
2	郑珊	药学院	否	指导教师

立项依据

研究目的:

本项目基于网络药理学与分子对接结果，通过细胞和在体实验，重点研究鬼箭羽降低糖尿病小鼠血糖与小鼠体内炎症、胰岛β细胞凋亡的相关性，阐明鬼箭羽治疗1型糖尿病的可能分子机制，为治疗1型糖尿病开发安全有效的新药提供实验依据。

研究内容:

1.通过鬼箭羽对STZ诱导T1DM改善的药效学研究，评估鬼箭羽对T1DM小鼠的治疗作用

a.建立STZ诱导T1DM小鼠模型，将小鼠随机分为对照组（CON）、模型组（T1DM）、地特胰岛素组[INS 0.1 IU/（kg·d）]、鬼箭羽低剂量组[GJY-L 2 g/（kg·d）]、鬼箭羽中剂量组[GJY-M 4 g/（kg·d）]、鬼箭羽高剂量组[GJY-M 8 g/（kg·d）]，造模成功后开始给药，每天给药一次，连续给药6周，CON组与T1DM组给予相同体积蒸馏水；b.血糖仪监测空腹血糖；离子交换色谱法（HPLC）检测糖化血红蛋白；c.糖耐量试验（OGTT）检测小鼠机体对血糖的调节能力；d.HE染色观察胰腺病理损伤；明确鬼箭羽降低T1DM小鼠血糖及改善T1DM小鼠胰腺病理损伤的作用。

2.采用网络药理学、分子对接技术预测鬼箭羽治疗T1DM的潜在靶点和相关通路，明确鬼箭羽发挥作用的可能有效成分和机制。

a.使用TCMSP数据库和UniProt数据库筛选鬼箭羽活性成分以及相应靶点，通过

GeneCards数据库获得疾病相应靶点；b.使用STRING数据库构建交集靶点PPI网络图，获得PPI网络拓扑图，筛选关键靶点；c.通过David数据库进行GO和KEGG通路富集分析；d.选取PPI网络中靶点及与活性成分进行分子对接，筛选蛋白靶点并进行可视化处理。

3.研究鬼箭羽对STZ诱导T1DM小鼠胰岛β细胞凋亡及线粒体功能的影响，明确其发挥作用的机制

a.IAA/GADA免疫荧光双染检测胰岛β细胞功能；电镜切片观察胰岛β细胞损伤情况；b.线粒体膜电位（JC-1）及ATP水平检测细胞线粒体功能；c.通过活性氧（ROS）检测试剂盒、线粒体超氧化物指示剂（Mito Sox Red）、炎症因子（IL-1β、TNF-α）检测试剂盒检测体内氧化应激水平和炎症因子水平；d.采用TUNEL/Insulin双染检测胰岛β细胞凋亡程度；通过Western blot对PTGS2、TP53、BCL-2、caspase-3、AKT等与炎症和细胞凋亡相关蛋白进行验证，并对其机制进行研究。阐明鬼箭羽通过线粒体途径抑制胰岛β细胞凋亡，降低血糖发挥治疗T1DM的作用。

4.研究鬼箭羽中主要活性成分槲皮素、β谷甾醇和山奈酚对小鼠胰岛β细胞（MIN6）损伤的保护作用，并通过泛caspase抑制剂（Z-DEVD-FMK）的加入确定该鬼箭羽中主要成分抑制β细胞凋亡是否通过caspase途径实现

a.STZ处理MIN6细胞24小时建立细胞损伤模型，在STZ处理的基础上，加入不同浓度的槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚分别进行处理；b.通过检测细胞活力（CCK-8实验）、胰岛素分泌（ELISA法）、细胞凋亡（如Annexin V-FITC/PI双染法）等指标，评估鬼箭羽对STZ损伤胰岛β细胞的影响；c.通过Western blot对PTGS2、TP53、BCL-2、caspase-3、AKT等与炎症和细胞凋亡相关蛋白进行检测。通过泛caspase抑制剂（Z-DEVD-FMK）的加入确定该鬼箭羽中主要成分抑制β细胞凋亡是否通过caspase途径实现。

5.统计分析

实验结果采用SPSS 23.0软件进行数据分析。统计结果以均值±标准差（Mean±SEM）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。进行方差齐性检验，方差齐采用LSD检验法，方差不齐采用Dunnetts T3检验法。P<0.05为具有统计学意义。

国、内外研究现状和发展动态:

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种严重的慢性内分泌系统疾病，其特征是高血糖，导致多种并发症，包括糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和心脑血管疾病等。

根据其病因，主要分为1型糖尿病（type1 diabetes mellitus，T1DM）和2型糖尿病（type2 diabetes mellitus，T2DM）。T1DM作为一种由自身免疫性破坏介导的β细胞衰竭引起的疾病，发病率逐年提升^[1]，需要终身外源性胰岛素治疗^[2]，但是，外源性胰岛素注射和口服降糖药物只能缓解高血糖症状，减轻糖尿病并发症的发生，无法防止β细胞的缺失和功能的逐渐下降。胰腺或胰岛移植为糖尿病提供了一种有前景的治疗方法，然而，免疫排斥、手术挑战、供体－受体（D-R）匹配问题和供体短缺限制了其临床应用^[3][4]。更迫切的是，患病者多为15岁以下儿童，给其家庭和社会造成了极大负担。因此，探索新的治疗方法提高患儿一生的生活质量显得尤为重要。

β细胞衰竭作为T1DM发生和发展的关键驱动因素，涉及多种生物过程，如遗传易感性、内质网（Endoplasmic reticulum，ER）应激、氧化应激、胰岛炎症等^[5]，大量实验和临床研究表明，通过抑制β细胞凋亡干扰β细胞衰竭为战胜糖尿病提供了一种有前景的方法。在T1DM中胰岛β细胞的凋亡主要分为内源性和外源性2种形式。内源性凋亡，即通过线粒体途径的细胞凋亡，是在多种微环境干扰下，如线粒体DNA（mtDNA）损伤、氧化应激、生长因子缺失、ER应激、缺氧等多种条件下，激活BCL-2家族蛋白进而发生的一种凋亡途径。外源性细胞凋亡则主要通过激活肿瘤坏死因子超家族的细胞因子介导。caspase-3的激活可由内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径共同调节，是细胞凋亡过程中的关键执行蛋白酶，其激活后可裂解多种细胞内底物，导致细胞结构和功能的破坏，最终使细胞发生凋亡。在胰岛β细胞中，线粒体参与葡萄糖代谢和胰岛素分泌，同时产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）和释放细胞色素C（cytochrome C,cyt C）来调节细胞凋亡^[6][7]。TP53蛋白是DNA损伤的一个分子传感器，已证实BCL-2能抑制TP53介导的凋亡。研究发现，炎症诱导的β细胞死亡也需要胰岛免疫细胞的参与。长期暴露于IL-1β、TNF-α等炎症因子会抑制Ca²⁺-ATP酶（肌内质网Ca²⁺-ATPase），耗尽ER钙库，损害胰岛β细胞，诱导胰岛β细胞凋亡，导致胰岛素分泌受损^[8]。

中药作为一个巨大的宝库，不仅拥有丰富的药物资源，而且在治疗机制、个性化治疗、安全性、疾病预防、慢性病治疗、免疫调节等方面具有独特的优势和特点。鬼箭羽始载于《神农本草经》，现代研究已证实其在2型糖尿病降血糖方面的潜力^[9]。而我们在临床实践中发现其对1型糖尿病也具有显著的降糖效果，但中药往往因为多成分发挥作用，存在药物作用机制不明确、炎症反应不确定和代谢应激过度等问题。因此，进一步探索并阐明中药防治疾病的作用机制，开发高效、低细胞毒性的新药势在必行^[10]。

本项目前期基于网络药理学与分子对接结果发现，鬼箭羽中主要成分槲皮素、β-醇与山奈酚通过作用于PTGS2、BCL-2、CASP3、PI3K、TNF、IL-1β等多个关键基因，调控炎症、细胞凋亡等关键生物学过程，推测鬼箭羽降低T1DM小鼠血糖可能与鬼箭羽抑制胰岛炎症及胰岛β细胞凋亡密切相关。因此，本项目基于网络药理学与分子对接结果，通过细胞和在体实验，重点研究鬼箭羽降低糖尿病小鼠血糖与小鼠体内炎症、胰岛β细胞凋亡的相关性，阐明鬼箭羽治疗1型糖尿病的可能分子机制，为治疗1型糖尿病开发高效、低细胞毒性的新药提供实验依据。

[参考文献]

[1]Yang KJ,Yang X,Jin CY et al.Global burden of type 1 diabetes in adults aged 65 years and older, 1990-2019:population based study[J].The British Medical Journal,2024,385:e078432.

[2]Eizirik DL, Pasquali L, Cnop M.Pancreatic beta-cells in type 1 and type 2 diabetes mellitus:different pathways to failure[J].Nature Reviews Endocrinology,2020;16(7):349–362.

[3]Subramanian S,Khan F,Hirsch I B.New advances in type 1 diabetes[J].The British Medical Journal,2024,384:e075681.

[4]Iacobucci G.Artificial pancreases for type 1 diabetes:Better access is "watershed moment"-but delivery is key[J].The British Medical Journal,2024,384:q102.

[5]Niu FL,Liu WX,Ren YY et al.β-cell neogenesis:A rising star to rescue diabetes mellitus[J].Journal of Advanced Research,2024,62:71-89.

[6]Chen J, Stimpson SE, Fernandez-Bueno GA et al.Mitochondrial reactive oxygen species and type 1 diabetes[J].Antioxidants & Redox Signaling,2018,29(14):1361-1372.

[7]Las G, Oliveira MF, Shirihai OS.Emerging roles of beta-cell mitochondria in type-2-diabetes[J].Molecular Aspects of Medicine,2020,71:100843.

[8]Szymczak F, Colli ML, Mamula MJ et al.Gene expression signatures of target tissues in type 1 diabetes,lupus erythematosus,multiple sclerosis,and rheumatoid arthritis[J].Science Advances,2021,7(2):eabd7600.

[9]郭延秀,席少阳,马毅等.鬼箭羽化学成分及药理活性研究进展[J].中国现代应用药学,2021,38(18):2305-2316.

[10]张晓宇,冷锦红.1型糖尿病胰岛β细胞不同死亡方式的研究进展[J].疑难病杂志,2020,19(11):1170-1173.

创新点与项目特色:

本项目基于临床疗效，通过网络药理学与分子对接对鬼箭羽降低1型糖尿病患者血糖的可能机制进行预测，通过细胞和在体实验，重点研究鬼箭羽降低糖尿病小鼠血糖与小鼠体内炎症、内质网-线粒体相互作用、线粒体功能紊乱及β细胞凋亡的相关性，阐明鬼箭羽治疗1型糖尿病的可能分子机制，为治疗1型糖尿病开发安全高效的新药提供实验依据。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

1.技术路线

图1.技术路线图

2.拟解决的问题

通过本项目研究，证实鬼箭羽对1型糖尿病的药效，阐明鬼箭羽治疗1型糖尿病的可能分子机制，为治疗1型糖尿病开发安全有效的新药提供实验依据。

3.预期成果

阐明鬼箭羽治疗1型糖尿病的可能分子机制。

在国内外专业期刊发表学术论文1篇。

项目研究进度安排:

2025.5-2025.11：根据研究内容明确详细的研究方案；采用网络药理学、分子对接、分子动力学模拟等生物信息学方法，对鬼箭羽治疗1型糖尿病的疾病靶点和相关通路进行预测分析。

2025.12-2026.1：实验方案的完善，准备相关实验材料；建立STZ诱导1型糖尿病小鼠模型。预实验以确定最佳药物干预浓度。

2026.2-2026.11：对鬼箭羽降低T1DM小鼠血糖效果进行评价，观察各组小鼠一般情况，并进行相关指标检测。进一步补充完善实验，总结分析实验数据。

2026.12-2027.6：撰写论文，完成结题报告。

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

（1）动物实验结果

①成功建立STZ诱导TIDM小鼠模型，对小鼠体重和空腹血糖进行监测，鬼箭羽提取液能有效缓解T1DM小鼠体重降低，并能降低T1DM小鼠空腹血糖；与阳性药胰岛素相比，鬼箭羽给药能够降低小鼠血糖波动，降低死亡率，结果如图2所示。

图2 鬼箭羽提取物对T1DM小鼠生存率、血糖、体重的影响（Mean±SEM,n=11）

注：A.小鼠生存率，B.小鼠血糖，C.小鼠体重，与CON相比：^**P<0.01；与T1DM相比：^#P<0.05。

②鬼箭羽提取液能改善T1DM小鼠胰腺组织形态，给药后T1DM小鼠胰岛细胞萎缩程度减轻，细胞空泡变性减少，炎性细胞浸润程度减轻，结果如图3所示。

图3 鬼箭羽对T1DM小鼠胰腺病理形态的影响（×100）

（2）网络药理学和分子对接实验结果

①以“鬼箭羽”为关键词检索相关文献及TCMSP数据库，共得到8种满足条件的鬼箭羽活性成分及373个相关靶点，其中作用靶点数目最多的活性成分为槲皮素，共233个靶点，结果见表1。

表1鬼箭羽主要活性成分数据信息

②以“Type 1Diabetes Mellitus”为关键词检索GeneCards数据库，通过检索，共获得与T1DM相关的疾病靶点14106个。基于上述药物成分靶点信息和疾病靶点信息，得到334个交集靶点，结果如图4所示。

图4. 鬼箭羽与T1DM靶点维恩图

③通过Cytoscape 3.10.0软件对“成分－靶点”关系进行可视化，可直观得出鬼箭羽主要成分和作用靶点之间的网络关系，结果如图5所示。橙色圆圈为活性成分，黄色方块为药物疾病共同靶点，活性成分的节点越大，表明其相关联靶点数量越多。

图5鬼箭羽的“成分－靶点”网络

④将鬼箭羽主要活性成分和T1DM的交集靶点上传至STRING数据库，构建蛋白与蛋白相互作用关系网络图（PPI），结果如图6所示。经计算，PPI网络中有332个作用节点、6899条相互作用连线，越靠近中心节点度值越高。根据分析结果，筛选度值>97的关键靶点29个，通过Cytoscape3.10.3软件进行拓扑分析。关键靶点蛋白质互作拓扑图由29个节点、404条边组成，颜色越深，节点越大，其互作能力越强，互作能力前十的靶点为AKT1、TNF、TP53、IL1B、EGFR、CASP3、MYC、ESR1、SRC、BCL2，结果如图5所示。

图6“鬼箭羽-疾病”靶点相互作用网络

⑤GO富集分析得到980个生物过程、123个细胞组成、320个分子功能。按P值升序排列，筛选GO富集分析前10项，KEGG富集分析前20项，创建气泡图对数据进行可视化，结果如图7所示。结果显示，BP前10项条目主要涉及凋亡调控、基因表达调控、细胞对外界的响应生物过程。前10项CC条目主要有Cytoplasm（细胞质）、nucleoplasm（核浆）、cytosol（胞液）、extracellular space（胞外间隙）等。前10项MF条目主要涉及enzyme binding（酶结合）、identical protein binding（相同蛋白结合）、ubiquitin protein ligase binding（泛素蛋白连接酶结合）等。KEGG前20项通路主要涉及凋亡（Apoptosis）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病AGE-RAGE信号通路）、Lipid and atherosclerosis（脂质和动脉粥样硬化）、IL-17 signaling pathway（IL-17信号通路）、TNF signaling pathway（肿瘤坏死因子信号通路）等。通过调控这些信号通路，鬼箭羽可能实现其降低T1DM小鼠血糖的作用，并在一定程度上改善相关并发症。

图7 GO和KEGG富集分析

注：A.GO生物过程富集分析；B.GO分子功能富集分析；C.GO细胞组成富集分析；D.KEGG通路富集分析。气泡颜色表示P值强度，气泡大小表示基因数目。

⑥分子对接是用于探究有效成分与蛋白靶点的相互作用。通常情况下，对接能量值<-4.2500 kcal·mol-1表示存在一定的结合活性；<-5.0000 kcal·mol-1则表示具有较好的结合活性，而<-7.0000 kcal·mol-1则表示具有强烈的结合活性。经度值排序，前十二的靶点依次为AKT1、TNF、TP53、IL1B、EGFR、CASP3、MYC、ESR1、SRC、BCL2、HIF1A、PTGS2，前三的活性成分依次为MOL000098(quercetin)、MOL000422(kaempferol)、MOL005100(5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one)。使用MOE2019软件将所选受体与配体进行分子对接后，共得到36组对接结果。其中结合能<-5.0000 kcal·mol-1的有25组，结合能<-6.0000 kcal·mol-1的有8组，结合能<-7.0000 kcal·mol-1的有1组，详细数据见表2及图8、图9。

图8 分子对接结合能

表2分子对接结合能

图9 分子对接结果

注：A.MOL005100与EGFR(PDB:8a27)的结合构象(-7.4190)；B.MOL000098与EGFR(PDB:8a27)的结合构象(-6.9676)；C.MOL005100与PTGS2(PDB:5f19)的结合构象(-6.8795)；D.MOL000098与PTGS2(PDB:5f19)的结合构象(-6.7141)。

以上结果发现，鬼箭羽中主要成分槲皮素、β-谷甾醇与山奈酚通过作用于PTGS2、BCL2、CASP3、PI3K、TNF、IL-1β等多个关键基因，调控炎症、细胞凋亡等关键生物学过程，推测鬼箭羽降低T1DM小鼠血糖可能与鬼箭羽抑制胰岛炎症及胰岛β细胞凋亡密切相关。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

①已具备的条件：

前期准备：通过指导教师的指点，项目组成员已经对实验方案所涉及的实验仪器、实验试剂及耗材等有了详细地了解。同时，掌握了STZ诱导1型糖尿病小鼠模型的造模方法以及对鬼箭羽的提取方法。项目前期在老师的指导下，深入学习了1型糖尿病的病因、临床表现、国内外研究进展等理论知识。

硬件条件：实验室仪器完备，拥有细胞房及SPF级动物房，能够保证各项实验的顺利开展。

②尚缺少的条件：目前对于部分实验方法的操作原理、操作步骤等还存在一定的盲区；对于实验方案的具体细节还有待于进一步的完善细化。

③解决方法：通过查阅文献等方法，学习各实验方法的原理、操作步骤及具体注意事项；通过阅读文献、毕业论文等，对各部分研究内容的实验方案进行进一步完善。

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	20000.00	无	10200.00	9800.00
1. 业务费	4800.00	无	2400.00	2400.00
（1）计算、分析、测试费	800.00	无	600.00	200.00
（2）能源动力费	800.00	无	800.00	0.00
（3）会议、差旅费	400.00	办公用品	200.00	200.00
（4）文献检索费	800.00	查阅相关资料	800.00	0.00
（5）论文出版费	2000.00	用于论文出版	0.00	2000.00
2. 仪器设备购置费	6000.00	实验仪器购买	3200.00	2800.00
3. 实验装置试制费	1200.00	无	600.00	600.00
4. 材料费	8000.00	试剂、动物购买	4000.00	4000.00

结束

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