1.探索活血川归剂通过 PGC-1α/ Sirt3 通路对于心梗线粒体损伤的影响。

  2.研究活血川归剂对心肌梗死致心肌纤维化的保护机制。

  1.活血川归剂通过PGC-1α/ Sirt3通路，上调PGC-1α和Sirt3，修复线粒体功能障碍，降低线粒体耗氧率，稳定线粒体膜电位，改善线粒体能量代谢，维持钙稳定，减少ROS产生，降低线粒体自噬水平，进而减轻心肌损伤。在心肌细胞缺血时，活血川归剂能够减少细胞自噬的启动，修复受损的细胞器和蛋白聚集体，为细胞代谢提供营养物质，维持细胞内环境稳态，改善心脏收缩舒张功能，下调促凋亡蛋白 Bax 和上调抗凋亡蛋白 Bcl-2表达，抑制细胞凋亡，进而减轻心肌纤维化。

  2.中药活血川归剂能够起到活血化瘀的作用，通过促进血液循环，改善心肌微循环，使心肌梗死后局部心肌瘀血得以通畅，减少因瘀血导致的心肌细胞损伤，为心肌细胞的修复创造良好的血液供应环境，从而在一定程度上阻止心肌纤维化的进程。

  实验过程

  动物实验

  动物分组：由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供实验小鼠50只（昆明小鼠），体重28-32ɡ，鼠龄2-3个月，雌雄不限。共分假手术组，模型组，活血川归剂低剂量组，活血川归剂中剂量组，活血川归剂高剂量组5组，每组10只。

  模型制备：结扎心脏左前降支建立心梗模型。全部小鼠造模完成后，进行灌胃。给药方式如下：

  指标检测：

  ①小鼠心脏胫骨比。

  ②B超：左心室收缩末期内径（LVIDS）、左心室舒张末期内径（LVIDD）、射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）。

  ③病理切片：HE、MASSON、天狼猩红染色。

  ④血生化：丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）。

  ⑤WB：检测 PGC1-α 、Sirt3 、AKT、BCL-2 、BAX 、SMAD表达。

  ⑥PCR：检测PGC1-α ，Sirt3 ，SMAD ，TGF-β。

  ⑦免疫荧光：CD31、α-SMA。

  ⑧观察线粒体超微结构：脱水处理、浸泡与包埋、用Leica超薄切片机制备超薄标本。醋酸铀和硝酸铅进行双重染色（醋酸铀染色：将载有切片的铜网置于醋酸铀饱和水溶液中染色 15 - 30 分钟，之后用双蒸水冲洗 3 - 5 次，每次 1 - 2 分钟，去除多余染液。硝酸铅染色：将经醋酸铀染色后的铜网置于硝酸铅溶液中染色 5 - 10 分钟，接着用双蒸水冲洗 3 - 5 次，每次 1 - 2 分钟，彻底洗净染液。染色后的切片自然晾干或用滤纸吸干水分），然后用H7500（Olympus）透射电子显微镜采集图片，观察活血川归剂干预后线粒体超微结构的改变。

  ⑨心肌组织线粒体耗氧率测定：利用海马生物能量测定仪来完成。OCR可用molO2/ min/ μg线粒体蛋白来表示，测定结束后根据仪器自带软件进行分析。

  ⑩心肌组织线粒体膜电位测定：利用线粒体膜电位检测试剂盒纯化线粒体测定方法，冰冻切片线粒体膜电位测定。

  ⑪心肌组织线粒体总钙测定：利用RT - PCR法检测肌浆网Ca²⁺ - ATP酶mRNA相对表达量。

  ⑫心肌组织ATP含量测定：利用Molecular Probes™ ATP含量测定试剂盒进行检测---将心肌组织在预冷的匀浆缓冲液中进行匀浆处理，以破碎细胞释放 ATP。然后离心处理取上清液，根据试剂盒提供的 ATP 标准品，用试剂盒中的稀释液将其稀释成一系列不同浓度的标准溶液，加样至 96 孔板，添加检测试剂进行反应与检测，最后根据 ATP 标准品的浓度和对应的荧光强度或发光强度，绘制标准曲线，获得结果。

  细胞实验

  分离乳鼠心肌细胞并培养：从1-3天的新生C57BL/6小鼠心脏中分离心肌细胞（CMs)诱导缺氧损伤模型。剪掉双侧心耳及心房组织，将心室组织转入PBS玻璃皿中，将心肌组织剪碎成小米粒大小的组织块（约1mm2),加入1%I型胶原酶5ml，吹打混匀后，置于37℃水浴中消化。然后加入含10%FBS的DMEM培养液终止消化。离心弃上清液，加入培养基轻悬细胞。用含10%FBS的DMEM培养液（低糖DMEM，-谷氨酰胺300mg/l加双抗100U/ml)。将细胞团块吹打混匀。调整细胞浓度后，加入溴脱氧鸟苷(BrdU)，使其终溶液为0.1mmol/L。将细胞悬液接种于6孔板中，37℃孵箱培养90min后，差速贴壁去除成纤维细胞。48小时后换液。

  建立细胞水平缺氧损伤模型: 原代乳鼠心肌细胞培养3天左右，将培养液换成无糖无血清培养液，置于缺氧孵箱（94%N2+5%CO2+1%O2,37℃)缺氧处理24h，完成心肌细胞缺氧过程。

  细胞质粒转染： 20μg冻干粉状Sirt3 shRNA 质粒加入200uμl去离子水，配成0.1μg/μl转染质粒。质粒转染过程利用QIAGEN公司的Effectene Transfection Reagent 质粒转染试剂盒，进行心肌细胞Sirt3基因沉默效率检测。

  实验分组： 根据是否进行缺氧处理，将心肌细胞随机分为正常对照组，缺氧去血清组（H/SD）、缺氧去血清组（H/SD)+活血川归剂低剂量组，缺氧去血清组（H/SD)+活血川归剂中剂量组，缺氧去血清组（H/SD)+活血川归剂高剂量组。

  指标检测：

  ①WB：检测 PGC1-α 、Sirt3 、AKT、BCL-2 、BAX 、SMAD表达。

  ②PCR：检测PGC1-α ，Sirt3 ，SMAD ，TGF-β。

  ③免疫荧光：CD31、α-SMA。

  ④观察线粒体超微结构：脱水处理、浸泡与包埋、用Leica超薄切片机制备超薄标本。醋酸铀和硝酸铅进行双重染色（醋酸铀染色：将载有切片的铜网置于醋酸铀饱和水溶液中染色 15 - 30 分钟，之后用双蒸水冲洗 3 - 5 次，每次 1 - 2 分钟，去除多余染液。硝酸铅染色：将经醋酸铀染色后的铜网置于硝酸铅溶液中染色 5 - 10 分钟，接着用双蒸水冲洗 3 - 5 次，每次 1 - 2 分钟，彻底洗净染液。染色后的切片自然晾干或用滤纸吸干水分。），然后用H7500（Olympus）透射电子显微镜采集图片，观察活血川归剂干预后线粒体超微结构的改变。

  ⑤心肌组织线粒体耗氧率测定：利用海马生物能量测定仪来完成。OCR可用molO2/ min/μg线粒体蛋白来表示，测定结束后根据仪器自带软件进行分析。

  ⑥心肌组织线粒体膜电位测定：利用线粒体膜电位检测试剂盒纯化线粒体测定方法，冰冻切片线粒体膜电位测定。

  ⑦心肌组织线粒体总钙测定：利用RT - PCR法检测肌浆网Ca²⁺ - ATP酶mRNA相对表达量---提取离体心肌组织线粒体总RNA，根据反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，然后在PCR管中进行PCR扩增，最后使用实时荧光定量 PCR 仪自带的软件分析结果，通过比较 Ct 值（循环阈值）来计算肌浆网 Ca²⁺ - ATP 酶 mRNA 的相对表达量。

  ⑧心肌组织ATP含量测定：利用Molecular Probes™ ATP含量测定试剂盒进行检测。

　　心梗线粒体导致心肌纤维化研究现状

　　近几年国内外对于修复心梗线粒体损伤致心肌纤维化主要集中于对于线粒体相关功能基因的表达^[1][2]，干预信号通路^[3][4][5][6]，线粒体ROS（mtROS)作用^[7]，线粒体动力学,线粒体自噬^[8],炎症反应^[9][10]，线粒体融合^[11]，线粒体分裂^[12][13]，ATP合成，氧化应激^[14][15]，糖降解产能^[16][17]，microRNA^[18]/siRNA^[19]，心肌细胞表观遗传^[20],诱导多能干细胞^[21]等方面。

　　2024年10月15日，斯坦福大学Joseph C. Wu团队在《Cell》杂志上发表了题为“Multiscale drug screening for cardiac fibrosis identifies MD2 as a therapeutic target”的文章，从约5000个化合物中筛选出了治疗心脏纤维化的破局新药——青蒿琥酯（ART），研究发现，ART可靶向MD2并有效抑制心脏成纤维细胞中的纤维化基因表达，减少胶原蛋白沉积，改善心脏功能，为进一步研究纤维化疾病治疗提供了思路和支撑。研究中其中一部分采用蛋白质免疫印迹法（WB）检测心肌梗死（CF）中受ART调节的细胞信号传导发现：GO和基因富集（GSEA）通路分析显示：

　　在TGF-β1或IL-11刺激后，ART剂量依赖性地抑制了人CF中的关键MyoFBs（肌成纤维细胞）标志物和细胞外基质（ECMs），抑制了人心肌病MyoFBs中的纤维化基因表达。

　　RNA测序结果显示，在所有TGF-β1刺激的基因中，有459个基因被ART显著逆转，例如ACTA2、COL1A1、COL1A2等。

　　ART下调包括ECM组织、胶原蛋白形成、增殖和迁移、平滑肌收缩和结缔组织发育在内的信号级联反应。

　　华中科技大学丁洁题为“Mdivi-1通过抑制Drp1介导的线粒体分裂和上调Hmox1减轻心肌梗死后梗死边缘区纤维化 ”的博士论文中，在第三部分研究中讨论了线粒体分裂对梗死梗死周边区纤维化的影响，利用蛋白免疫印迹、免疫荧光、透射电子显微镜、生物信息学分析、qRT-PCR以及siRNA转染等实验方法，对线粒体分裂蛋白的表达和磷酸化修饰、线粒体形态、电子传递链复合物I的表达和活性以及可能存在的Drp1之外的靶分子和机制进行了探究。 结果如图所示，相比较于假手术组，心梗小鼠梗死周边区Drp1蛋白的表达量无明显变化，但Drp1在Ser616位点的磷酸化增加；与此同时，梗死周边区（肌）成纤维细胞的线粒体分裂也明显增加，如图所示。这些结果表明Drp1介导的线粒体分裂可能参与了梗死周边区纤维化的发生和发展。

　　小鼠心梗后梗死周边区P-Drp1-S616蛋白上调。A-C：不同组小鼠P-Drp1-S616及Drp1蛋白的免疫印迹代表图及定量图（n=3）。Sham，假手术组；MI，心梗手术组。** P < 0.01 vs.

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　小鼠心梗后梗死周边区（肌）成纤维细胞线粒体分裂增加。透射电镜观察心肌梗死周边区（肌）成纤维细胞线粒体形态的代表图（上方两图标尺为2 µm；下方两图标尺为0.5 µm）。Sham，假手术组；MI，心梗手术组。

　　Drp1是线粒体分裂的主要调节蛋白，丁洁进一步对各组细胞及心肌组织的线粒体形态进行了检测，并对线粒体分裂进行了量化，结果显示，相比较于对照组，造模组NIH3T3细胞的线粒体分裂明显增加，而Mdivi-1明显减轻了TGF-β1所诱导的线粒体分裂；此外，使用透射电镜对梗死周边区的（肌）成纤维细胞线粒体形态进行检测，发现Mdivi-1明显减轻了心梗组小鼠心肌梗死周边区（肌）成纤维细胞的线粒体分裂。

　　活血川归剂的国内外研究现状活血川归剂的主要成分是川芎 12 g 和当归 15 g 以及炮姜 10 g、赤芍 20 g、细辛 6 g、桂枝 12 g、薤白 12 g、瓜蒌 20 g。目前在临床上未发现使用活血川归剂治疗心梗，但其君药当归和川芎在保护心脏方面是常见的临床用药。当归为“血之圣药”,归既能补气，又能活血^[22]，既可通经， 又能活络，当归中的阿魏酸具有抗氧化作用，能清除体内自由基，减少氧化损伤^[23]，当归多糖（ASP）可以通过抑制心肌纤维化、抑制心肌凋亡和减轻氧化应激来预防高血压性心脏病^[24]。川芎是一种常见的活血化瘀^[25]中药，能抑制血小板聚集，降低血液黏稠度，促进血液流通^[26]。

　　前期实验

　　基于心梗所致心肌纤维化及活血川归剂的国内外研究现状，本实验室成员为探究活血川归剂通过PGC-1α/ Sirt3通路减轻心梗线粒体损伤致心肌纤维化的机制，首先采用左前降支结扎制备心梗模型，并通过B超、血生化、染色等检测了相关指标。　

　　　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　

　　a.创新点：

　　①项目将活血川归剂与PGC-1α/ Sirt3通路联系起来，验证活血川归剂通过调节PGC-1α/ Sirt3通路，上调PGC-1α，Sirt3表达，减轻线粒体氧化应激程度，稳定膜电位水平，修复线粒体ATP能量代谢障碍，减轻线粒体损伤，降低Bax/ Bcl-2比值，修复α-SMA，调节血小板-内皮细胞黏附分子CD31蛋白表达，改善心肌损伤，减少心肌细胞凋亡，抑制心肌纤维化。

　　②本项目依托中医药理论体系，整合先进科研手段，运用分子生物学、细胞生物学等前沿技术，凸显了中西医交融的独特属性。从动物实验观察到细胞层面探究，全方位、递进式地钻研活血川归剂抵御心肌纤维化的作用机理，有力呈现出中西医结合在科研探索及实际应用中的突出优势。

　　b.项目特色：

　　①项目研究目标明确，技术路线可行，具有重要的科学意义和应用前景。 在前期心梗对心肌细胞损伤的研究基础上，分别设计设计动物实验分析活血川归剂对心肌梗死致心肌纤维化的保护机制，细胞实验以探究活血川归剂通过 PGC-1α/ Sirt3 通路对于心梗线粒体损伤的影响。研究思路清晰，研究结果将为活血川归剂的临床应用提供科学依据，并为开发新的抗心肌纤维化药物提供潜在的靶点。

　　②项目立足于中医药理论，结合现代科学技术，利用现代分子生物学、细胞生物学等技术手段，具有鲜明的中西医结合特色。从动物、细胞水平，多层次、多角度探讨活血川归剂抗心肌纤维化的作用机制，体现了中西医结合的优势和特色。

　　①技术路线：

　　②拟解决的问题:

　　a.活血川归剂通过增强PGC-1α/ Sirt3通路，减少肌成纤维细胞生成，防止以胶原纤维为主的细胞外基质过量沉积、金属蛋白酶表达受到抑制，减少心肌细胞凋亡，保护心肌组织，同时通过减轻线粒体损伤，修复膜电位，维持线粒体氧化还原正常功能，增强线粒体ATP含量，防止ROS过度积累诱发的心肌纤维化。

　　b.项目发挥中药优势，将活血川归剂与PGC-1α/ Sirt3通路联系起来，探究活血川归剂能够通过靶向作用，从微观的细胞变化和宏观的动物反应两方面对心梗线粒体损伤所致的心肌纤维化起缓解作用。

　　③预期结果：活血川归剂通过PGC-1α/ Sirt3通路，减轻心梗线粒体损伤，使线粒体耗氧率、膜电位、总钙含量相对模型组有所提高，减少心肌细胞凋亡同时使细胞间隙的胶原纤维沉积减少，抑制心肌纤维化。发表高水平论文1-2篇。

　　2025.06-2025.09 查阅文献，购买试剂完成动物模型制作实验，完成预实验。

　　2025.09-2026.01 完成动物实验，检测相关指标并做好记录

　　①小鼠心脏胫骨比。

　　②B超：左心室收缩末期内径（LVIDS）、左心室舒张末期内径（LVIDD）、射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）。 　　

　　③病理切片：HE、MASSON、天狼猩红染色。

　　④血生化：丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）。

　　⑤WB：检测 PGC1-α 、Sirt3 、AKT、BCL-2 、BAX 、SMAD表达

　　⑥PCR：检测PGC1-α ，Sirt3 ，SMAD ，TGF-β

　　⑦免疫荧光：CD31、α-SMA

　　⑧观察线粒体超微结构：Leica超薄切片机制备超薄标本。醋酸铀和硝酸铅进行双重染色，用H7500（Olympus）透射电子显微镜采集图片，观察活血川归剂干预后线粒体超微结构的改变。

　　⑨心肌组织线粒体耗氧率测定：利用海马生物能量测定仪来完成。OCR可用molO2/min/μg线粒体蛋白来表示，测定结束后根据仪器自带软件进行分析。

　　⑩心肌组织线粒体膜电位测定：利用线粒体膜电位检测试剂盒纯化线粒体测定方法，冰冻切片线粒体膜电位测定。

　　⑪心肌组织线粒体总钙测定：利用RT - PCR法检测肌浆网Ca²⁺ - ATP酶mRNA相对表达量。

　　⑫心肌组织ATP含量测定：利用Molecular Probes™ ATP含量测定试剂盒进行检测。

　　2026.02-2026.12 完成细胞实验，检测相关指标并做好记录

　　①WB：检测 PGC1-α 、Sirt3 、AKT、BCL-2 、BAX 、SMAD表达。

　　②PCR：检测PGC1-α ，Sirt3 ，SMAD ，TGF-β。

　　③免疫荧光：CD31、α-SMA

　　④观察线粒体超微结构：Leica超薄切片机制备超薄标本。醋酸铀和硝酸铅进行双重染色，用H7500（Olympus）透射电子显微镜采集图片，观察活血川归剂干预后线粒体超微结构的改变。

　　⑤心肌组织线粒体耗氧率测定：利用海马生物能量测定仪来完成。OCR可用molO2/min/μg线粒体蛋白来表示，测定结束后根据仪器自带软件进行分析。

　　⑥心肌组织线粒体膜电位测定：利用线粒体膜电位检测试剂盒纯化线粒体测定方法，冰冻切片线粒体膜电位测定。

　　⑦心肌组织线粒体总钙测定：利用RT - PCR法检测肌浆网Ca²⁺ - ATP酶mRNA相对表达量。

　　⑧心肌组织ATP含量测定：利用Molecular Probes™ ATP含量测定试剂盒进行检测。

　　2027.01-2027.03 实验数据整理：对线粒体膜电位、总钙含量、ATP 含量测定等实验数据，依次进行统计分析，绘制相关图表，撰写论文并投稿

　　2027.04-2027.12 准备结题，从引言、实验方法与过程、实验结果与分析、结论与展望方面撰写结题报告