① 阐明香蒲新苷通过TGF-β1/ Smads通路对线粒体损伤的影响；

② 揭示香蒲新苷在心衰致肺损伤中的保护机制；

　　① 项目拟在探究香蒲新苷通过TGF-β1/ Smads信号通路，抑制TGF-β1的表达和TGF- β1 Ⅰ型受体的结合，下调Smad2和Smad3表达并抑制其磷酸化，抑制磷酸化产物与Smad4结合，上调负性调节因子Smad7表达，调控核基因的转录，从而抑制胶原蛋白合成和沉积、降低成纤维细胞活力^[6][7][8]；改善ROS的过度释放，提高SOD表达水平增强抗氧化能力，降低氧化应激程度；从而维持心肌细胞中ATP能量供应，延缓心衰线粒体损伤所致的肺纤维化进展^[9][10][11]。

　　② 进一步研究通过香蒲新苷治疗心衰小鼠后，维持钙稳态，减少ROS生成，调节氧化应激，降低促炎细胞因子IL-6浓度，增加抗炎细胞因子IL-10水平，调节炎性反应过程^[11][12][13]；抑制mPTP激活减轻线粒体损伤，抑制caspase-3活化，上调抗凋亡蛋白Bcl-2，下调促凋亡因子Bax，阻止细胞凋亡，减轻肺纤维化，对心衰导致肺损伤进行保护^[14][15][16]。

实验过程

1．动物实验

动物分组：由济南朋悦试验哺乳动物繁育公司健康昆明小鼠60只，体重28g-32g，鼠龄2-3个月，雌雄均可。随机分成5组：假手术组（Sham组）、模型组（Model组）、香蒲新苷低剂量组、香蒲新苷中剂量组、香蒲新苷高剂量组。每组各12只。模型制备：结扎小鼠冠状动脉左前降支左心耳下缘处建立心梗模型进而导致肺损伤全部小鼠造模完成后，进行灌胃。给药方式如下：

指标检测：

① 小鼠心脏胫骨比；

② 通过B超检测EF（射血分数）、FS（左室短轴缩短率）、LVAW；s（左室收缩前壁厚度）、LVAW；d（左室舒张前壁厚度）、LVPW；s（左室收缩后壁厚度）、LVPW；d（左室舒张后壁厚度）以及CO(心输出量)，研究香蒲新苷对小鼠心脏损伤程度的改变，以及心脏结构功能改变的治疗情况，从而判断对心衰的治疗情况；

③ 通过HE染色，进行小鼠肺组织病理学观察，研究香蒲新苷对肺细胞炎性浸润和细胞坏死的调节；

④ 通过Masson染色中的蓝色胶原表达情况和天狼星红染色中红色胶原表达情况，检测香蒲新苷对小鼠心脏肺纤维化的程度的改善；

⑤ 通过血生化测定血清中丙二醛MDA、超氧化物歧化酶 SOD、乳酸脱氢酶LDH、谷草转氨酶AST，研究香蒲新苷对调节氧化应激和减轻肺损伤的作用；

⑥ 通过 PCR检测TGF-β1及其受体、PTEN、Notch和Hes1，探究香蒲新苷通过调节TGF-β1/ Smads通路，调节细胞凋亡、抑制肺纤维化，减轻心衰治疗肺损伤的作用；

⑦ 通过 Westem Blot实验检测Smad2、Smad3、Smad7以及相关磷酸化产物p - Smad2/ 3基因表达水平，Bax、Bcl-2、Akt 蛋白表达水平，探究香蒲新苷治疗对心衰后肺损伤的小鼠通过TGF-β1/Smads通路对细胞凋亡的调控作用；

⑧ 通过免疫荧光观察相关基因蛋白CD31、IL-10、IL-6、α-SMA的表达情况，研究香蒲新苷对炎症反应的调控；

⑨ 线粒体形态学观察：利用透射电镜观察线粒体形态是否完整，Mitotracker探针染色来测定线粒体的形态及分布，研究香蒲新苷通过TGF-β1/ Smads通路对线粒体损伤的修复；

⑩ 线粒体膜电位测定: 流式细胞术检测线粒体膜电位的变化收集分组处理的细胞，按照线粒体膜电位试剂盒操作说明书进行染色，流式细胞仪进行检测分析，探究香蒲新苷对细胞膜电位异常的修复作用；

⑪ 线粒体膜通透性转换孔mPTP的检测：用试剂盒检测，研究香蒲新苷对线粒体通透性的调节；

⑫ ATP含量测定：用荧光素酶检测分析ATP的含量；

⑬ ROS水平检测：流式细胞术检测水平，流式细胞仪进行结果分析，探究香蒲新苷对线粒体ROS水平的稳定；

2．细胞实验

分离并培养肺成纤维细胞：从小鼠肺组织中获取成纤维细胞。将肺组织剪碎成约1mm³的小块，加入含1%I型胶原酶的溶液，在37℃水浴中消化。消化完成后，加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液终止反应。离心收集细胞，用培养基重悬。使用含10%FBS的高糖DMEM培养基（含L-谷氨酰胺和双抗），调整细胞浓度后接种于6孔板中。在37℃、5%CO₂培养箱中培养，定期换液。

诱导肺成纤维细胞损伤模型： 当细胞达到一定密度后，用无血清培养基饥饿处理，以同步化细胞周期。然后，置于缺氧孵箱(94%N2+5%CO2+1%O2,37℃) 缺氧处理24h, 完成细胞缺氧线粒体损伤过程，诱导肺成纤维细胞损伤。同时设置正常对照组（不进行缺氧损伤处理），刺激一定时间后，收集细胞用于后续实验。

细胞质粒转染： 将20μg冻干Smad3 shRNA质粒溶解于200μl去离子水，配制成0.1μg/μl的转染质粒溶液。采用QIAGEN公司的Effectene Transfection Reagent质粒转染试剂盒，按照说明书步骤进行肺成纤维细胞Smad3基因沉默效率检测。

实验分组： 根据是否进行缺氧处理，将肺成纤维细胞随机分为正常对照组、缺氧去血清阳性对照(H/SD)、 缺氧去血清 (H/SD)+香蒲新苷低剂量组、缺氧去血清 (H/SD)+香蒲新苷中剂量组、缺氧去血清(H/SD)+香蒲新苷高剂量组。

指标检测：

①线粒体形态学观察：利用透射电镜观察线粒体形态是否完整，Mitotracker探针染色来测定线粒体的形态及分布，研究香蒲新苷通过TGF-β1/ Smads通路对线粒体损伤的调节作用；

②线粒体膜电位测定: 流式细胞术检测线粒体膜电位的变化收集分组处理的细胞，按照线粒体膜电位试剂盒操作说明书进行染色，流式细胞仪进行检测分析，探究香蒲新苷对细胞膜异常电位的修复作用；

③线粒体膜通透性转换孔mPTP的检测：用试剂盒检测，研究香蒲新苷对线粒体通透性的调节作用；

④ROS水平检测：流式细胞术检测水平，流式细胞仪进行结果分析，探究香蒲新苷对线粒体ROS水平的稳定；

⑤ATP含量测定：用荧光素酶检测分析ATP的含量；

⑥线粒体耗氧率测定:利用海马生物能量测定仪来完成。OCR可用pmol02/ min/ ug线粒体蛋白来表示。测定结束后根据仪器自带软件进行分析，探究香蒲新苷对线粒体氧化应激水平的调控；

⑦Western blot检测蛋白表达；检测Smads蛋白，以及相关磷酸化产物p - Smad2/ 3表达水平，Bcl-2、Bax、Akt蛋白表达及沉默效率；

⑧PCR检测TGF-β1及其受体、PTEN、Notch和Hes1，探究香蒲新苷通过调节TGF-β1/ Smads通路，调节细胞凋亡，抑制肺纤维化的作用；

⑨免疫荧光染色PV两步法对CD31、a-SMA、IL-6、IL-10 进行检测。

国外研究现状

　　国外研究团队通过大量的实验研究，发现了TGF-β1/ Smads信号通路的异常激活会导致细胞外基质的过度沉积，进而引发组织纤维化^[18][19][20]。深入探讨了该信号通路在心肌纤维化、肝纤维化、肾纤维化等多种疾病中的作用机制，为寻找新的治疗靶点和策略提供了丰富的理论依据。

　　美国加州大学的科研团队在TGF-β1/ Smads信号通路与纤维化疾病研究领域成果显著。他们通过多种实验模型，深入探讨了该信号通路在肺纤维化发生发展中的分子机制，为寻找新的治疗靶点提供了理论依据。例如，他们研究发现，通过特异性删除渗入的Cx3cr1+巨噬细胞中的转录共激活因子Brd4，可以有效改善小鼠的心力衰竭症状，并显著抑制成纤维细胞的活化，从而揭示了Brd4在心脏疾病中的关键作用，以及其通过促进成纤维细胞活化推动心脏功能恶化的机制^[21]。

　　2020年在《Phytomedicine》上的文章研究探讨了通过调节阻断TGF-β1/ Smads信号通路，抑制TGF-β诱导的Smad2/ 3磷酸化，减轻了肝纤维化，还揭示了PD介导肝纤维化的机制，证明了TGF-β1/ Smads是肝纤维化的关键调控通路^[22]。让我们看到了介导TGF-β1/ Smads信号通路，在抗纤维化上的研究潜力，对通过该通路介导心衰线粒体损伤治疗肺纤维化的研究提供了参考借鉴。

国内研究现状

　　国内学者在借鉴国外研究成果的基础上，结合我国的实际情况，开展了大量针对TGF-β1/ Smads信号通路与心肺疾病关系的研究。他们不仅关注该信号通路在疾病发生发展中的作用机制，还积极探索基于该信号通路的潜在治疗策略。但关于其通过TGF-β1/ Smads信号通路减轻心衰线粒体损伤致肺纤维化的研究仍处于探索阶段。

　　沈阳药科大学的研究团队在ATX抑制剂治疗肺纤维化领域取得新进展，其研究发现化合物35能有效降低肺组织中p-Smad2和p-Smad3的上调，证实其通过调节TGF-β/ Smad信号通路来发挥抗肺纤维化作用^[23]。

　　北京中医药大学团队曾在研究中指出，TGF-β1 / Smads 通路的激活在心肌纤维化过程中起重要作用。模型组大鼠心肌组织出现TGF-β1、Smad3表达上调而Smad7表达下降, TGF-β1可以抑制趋化因子和促炎细胞因子合成参与梗死心肌区的炎性反应，减少心肌成纤维细胞生成，抑制心肌重构^[24]。

　　在《中国实验方剂学杂志》上的一篇文章中，研究团队基于中医病机理论，研究了参龙煎剂颗粒对特发性肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1蛋白及mRNA表达的影响，从中医药角度为TGF-β1/ Smads信号通路的研究提供了新的思路^[25]。

　　综上所述，国内外在TGF-β1/ Smads信号通路与心衰致肺纤维化领域的研究已取得了一定的成果，但仍有许多问题有待进一步探索。 所以，本项目验证香蒲新苷通过调节TGF-β1/ Smads信号通路，通过抗氧化作用减轻心衰线粒体氧化损伤，稳定线粒体膜电位，抑制mPTP开放，减少ROS生成，维持线粒体正常功能，抑制肺纤维化，在治疗心衰致肺损伤上有积极作用。

参考文献

[1] 潘广涛,刘宇寒,周方园,等.大承气汤通过调节TGF-β1/ Smad3信号通路减轻大鼠急性肝损伤及全身炎症反应[J].世界科学技术-中医药现代化,2022,24(02):663-669.

[2] Hoffman ET, Uhl FE, Asarian L, et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 2023;293:121960.

[3] Lin Q, Lin Y, Liao X, Chen Z, Deng M, Zhong Z. ACSL1 improves pulmonary fibrosis by reducing mitochondrial damage and activating PINK1/Parkin mediated mitophagy. Sci Rep. 2024;14(1):26504. Published 2024 Nov 3.

[4] 王梓良.芹黄素通过TGF-β1/ Smads通路及Parkin介导线粒体自噬减轻心肌损伤[D].南方医科大学,2020.

[5] Li Y, Wang L, Zhang Q, et al. Blueberry Juice Attenuates Pulmonary Fibrosis via Blocking the TGF-β1/ Smad Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2022;13:825915. Published 2022 Mar 28.

[6] Qian J, Liu KJ, Zhong CH, Xian LN, Hu ZH. Sivelestat sodium alleviated sepsis-induced acute lung injury by inhibiting TGF-β/Smad signaling pathways through upregulating microRNA-744-5p. J Thorac Dis. 2024;16(10):6616-6633.

[7] Elkiki SM, Mansour HH, Anis LM, Gabr HM, Kamal MM. Evaluation of aromatase inhibitor on radiation induced pulmonary fibrosis via TGF-β/ Smad 3 and TGF- β/ PDGF pathways in rats. Toxicol Mech Methods. 2021;31(7):538-545.

[8] Allam A, Ali AA, Abdel Baky NA, Balah A. Omeprazole induces profibrotic gene expression in rat kidney: implication of TGF-β/Smad signaling pathway. Drug Chem Toxicol. 2024;47(5):748-755.

[9] 史乐为,周博文,李轩年,等.基于“阳化气，阴成形”理论从线粒体质量控制失调论治特发性肺纤维化[J/OL].中医药信息,1-7[2025-03-12]

[10] 段若雨.MRPL11通过调节线粒体稳态对特发性肺纤维化的作用机制研究[D].河南师范大学,2023.

[11] Cheresh P, Kim SJ, Jablonski R, et al. SIRT3 Overexpression Ameliorates Asbestos-Induced Pulmonary Fibrosis, mt-DNA Damage, and Lung Fibrogenic Monocyte Recruitment. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6856. Published 2021 Jun 25.

[12] Li R, Ren T, Zeng J, Xu H. ALCAM Deficiency Alleviates LPS-Induced Acute Lung Injury by Inhibiting Inflammatory Response. Inflammation. 2023;46(2):688-699.

[13] Sui X, Liu W, Liu Z. Exosomes derived from LPS-induced MHs cells prompted an inflammatory response in sepsis-induced acute lung injury. Respir Physiol Neurobiol. 2021;292:103711.

[14] Zhou L, Tian H, Wang Q, Xiong W, Zhou X, Yan J. Effect of Qingfei Huaxian Decoction combined with prednisone acetate on serum inflammatory factors and pulmonary function of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Transl Res. 2022;14(8):5905-5914. Published 2022 Aug 15.

[15] Inoue R, Yasuma T, Fridman D'Alessandro V, et al. Amelioration of Pulmonary Fibrosis by Matrix Metalloproteinase-2 Overexpression. Int J Mol Sci. 2023;24(7):6695. Published 2023 Apr 3.

[16] Zhu DH, Zhang JK, Guo PL, et al. Alkaloids and lignans isolated from Alisma orientale exhibit anti-pulmonary fibrosis activities by modulating an apoptotic signaling pathway. Phytochemistry. 2025;233:114382.

[17] Takahashi M, Mizumura K, Gon Y, et al. Iron-Dependent Mitochondrial Dysfunction Contributes to the Pathogenesis of Pulmonary Fibrosis. Front Pharmacol. 2022;12:643980. Published 2022 Jan 4.

[18] Yu XY, Sun Q, Zhang YM, Zou L, Zhao YY. TGF-β/Smad Signaling Pathway in Tubulointerstitial Fibrosis. Front Pharmacol. 2022;13:860588. Published 2022 Mar 24.

[19] Elsayed M, Moustafa YM, Mehanna ET, Elrayess RA, El-Sayed NM, Hazem RM. Empagliflozin protects against isoprenaline-induced fibrosis in rat heart through modulation of TGF-β/SMAD pathway. Life Sci. 2024;337:122354.

[20] Ghafouri-Fard S, Askari A, Shoorei H, et al. Antioxidant therapy against TGF-β/SMAD pathway involved in organ fibrosis. J Cell Mol Med. 2024;28(2):e18052.

[21] Alexanian M, Padmanabhan A, Nishino T, et al. Chromatin remodelling drives immune cell-fibroblast communication in heart failure. Nature. 2024;635(8038):434-443.

[22] Xiang D, Zou J, Zhu X, et al. Physalin D attenuates hepatic stellate cell activation and liver fibrosis by blocking TGF-β/Smad and YAP signaling. Phytomedicine. 2020;78:153294.

[23] Ma D, Tan Z, Li S, et al. Discovery of Novel 4,5,6,7-Tetrahydro-7H-pyrazolo[3,4-c]pyridin-7-one Derivatives as Orally Efficacious ATX Allosteric Inhibitors for the Treatment of Pulmonary Fibrosis. J Med Chem. 2025;68(1):792-818

[24] 纪晓迪,吴爱明,吕梦,等.基于miRNA-133a/TGF-β1/Smads信号通路探讨芪苈强心胶囊对心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用机制[J].海南医学院学报,2022,28(21):1608-1613

[25] 庞立健,刘创,臧凝子,等.基于肺虚络瘀病机理论的参龙煎剂颗粒剂对特发性肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1蛋白及mRNA表达的影响[J].中华中医药杂志,2015,30(05):1560-1565.

创新点：

1. TGF-β1/Smads通路的调控：通过香蒲新苷干预定向通路TGF-β1/Smads，调控心衰线粒体损伤的机制，为肺纤维化治疗的药物特异性作用，提供靶点的理论性参考。

2.线粒体损伤的关联性分析：聚焦线粒体功能障碍，如膜电位失衡、ROS异常释放等情况，探究诱发肺纤维化的作用机制，考虑细胞器与组织损伤的联系。

3.香蒲新苷的采用：研究表明蒲黄总黄酮类药物具有抗氧化、心血管保护等作用，而本实验的创新之处在于，采用蒲黄的单体香蒲新苷，用药的成分更加明确。

项目特色：

1.传统中药的现代化探索：以传统中药香蒲为切入点，通过现代分子生物学手段验证其活性成分的治疗作用，并揭示其靶向干预TGF-β1/ Smads信号通路的科学机制，为传统药用植物的现代化开发做出努力，体现中医药现代化研究的特色优势。

2.心肺交互研究：不局限于传统疾病的单独治疗，构建心衰继发肺损伤的动物模型，从“心-肺交互作用”角度解析心衰继发肺纤维化的线粒体代谢失衡机制，弥补单一环节的不足，为临床治疗开展新思路。

1. 技术路线

2. 拟解决的问题

①证明香蒲新苷修复线粒体功能，稳定线粒体膜电位、恢复氧化还原稳态，减少心衰状态下肺组织中线粒体损伤导致的ROS过度累积，从而缓解氧化应激引发的肺组织炎症和结构破坏；

②验证香蒲新通过抑制TGF-β1/ Smads信号通路过度激活，减少肺成纤维细胞向病理性成纤维细胞转化，防止细胞外基质过度沉积，同时调节金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制剂的平衡，抑制肺组织纤维化及细胞凋亡，最终改善心衰导致的肺功能障碍。

3. 预期成果

　　证明香蒲新苷基于TGF-β1/ Smads信号通路，减轻线粒体损伤，减轻肺纤维化，从而进一步治疗心衰造成的肺损伤。为探索改善患者生存状况的新型药物提供参考，开发有效治疗手段，提升患者生存率，具有重要的公共卫生和经济意义。

　　发表高水平论文1-2篇。

2025.12-2026.04

广泛查阅文献，整理肺损伤相关资料，进行实验准备；

完成小鼠心梗模型制作，进行预实验；

2026.05-2026.11

进行动物实验指标检测，研究香蒲新苷对心梗小鼠致肺纤维化的保护机制

(1) 小鼠心脏胫骨比；

(2) B超：射血分数、短轴缩短率、心输出量、左心室前壁收缩末期厚度、左心室前壁舒张末期厚度、左心室后壁收缩末期厚度、左心室后壁舒张末期厚度；

(3) 病理切片：HE、MASSON、天狼星红染色；

(4) 血生化：检测SOD、MDA、LDH、AST；

(5) WB检测：心肌组织TGF-β、Smad、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达及沉默效率；

(6) 定量聚合酶链反应法检测：心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Caspase-3，mRNA、GSH含量；

(7) 免疫荧光检测PV两步法检测：CD31、α-SMA、TGF-β、Smad、IL-6、IL-10；

(8)进行线粒体形态学观察、ATP、ROS、mPTP检测线粒体功能；

2026.12-2027.05

进行细胞指标检测，研究香蒲新苷基于TGF-β1/Smads通路减轻线粒体损伤的机制

(1) 进行线粒体形态学、总钙含量、ATP、ROS、mPTP以及耗氧率的测定；

(2) WB测 TGF-β、Smad、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达及沉默效率；

(3) PCR检测TGF-β 、Smad 、Caspase-3、mRNA、GSH 含量；

(4) 免疫荧光染色检测CD31 、α-SMA 、TGF-β 、Smad 、IL-6 、IL-10 ；

2027.06-2027.10

实验数据统计，撰写论文，并投稿

2027.10-2027.12

准备结题