济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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紫檀芪对环磷酰胺所致睾丸损伤保护作用的多组学研究

申报人：刘泽琪 申报日期：2025-03-14

基本情况

2025创新项目
紫檀芪对环磷酰胺所致睾丸损伤保护作用的多组学研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生自主选题
二年期
环磷酰胺作为一类广谱抗肿瘤药物，在治疗多种恶性肿瘤和自身免疫性疾病中发挥了重要作用，但其生殖毒性问题严重影响了男性患者的生育功能和生活质量。紫檀芪因其较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用，主要应用于癌症，高血压，高血脂的治疗，但对于睾丸损伤的保护性研究尚少。此次研究旨在利用网络药理学、转录组学、代谢组学及蛋白质组学等技术，结合体内体外实验，探讨紫檀芪对环磷酰胺诱导的睾丸损伤的保护作用及其机制，为紫檀芪开发应用于环磷酰胺所致生殖损伤提供充分实验依据，为开发天然药物防治化疗生殖毒性提供新思路。
本项目负责人进入刘老师团队进行科研实验已有一年，已经基本掌握相关技术。
主持包括山东省自然科学基金、山东省卫生厅项目等在内的各级课题10余项，参与国家和山东省自然科学基金5项。在国内外高质量期刊发表学术论文20余篇。指导大学生获批国家和山东省大学生创新项目各一项，参加山东省大学生科技创新实验技能竞赛6次，获一等奖4次，二等奖2次。
指导教师对本次大学生创新项目的文献调研、选题、开题以及后续的相关实验研究可全程提供帮助。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
刘泽琪 药学院 药学（本科） 2023 主持并参与多组学分析
周荣浩 药学院 药学（本科） 2023 Western blot 实验
张倩 药学院 药学（本科） 2023 动物实验
黄婧雯 药学院 药学（本科） 2024 RT-qPCR 实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
刘超 药学院 否

立项依据

①通过多组学探究紫檀芪对睾丸损伤保护作用的机制。

②明确紫檀芪激活PI3K/AKT/mTOR通路与调控氧化应激的因果关系。

③探索靶向干预关键节点对生精功能的挽救效应。

①使用网络药理学预测及分子对接发掘紫檀芪发挥睾丸损伤保护作用的潜在信号通路和作用靶点。
②紫檀芪对环磷酰胺致睾丸损伤小鼠的保护作用及分子机制研究
建立小鼠睾丸损伤模型，紫檀芪干预，观察小鼠睾丸组织病理学变化，测定小鼠睾丸指数、睾丸氧化应激、炎症因子的变化，根据网络药理学预测及分子对接发掘的潜在信号通路和作用靶点探究紫檀芪对环磷酰胺致睾丸损伤保护作用的分子机制，结合多项分子生物学技术探讨紫檀芪通过激活PI3K/AKT/mTOR通路逆转对生殖损伤。
③紫檀芪对环磷酰胺致睾丸损伤小鼠睾丸多组学的研究
联合转录组学、代谢组学和蛋白质组学等多组学分析技术，构建 基因-蛋白-代谢物三元调控网络，重点解析PI3K通路下游代谢酶及氧化还原相关代谢物（GSH/GSSG、NADPH）与PTGS2、CAT的关联。
④体外实验构建睾丸支持细胞（TM4）氧化应激模型，使用LY294002（PI3K抑制剂）对PI3K/AKT/mTOR通路进行反向验证
环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）作为临床上广泛使用的抗肿瘤药物，在治疗白血病、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤以及狼疮性肾炎、系统性血管炎等自身免疫性疾病中发挥了重要作用[1-4]。然而，CTX在杀伤癌细胞的同时，也对快速分裂的正常细胞（如生殖细胞）造成严重损伤，导致睾丸组织学改变、精子数量减少、活力下降，甚至引发少精子症和无精子症[5-7]。据统计，超过30%的年轻男性肿瘤患者在接受CTX治疗后出现生育功能障碍，这不仅影响患者的生活质量，还对其心理和家庭关系造成深远影响[8-9]。随着我国“健康中国2030”战略的推进，肿瘤患者的长期生存率和生活质量成为医学研究的重点，而化疗引起的生殖毒性问题亟待解决。目前，临床上尚缺乏有效药物预防或缓解CTX所致生殖损伤，因此，探索一种安全有效的保护策略具有重要的现实意义。
紫檀芪具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、镇痛、抗糖尿病、抗肥胖及神经保护作用，能减轻动物体内炎性反应和氧化应激水平，提高免疫功能，抑制肿瘤的生长[10]。有研究表明，紫檀芪的衍生物通过调节 Nrf2/NF-κB 信号通路减少氧化应激和炎症，从而改善心力衰竭[11]。紫檀芪治疗后睾丸组织学发生明显改变，可以减少 ROS 的生成，上调 MDA 的表达，紫檀芪对大鼠睾丸缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡具有保护作用，其保护机制与 caspase-3、8、9 的表达有关，可以有效改善睾丸损伤[12]。
诱导型前列腺素内过氧化物合酶 2/环氧合酶 2（PTGS2）在炎症信号传导相关的病理过程中发挥重要作用。PTGS2 受到严格调控，其表达和激活直接由促炎细胞因子和生长因子诱导，与睾丸类固醇生成、精子发生和局部免疫的控制有关。在体内发生炎症事件后，在生殖细胞中 PTGS2 的表达在 72 小时内逐渐下降。另一方面，睾丸巨噬细胞在炎症事件发生后 PTGS2 mRNA 和 PGE2 的产生显著增加[13]。多种睾丸细胞类型中均检测到“构成型”PTGS1 和“诱导型”PTGS2形式的 mRNA，睾丸 PTGS2 的表达明显高于 PTGS1，直接或间接地参与了控制未成熟睾丸中的间质细胞的发育，促进了炎症因子的产生，如 IL-1 和 IL-6[14]。
细胞色素 P450 家族主要在睾丸、肾上腺、卵巢、胎盘组织中表达，CYP1A1、CYP1B1、CYP17A1、CYP19A1 是细胞色素 P450 家族成员，在类固醇激素合成和炎症调控中发挥关键作用。CYP17A1和CYP19A1分别是雄激素和雌激素合成的限速酶，其表达异常会导致生殖激素失衡，影响精子发生[15-16]。
表皮生长因子受体（EGFR）是一种细胞表面受体。生精过程中，EGF与EGFR结合影响Sertoli和Leydig细胞的功能，从而改变雄激素的合成或其他因子的分泌，或通过旁分泌方式调节管周肌样细胞与生殖细胞相互作用。EGF可抑制Sertoli细胞中芳香化酶将睾酮转化为雌二醇，维持局部高浓度的睾酮，这对精子发生有促进作用[17]；EGF可影响Leydig细胞分泌睾酮的能力，能提高线粒体中细胞色素P450对胆固醇底物的利用，增加3β2羟甾脱氢酶的活性，显著促使Δ52孕烯醇酮转化为孕酮，促进睾酮合成[18]；EGF在小鼠睾丸精原细胞及支持细胞内的存在可能起介导作用，激活支持细胞物质的合成和分泌，以协同睾酮对精子细胞成熟分化的作用，在精原细胞中表达说明EGF可能直接作用于生精细胞[19]。
雌激素受体 1（ESR1）定位于细胞核，对生殖系统的发育起着重要的调节作用，调节着精子的发生与成熟的过程。其首次发现是存在于雌性生殖系统中，后续研究证明它在雄性生殖系统中也有分布，尤其睾丸研究者居多。ESR在雄性生殖系统中发挥着不可或缺的作用，尤其对精子的发生与繁殖的影响。研究发现，ESR敲除小鼠睾丸表现为萎缩且伴有精子数目及生殖力的下降，表明ESRα的存在与精子发生有关[20]。资料表明，ESR可以通过减弱垂体促性腺激素分泌，间接影响间质细胞睾酮的分泌，并在精细胞发育及调控中起主要作用，表明ESR对繁殖有重要的影响[21-22]。有研究表明，干扰 ESR1 表达后，自噬相关蛋白表达减少，凋亡蛋白蛋白增加，增殖标志基因表达下降[23-25]。此外，EGFR、ESR1和PIK3CA是化学致癌-受体活化通路的核心调控因子。EGFR通过调控细胞增殖和凋亡参与精子发生过程，而ESR1在生殖系统发育和精子成熟中发挥重要作用[26-27]。
液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）的代谢分析可用于同时测量病理过程中的多种代谢变化，并确定重要中间生化途径的动态代谢反应[28]。代谢组学实验有几种类型，包括靶向和非靶向分析。非靶向代谢组学的优点在于无需事先具备相关知识即可进行数据收集。然而，样品制备和分析方法的选择对结果有着不可忽视的影响。因此，在进行代谢组学研究时，需要仔细选择合适的方法，并在分析过程中考虑到这些因素对结果的潜在影响[29]。所以可以通过非靶向代谢组学对睾丸组织中的各种代谢物进行分析，并将其与所需通路相关。
综上所述，国内外现已有大量研究表明环磷酰胺造成的睾丸损伤的主要原因在于氧化应激、炎症反应和细胞凋亡，而紫檀芪具有抗氧化、抗炎作用，但紫檀芪对睾丸损伤的保护作用报道较少，具体的作用机制尚不明确。本研究首先通过网络药理学及分子对接方法分析，预测 EGFR、PTGS2、ESR1、CYP1A1、CYP1B1、CYP17A1、CYP19A1 作为环磷酰胺、紫檀芪对睾丸损伤作用靶点，并通过查阅文献证实了机制的可行性。然后，通过环磷酰胺的给予建立睾丸损伤模型，观察紫檀芪对环磷酰胺造成睾丸损伤的保护作用，并初步验紫檀芪是否通过调控EGFR、PTGS2、ESR1 的表达来保护环磷酰胺所致的睾丸损伤。最后，利用非靶向代谢组学探究紫檀芪对环磷酰胺所致睾丸损伤的保护作用及机制。
①前期研究发现环磷酰胺可导致明显的睾丸损伤，PTS处理可以一定程度上恢复由环磷酰所致的睾丸损伤，首次研究PTS对环磷酰胺睾丸损伤小鼠的保护作用；通过网络药理学及分子对接方法分析筛选出靶点，首次验证紫檀芪通过调控EGFR、PTGS2、ESR1 的表达来保护环磷酰胺所致的睾丸损伤，为PTS 进一步开发和应用奠定基础。
②基于多组学技术探讨 PTS 对环磷酰胺致睾丸损伤小鼠的保护机制，为PTS 开发应用于环磷酰胺所致生殖损伤提供充分实验依据，为开发天然药物防治化疗生殖毒性提供了新思路。
技术路线：
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拟解决的问题：
①通过大数据分析和生物信息学技术，进一步挖掘紫檀芪的作用靶点和代谢调控网
络，为精准医学提供新思路。
②结合PCR、WB、免疫组化等分子生物学技术，阐释PTS缓解环磷酰胺致睾丸损
伤潜在的损伤及保护机制，为治疗药物性睾丸损伤提供新思路。
③联合转录组学、代谢组学和蛋白质组学等多组学分析技术，构建 基因-蛋白-代谢
物三元调控网络，克服单一组学研究的局限性。
预期成果：
发表相关论文 1-2 篇。
①2025.06-2025.12 使用网络药理学预测及分子对接发掘紫檀芪发挥睾丸损伤保护作用的潜在信号通路和作用靶点。建立环磷酰胺致睾丸损伤模型，灌胃给药PTS，观察小鼠睾丸组织病理学变化，测定小鼠睾丸组织氧化应激分子的变化及相关信号通路，体外实验构建睾丸支持细胞（TM4）氧化应激模型，使用LY294002（PI3K抑制剂）对PI3K/AKT/mTOR通路进行反向验证，探究 PTS 干预对环磷酰胺致睾丸损伤的具体分子机制。
②2026.01-2026.12联合转录组学、代谢组学和蛋白质组学等多组学分析技术，检测 PTS 治疗环磷酰胺致睾丸损伤小鼠睾丸非靶代谢组学研究，从生物小分子水平找出差异内源性代谢产物以及相关代谢通路。
③2027.01-2027.06 分析实验数据，撰写论文，发表高质量论文 1-2 篇。
本课题组前期取得的与本项目有关的研究成果如下：
[1]孔妮,刘超,杨方浩,张腾元,王宝堃 & 高慧婕.(2018).原花青素对环磷酰胺致免疫抑制 小鼠免疫功能的影响. 天津医药(12), 1291-1294.
[2]刘超,何卫保,朱桐林,刘粮泽,高鑫芯 & 高慧婕.(2020).高脂饮食诱导高脂血症大鼠及 不同器官病理变化. 中国油脂(09),81-84+111.
[3]李晓,高慧婕,朱桐林,张腾元,王清华 & 刘超.(2019). 阿胶对环磷酰胺所致免疫抑制小 鼠的免疫保护作用. 济宁医学院学报(06),385-389.
[4]Gao H, Ren Y, Liu C. Aloe-Emodin Suppresses Oxidative Stress and Inflammation via a PI3K-Dependent Mechanism in a Murine Model of Sepsis. Evid Based Complement AlternatMed. 2022;2022:9697887. Published 2022 Aug 8. doi:10. 1155/2022/9697887.
上述文章均采用分子生物学相关技术探索小鼠疾病模型的病理生理机制研究，为本研 究打下了坚实的基础，积累了大量有关环磷酰胺作用于机体的所产生和免疫和毒理性研究基础。

关于本申请项目现阶段所取得的部分结果如下：
（1）模型制备
通过多次对比分析实验，完善了 CTX 睾丸损伤模型的建立方法，成功制备 CTX 致睾丸损伤模型。采用腹腔注射，80kg/mg，连续5天，可取得最佳效果。
（2）PTS抗生精障碍作用靶点筛选和PPI网络构建
将筛选收集的151个药物作用靶点和1088个生精功能障碍靶点通过 Venny 平台取交集，共得到23个交集靶点。见图1（A）。通过STRING 数据库分析药物与疾病作用靶点 PPI网络，并通过 CytoscaPTS 进行分析及可视化处理，网络中包含了节点有 22个、72条边。包括ESR1、PTGS2、EGFR、CYP19A1、CYP1A1等，靶点处于网络中核心。见图1（B，C）。
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图1 PTS抗生精障碍作用靶点筛选和PPI网络构建
（3）GO功能与KEGG通路富集分析
通过 DAVID平台进行KEGG与GO富集分析， 将得到的结果按P值进行排序。在进行基因本位（GO）生物过程富集分析后，BP 共获得739条结果、CC 共获得36条结果和MF 共获得95条结果。将各自结果按 P 值从小到大排序并选取前10条作可视化输出。见图2。 KEGG 共富集到71条通路，选取相关性排名前10位结果作为核心通路，建立气泡图，同时与核心靶点蛋白建立网络图。见图3。
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图2 GO功能富集分析
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图3 KEGG富集通路图及相关核心靶点网络图
（4）小鼠睾丸指数分析
与 N 组相比，CTX组睾丸指数有所上升，与 CTX 组相比，给药组睾丸指数有所下降，均具有统计学意义，这说明 CTX 处理后可能会诱发睾丸炎症反应，而PE处理后则会降低 CTX 所致的睾丸炎症反应。见图4。
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图 4 小鼠睾丸指数变化（* P<0.05， ** P<0.01）
（5）全血细胞检测分析
血常规对比：与 N 组相比，CTX 组淋巴细胞比率、中间细胞比率有所下降，粒细胞比率有所上升，而给药后有所恢复，淋巴细胞比率与中间细胞比率的下降的原因可能是因为免疫抑制，粒细胞比率的升高可能是因为 CTX 诱发炎症。见图5。
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图5 小鼠睾丸组织全血细胞检测分析：粒细胞比率(A)、淋巴细胞比率（B）、中间细胞比率（C）（* P<0.05，** P<0.01）
（6）小鼠睾丸病理形态分析
病理组织形态学对比：与 N 组相比，CTX 组睾丸组织基膜明显变薄，生精小管内精原细胞等细胞不规则排列且疏松，生精小管形态扭曲，管腔变大，疑似肿胀，生精小管间间隙变少，间质细胞减少，并出现合胞体，而给药后有所恢复。与 CTX 组比，L 组间质细胞数目正加，管壁明显增厚，生精细胞相对排列有序、紧密，生精小管间隙有明显恢复，但基膜无明显变化。M、H 组基膜增厚，生精小管管壁增厚，管腔变小，精原细胞，初级精母细胞，精子细胞等数目增加，间隙明显恢复。这表明 CTX 在组织水平上发挥了毒性作用，生精小管管腔变大，疑似肿胀，这可能因为炎症诱发的。见图6。
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图6 小鼠睾丸组织病理切片（100×）
（7）紫檀芪对环磷酰胺诱导的睾丸损伤小鼠PI3K、AKT、mTOR mRNA表达的影响
N组小鼠睾丸中的PI3K、AKT、mTOR mRNA显著高于CTX组，表明环磷酰胺可以下调PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达水平，而紫檀芪用药后，PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达水平明显上升，表明紫檀芪可能通过PI3K/AKT/mTOR通路改善环磷酰胺所致小鼠睾丸损伤。见图7。
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图7 小鼠睾丸PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达结果
*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001
本实验成功建立了环磷酰胺所致小鼠睾丸损伤模型，初步说明紫檀芪用药后对小鼠睾丸组织损伤的缓解作用，结果表明紫檀芪可能通过P13K/AKT/mTOR通路来调节睾丸代谢和氧化应激的过程，从而参与睾丸损伤的保护作用。
济宁医学院药学院公共科研平台设有专门的分子生物学室、细胞生物学室等，拥有分 选式流式细胞仪、BGI-500 基因测序仪、活细胞工作站、台式冷冻离心机、低温冰箱、激 光共聚焦显微镜、荧光定量 PCR 仪、酶联免疫检测仪和蛋白电泳及转印系统，Waters Acquity I-Class PLUS 超高效液相色谱串联 Waters Xevo G2-XS QTOF 高分辨质谱仪等，具备本研究实验所需要的所有条件。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 9000.00 11000.00
1. 业务费 12000.00 无 5000.00 7000.00
（1）计算、分析、测试费 8000.00 样本检测 5000.00 3000.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 4000.00 版面费 0.00 4000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 8000.00 仪器、耗材 4000.00 4000.00
结束

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