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二氢叶酸还原酶抑制剂的虚拟筛选研究

申报人：胡晓晴 申报日期：2025-03-13

基本情况

2025创新项目
二氢叶酸还原酶抑制剂的虚拟筛选研究 学生申报
创新训练项目
理学
生物科学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
二氢叶酸还原酶（DHFR）是生物体中普遍存在的酶，其功能是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为辅因子，将叶酸还原为二氢叶酸，进而将其还原为四氢叶酸。四氢叶酸是生物体中合成嘧啶、嘌呤、丝氨酸和甘氨酸的关键底物，影响DNA合成和细胞生长增殖。由于DHFR重要的生物学功能，已成为抗癌、抗细菌和抗真菌等药物研发的重要靶标。理想的DHFR抑制剂应具有良好的选择性。目前，新型抑制剂的发现方法主要包括高通量筛选和虚拟筛选。本研究以立枯丝核DHFR（hDHFR）为靶点进行虚拟筛选，旨在识别具有潜在抑制活性的化合物。通过对筛选得到的化合物进行酶抑制活性测定，确定最佳抑制效果和选择性的化合物，并进一步采用分子动力学模拟等方法分析其抑制机制。
无
济宁医学院博士科研启动基金，“利用X-光衍射和分子模拟技术研究酶催化机制和突变体设计”，40.6万，2022.12.28 - 2025.12.28
指导老师将在经费、理论指导、技术指导等方面给予本项目大力支持，以保证本项目顺利完成。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
胡晓晴 生命科学学院 生物技术（本科） 2023 项目调研、撰写以及实验设计
崔玉玉 生命科学学院 生物工程（本科） 2023 蛋白表达纯化
尹亚楠 生命科学学院 生物工程（本科） 2022 论文撰写
张家伟 生命科学学院 生物信息学（本科） 2024 虚拟筛选
陈朴丽 生命科学学院 生物工程（本科） 2023 酶活抑制检测
黄文静 生命科学学院 生物信息学（本科） 2023 数据处理分析

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
李治宏 生命科学学院 否

立项依据

本研究旨在针对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引发的农作物病害防治需求，以该病原菌二氢叶酸还原酶（rDHFR）为靶标，通过虚拟筛选技术从化合物库中高效筛选能特异性抑制rDHFR的新型先导化合物，结合酶活性实验验证其抑制效果与选择性，并运用分子动力学模拟探究其作用机制，以期发现兼具高效抑制活性与靶标选择性的新型抑制剂，为解决传统杀菌剂耐药性问题及开发环境友好型抗真菌药物提供理论依据。
1. 靶标蛋白结构建模与虚拟筛选体系构建
基于立枯丝核菌基因组数据，采用AlphaFold3构建rDHFR的三维结构模型，明确其活性口袋关键氨基酸残基及辅因子NADPH结合位点特征。建立虚拟筛选流程：利用分子对接软件AutoDock Vina对ZINC化合物库进行初筛，设置结合能阈值（≤-7 kcal/mol）筛选潜在配体；结合ADMET性质预测进行二次过滤，缩小候选化合物范围，优先保留具有低交叉抑制人源DHFR（hDHFR）潜力的分子。
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图1 hDHFR与rDHFR的三维结构。（A）hDHFR的三维结构：M20 loop为品红色，BC loop为蓝色，Region C为黄色，FG loop为青色，GH loop为绿色。（B）rDHFR的三维结构：M20 loop为品红色，BC loop为粉色，Region C为黄色，FG loop为青色，GH loop为橙色。
2. 候选化合物的酶抑制活性实验验证
通过体外酶活实验（分光光度法）测定候选化合物对rDHFR的抑制活性：以NADPH氧化还原变化为指标，计算半数抑制浓度（IC50），筛选出高活性化合物（如IC50 < 10 μM）。同步测试其对hDHFR的抑制率，评估选择性（如选择性指数SI = IC50-hDHFR/IC50-rDHFR），优选SI > 10的化合物以降低宿主毒性风险。此外，通过时间依赖性抑制实验和Lineweaver-Burk双倒数图分析抑制类型（竞争性/非竞争性），初步揭示化合物作用机制。
3. 分子动力学模拟揭示结合机制
针对高活性、高选择性化合物，采用GROMACS软件进行100 ns分子动力学模拟，分析配体-rDHFR复合物的稳定性（RMSD、RMSF）、关键相互作用（氢键、疏水作用、π-π堆积）及活性口袋构象变化。对比hDHFR体系，识别rDHFR特异性结合位点（如保守性差异区域或柔性loop区），阐明选择性抑制的结构基础。结合MM-PBSA/GBSA计算结合自由能，量化关键残基贡献（如Arg37、Asp67），指导后续结构优化。
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图2 hDHFR与rDHFR活性口袋与叶酸的相互作用分析
4. 先导化合物的优化与抗真菌潜力评估
基于模拟结果，对核心骨架进行定向修饰（如引入极性基团增强氢键网络，优化疏水基团提升结合互补性），合成衍生物并开展构效关系（SAR）分析。通过离体实验验证化合物对R. solani菌丝生长抑制率及孢子萌发影响，结合活体实验（如水稻叶片接种模型）评估田间防效。同步测试其对非靶标生物（如土壤微生物、哺乳动物细胞）的毒性，筛选兼具高效性（EC50 < 5 μM）、低抗性风险（多靶点协同抑制潜力）和环境安全性的候选分子，为新型杀菌剂开发提供数据支撑。 
立枯丝核菌（R. solani AG1-IA）是一种重要的植物病原土传真菌，能侵染水稻、玉米和大豆等多种经济作物，引发根腐病和纹枯病等病害，从而造成显著的产量损失和经济影响。纹枯病作为水稻的第二大病害，在全球范围内普遍发生，每年造成的损失可达2.5-50%(Singh et al., 2019)。目前，已有几种杀菌剂被用于R. solani的防治，如井冈霉素A通过抑制R. solani的海藻糖酶活性来防治水稻纹枯病，而噻呋酰胺则通过抑制R. solani的琥珀酸脱氢酶活性来达到防治效果。然而，长期使用单一作用机制的杀菌剂可能导致病原体产生耐药性，从而减弱其防治效果。因此，迫切需要发现R. solani生长过程中的其他关键酶，并进一步发现新型的抑制剂或先导化合物。
二氢叶酸还原酶（DHFR）是生物体中普遍存在的酶，其功能是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为辅因子，将叶酸还原为二氢叶酸，进而将其还原为四氢叶酸(Futterman 1957)。四氢叶酸是生物体中合成嘧啶、嘌呤、丝氨酸和甘氨酸的关键底物，影响DNA合成和细胞生长增殖。由于DHFR重要的生物学功能，已成为抗癌、抗细菌和抗真菌等药物研发的重要靶标(Juan et al., 2020; Agnieszka et al., 2019)。DHFR也存在于R. solani中，是影响其生长和繁殖的靶标。理想的DHFR抑制剂应具有良好的选择性，即在抑制靶标DHFR时表现出高活性，在抑制非靶标DHFR时表现出低活性，以保证抑制剂的特异性并减少副作用。
目前，新型抑制剂的发现方法主要包括高通量筛选和虚拟筛选。高通量筛选是通过实验方法对大规模化合物库进行生物活性和药理效果测定，其成本高，命中活性化合物的概率为0.02%(Doman et al., 2002)。虚拟筛选则是采用计算机模拟方法预测化合物与靶标蛋白之间的相互作用，以较低成本和快速高效的方式识别潜在的活性化合物，其命中活性化合物的概率为0.05%~12%(Schneider et al., 2002)。由于其经济高效的特点，虚拟筛选已广泛用于抑制剂的发现。Sharma等采用虚拟筛选方法成功发现了一种有效抑制结核分枝杆菌DHFR（MtbDHFR）的抑制剂IND-07，其对结核分枝杆菌的抑制活性IC50值为25 M，对MtbDHFR的抑制活性IC50值为150 M，而对人DHFR的抑制活性IC50值为980 M，选择性为6.5倍(Sharma et al., 2018)。Welsch等也采用虚拟筛选方法发现了一种高效抑制弓形虫DHFR的化合物，其对弓形虫DHFR的抑制活性IC50值为9 nM，对人DHFR的抑制活性IC50值为760 nM，选择性为84倍。相比之下，药物达拉匹林对弓形虫DHFR的抑制活性IC50为230 nM，选择性为20倍(Welsch et al., 2016)。这些研究表明虚拟筛选方法在发现新型抑制剂方面的有效性，因此研究采用虚拟筛选进行抑制剂的发现。 
本研究以立枯丝核菌DHFR（rDHFR）为靶点进行虚拟筛选，旨在识别具有潜在抑制活性的化合物。通过对筛选得到的化合物进行酶抑制活性测定，确定最佳抑制效果和选择性的化合物，并进一步采用分子动力学模拟等方法分析其抑制机制。以期发现兼具高效抑制活性与靶标选择性的新型抑制剂，为解决传统杀菌剂耐药性问题及开发环境友好型抗真菌药物提供理论依据。
参考文献
[1] Singh P, Mazumdar P, Harikrishna J, et al. Sheath blight of rice: a review and identification of priorities for future research [J]. Planta, 2019, 250(5): 1387-1407.
[2] Doman T, McGovern S, Witherbee B, et al. Molecular docking and high-throughput screening for novel inhibitors of protein tyrosine phosphatase-1B [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2002, 45(11): 2213-2221.
[3] Schneider G, Böhm H. Virtual screening and fast automated docking methods [J]. Drug Discovery Today, 2002, 7(1): 64-70.
[4] Sharma K, Neshat N, Sharma S, et al. Identification of novel selective Mtb‐DHFR inhibitors as antitubercular agents through structure‐based computational techniques [J]. Archiv Der Pharmazie, 2019, 353(2): 1900287.
[5] Sharma K, Tanwar O, Sharma S, et al. Structural comparison of Mtb-DHFR and h-DHFR for design, synthesis and evaluation of selective non-pteridine analogues as antitubercular agents [J]. Bioorganic Chemistry, 2018, 80: 319-333.
[6] harma H, Sharma P, Urquiza U, et al. Exploration of a large virtual chemical space: Identification of potent inhibitors of lactate dehydrogenase-a against pancreatic cancer [J]. Journal of Chemical Information and Modeling, 2023, 63(3): 1028-1043.
[7] Welsch M, Zhou J, Gao Y, et al. Discovery of potent and selective leads against Toxoplasma gondii dihydrofolate reductase via structure-based design [J]. Acs Medicinal Chemistry Letters, 2016, 7(12): 1124-1129.
[8] Lyu J, Irwin J, Shoichet B. Modeling the expansion of virtual screening libraries [J]. Nature Chemical Biology, 2023, 19(6):712-718. 
（1）首次以立枯丝核菌DHFR为靶标，突破传统杀菌剂作用机制局限，通过虚拟筛选结合动力学模拟精准挖掘新型选择性抑制剂，为解决病原菌耐药性提供新策略；
（2）建立“计算-实验-模拟”三位一体研究范式，集成同源建模、多级虚拟筛选（结合能阈值筛选+ADMET过滤）及动态结合机制解析，显著提升抑制剂发现效率与靶标特异性；
（3）聚焦rDHFR与hDHFR结构差异（如活性口袋柔性loop区、保守残基突变），设计高选择性抑制剂（SI>10），降低交叉毒性风险，为开发环境友好型抗真菌药物奠定理论基础。
技术路线
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拟解决的关键问题：
1. 传统杀菌剂抗药性加剧：针对立枯丝核菌现有杀菌剂（如井冈霉素A、噻呋酰胺）作用靶点单一，长期使用导致耐药性显著上升，防治效果持续下降；
2. 靶标选择性不足：现有DHFR抑制剂（如甲氧苄啶）对病原菌与宿主酶（hDHFR）的选择性差异有限，易引发宿主毒性风险；
3. 高效抑制剂发现效率低：传统高通量筛选成本高、周期长，且难以精准识别兼具活性与选择性的化合物。
预期研究成果：
1. 建立“虚拟筛选-酶活验证-动态机制解析”的高效研究体系，将抑制剂发现周期缩短30%以上；
2. 获得2-3种靶向rDHFR的高效抑制剂（IC50 < 5 μM），选择性指数（SI）>10，显著降低对人源DHFR的交叉抑制风险；
3. 培养学生6人，发表高水平研究论文1篇。 
2026.01—2026.06：完成rDHFR三维结构建模（AlphaFold3）、活性口袋分析；建立虚拟筛选流程（AutoDock Vina+ADMET过滤），从ZINC库中初筛出300-500个候选化合物。确定10-20个高结合能（≤-7 kcal/mol）、低人源交叉抑制潜力的候选分子。
2026.07—2026.12：体外测定候选化合物对rDHFR/hDHFR的IC50值，筛选高活性（IC50 < 10 μM）与高选择性（SI > 5）分子；通过Lineweaver-Burk分析明确抑制类型。获得3-5个核心候选化合物。
2027.01—2027.06：对核心化合物进行100 ns分子动力学模拟（GROMACS），分析结合模式、关键残基贡献（MM-PBSA）及选择性结构差异（如loop区动态变化）。明确2-3个优势化合物的作用机制。
2027.06—2027.12：基于模拟结果合成5-10个衍生物，测试离体抑菌率（菌丝生长抑制>60%）；开展水稻叶片接种模型验证防效（EC50 < 20 μM）；整理实验数据，撰写项目研究报告和论文。 
与本项目有关的研究积累：
（1） DHFR催化机制：团队前期已完成人源DHFR蛋白晶体结构的解析，揭示了DHFR催化中的质子穿梭机制：单个质子从活性中心的水分子解离，通过狭长的通道传递至二氢叶酸的N5原子，从而启动催化反应。这一过程在酸性条件下显著减缓，表明质子传递对酶动力学具有重要影响。
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图4 二氢叶酸还原酶的催化机制
（2） M20 loop动态变化影响底物结合：酸性pH下，M20 loop和F-G loop的动态性显著降低，活性位点更“闭合”，但仍允许溶剂分子进入。中性pH下，M20侧链构象更灵活，促进溶剂通道的短暂开放，且促进底物的进入和结合。
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图5 DHFR在不同pH下M20 loop的动态变化

已取得的成绩：
项目指导老师长期从事X-光和中子衍射技术在生物领域的应用，尤其是研究酶蛋白催化机制、蛋白质结构与功能关系研究和基于结构的药物设计。申请人利用X-光和中子衍射衍射技术，结合分子动力学模拟技术等技术研究蛋白质的结构动力学与功能关系，详细阐述了DHFR的催化机制和在不同pH条件下的底物结合，指导DHFR抑制剂的设计。相关工作成果发表在ACS Catalysis等杂志上，多次被他人引用。
申请人所在学院建有天然活性物质研究与开发重点实验室，为本课题提供良好的科研条件。本实验室及学院平台已经拥有PCR仪、AKTA蛋白纯化仪、超高效液相色谱、酶标仪、超高速离心机、超低温冰箱和大型摇床等本项目所需的仪器设备。本项目用到的Coot、CCP4、Phenix、PyMoL和Gromacs等软件在实验室计算机服务器可以免费下载使用。上述条件可以保证本项目的完成。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 3000.00 试剂耗材 3000.00 0.00
1. 业务费 2000.00 无 2000.00 0.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 结构计算，分子对接，分子动力学模拟 2000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 0.00 无 0.00 0.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 1000.00 化合物实验验证 1000.00 0.00
结束

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