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清胰陷胸汤抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD通路改善大鼠急性胰腺炎的作用及机制研究

申报人：杨书敬 申报日期：2025-03-12

基本情况

2025创新项目
清胰陷胸汤抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD通路改善大鼠急性胰腺炎的作用及机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
中药学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP) 是一种发病率逐年攀升的急性腹部疾病。已有大量研究显示，AP发生时伴随的是一种触发炎症反应的细胞死亡方式。临床上常采用立即禁食水、持续胃肠减压等方法治疗，但易引起继发性感染、腹膜炎等并发症，疗效欠佳。 中医学上，常采用清、下、通法，结合病因病机辨证论治。清胰陷胸汤由大黄、黄芩、川芎、枳实、白芍、芒硝和炙甘遂组成，具有通里攻下、凉血祛瘀的功效，是临床上的常用方。以网络药理学结合动物实验研究发现，清胰陷胸汤改善AP与调控炎症因子水平以及参与细胞程序化死亡的正向调节有关，细胞焦亡是一种新型细胞程序性死亡，其表现出以NOD样受体蛋白3（NLRP3）为关键靶通路，严重依赖半胱天冬酶（Caspase）家族成员为主要生物学特征，对细胞炎症及免疫调节具有重要意义。 本项目进一步开展动物实验，基于细胞焦亡信号通路探究清胰陷胸汤改善AP的作用机制，旨在为指导AP的治疗以及清胰陷胸汤的临床应用提供实验基础和理论依据。
无
（1）基于TLR4介导的炎性损伤探究葛根素干预高脂饮食/慢性应激诱导抑郁症的作用及其机制，国家自然科学基金，81903824，主持，已结题，2020.01-2022.12。
（2）基于炎性代谢损伤探究抗抑郁新靶点及经典名方二次开发，山东省高等学校青年创新团队， 2023KJ264， 在研 ，2024.01.01-2026.12.31。
（3）基于微生物-肠-脑轴探讨葛根芩连汤对炎症性肠病和抑郁症“异病同治”的效应物质及抗炎免疫机制，山东省中医药科技项目面上项目，M-2023011，2023.08-2025.07。
       本项目选题新颖、立题合理，是在前期研究的基础上提出的，所得结果将为清胰陷胸汤的临床应用提供实验依据和理论依据，为急性胰腺炎的治疗提供新思路，具有较强的学术价值和临床转化意义，完全支持本项目的开展。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
杨书敬 药学院 药物制剂（本科） 2023 动物实验
朱萌蕊 药学院 中药学（本科） 2022 网络药理学分析和药效学研究
甄文硕 药学院 临床药学（本科） 2024 动物实验
梁文骏 药学院 中药学（本科） 2023 数据统计分析
赵毅瑾 药学院 药学（本科） 2022 分子机制研究

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
高丽娜 药学院 否

立项依据

       本研究拟采用网络药理学联合动物实验研究的形式，通过现代分子生物学技术，揭示清胰陷胸汤（Qingyi Xianxiong Decoction, QXD）的多靶点、多途径治疗作用，并探究QXD改善大鼠急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）的作用机制，旨在为指导AP的治疗以及清胰陷胸汤的临床应用提供实验基础和理论依据。
1. 清胰陷胸汤冻干粉的制备

       称取大黄30 g、黄芩30 g、川芎24 g、枳实24 g、白芍24 g、炙甘遂3 g，以10倍量水浸泡30 min后煎煮40 min，过滤药渣，得到第一次滤液；第二次后再以10倍量水煎煮40 min，过滤，合并2次滤液浓缩至165 mL，将其于冷冻干燥机下冻干得冻干粉35.3797 g，收集后置于4℃冰箱冷藏备用。

2. AP建模与给药

       将体重约为200 g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，适应性喂养7天（温度为23～26℃，相对湿度为45～55%，12 h/12 h光照-黑暗循环），为提高动物实验成功率、降低因动物个体差异导致的结果重复性差，动物实验每组设10只。将50只SD大鼠随机分为5组：CTL组、AP组、QXD组（按照成人的服用剂量换算成大鼠的剂量为7 g/kg）、MCC950组（20 mg/kg）和VX-765组（50mg/kg），每组10只。QXD组大鼠每天接受灌胃一次清胰陷胸汤，连续给药4天，末次给药2 h后进行造模。通过向大鼠腹腔内注射20% L-精氨酸（2.5 g/kg，注射2次，间隔1 h），构建体内AP模型，CTL组注射等量生理盐水。MCC950组和VX-765组于造模前1 h一次性分别腹腔注射MCC950和VX-765。末次给药后，观察大鼠的行为表现，若观察到大鼠腹部出现显著的收缩现象，并且其行为异常，表现出痛苦状态，这将成为评估AP模型建立成功与否的重要参考依

3. QXD对大鼠AP的影响

（1）大鼠胰腺指数评价

        制备AP模型24 h后进行取材，用生理盐水冲洗去除血污后精确称量胰腺湿重并计算胰腺指数，公式如下：
                                                                    summernote-img
（2）ELISA和酶活性检测

        按照商品化试剂盒操作，检测大鼠胰腺组织和血清中白介素-18（Interleukin-18，IL-18）和IL-1β的蛋白含量，检测大鼠胰腺组织中caspase酶活性。实验结果以组织重量进行校正（ng/mg蛋白或RLU/mg蛋白）。

4.QXD改善AP的分子机制预测

（1）网络药理学

       通过TCMSP数据库，以OB≥30%，DL≥0.18作为条件，筛出大黄、黄芩、川芎、枳实、白芍、芒硝和炙甘遂的有效成分，并获取成分靶点，通过PubChem数据库检索2D结构和SMILES编号在SwissTargetPrediction数据库预测成分潜在靶点，通过Gennecards数据库获取AP疾病靶点导出后去重，整理有效成分靶点、获取交集基因并绘制Venn图。通过Cytoscape软件，制作“药物-成分-靶点”网络，根据degree值筛选关键成分，通过关键成分的靶点基因与交集基因再取交集得到关键靶基因，联合STRING和Cytoscape软件制作PPI网络，根据degree值得到关键靶点，进行GO功能和KEGG通路富集分析。

（2）分子对接验证

       从TCMSP数据库中检索并下载mol2格式的SP的分子结构式。从RCSB蛋白质结构数据库（protein data bank,PDB）数据库下载核心靶点的蛋白结构，将其导入Pymol 2.5.5进行预处理（去除水分子、配体化合物、金属离子等）后保存为“pdb ”格式文件。利用AutoDock 4.2.6对SP加全氢并选为配体，对核心靶点加全氢、选为受体并检测扭转键，准备对接盒子，运行Autogrid和Autodock，设置参数Number of GA Runs为 50, Maximum Number of evals为 2600000, Maximum Number of top individuals为 30000，综合考虑结合自由能和氢键数量，选取优势结合构象存储为“pdbqt”格式文件 。利用OpenBabel 2.4.1-x86 将其转化力“pdb”文件 ，用PLIP网站查看对接方式并下载“pse”文件，进而通过Pymol2.5.5进行可视化分析。

5.QXD改善大鼠AP表型的作用机制研究

（1）Real time RT-PCR

       按照试剂盒操作，使用TRIeasyTM总RNA提取试剂提取总RNA。随后，使用cDNA合成SuperMix（gDNA digester plus）去除残留的基因组DNA并将其逆转录成cDNA。最后，使用SYBR Green system在ABI 7500 PCR系统上进行real time RT-PCR扩增。GAPDH、NLRP3、Caspase-1 和GSDMD的引物序列示于表 1 中。每份样品重复分析三次。在扩增过程中生成熔解曲线，以验证是否存在引物二聚体或非特异性扩增。根据GAPDH表达量校正后，采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对mRNA表达量。
                                                                            表1 Real time RT-PCR 寡核苷酸序列
                                              summernote-img

                                          
（2）Western blotting

       取胰腺组织，按照RIPA裂解液：25×蛋白酶抑制剂=25：3 进行匀浆、离心取上清，获得蛋白样本。采用商品化BCA试剂进行蛋白定量分析，并制备4 μg/μL的上样样品。制备10% SDS-PAGE凝胶进行电泳（条件为600 mA，130 V，90 min），并将结果转移到PVDF膜上（条件为300 mA，600 v，30 min）在后续步骤中，首先使用含有5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水-吐温20（PBST）溶液，在室温下对PVDF膜进行2小时的封闭处理。随后，将PVDF膜与一抗，包括GSDMD（1:1000 稀释）、caspase-1（1:1000 稀释）、NLRP3（1:1000 稀释）以及α-Tubulin（1:8000 稀释），在4℃环境下进行孵育过夜。完成孵育后，使用TBST溶液对膜进行3次洗涤，每次持续10 min。紧接着，将膜与相应种属的二抗在室温条件下共同孵育1小时，之后再次使用TBST溶液进行3次洗涤，每次10 min。最后，ECL显色后将膜曝光成像。使用ImageJ软件对Western blotting条带的灰度值进行半定量分析。

（3）免疫荧光（IF）染色

      将石蜡切片恢复至室温后，使用二甲苯脱蜡3次，每次15 min，之后依次使用无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇和50%乙醇进行至水处理，蒸馏水洗涤2次，每次5 min。加入0.1% Triton X-100破膜10 min，然后使用PBS溶液洗涤3次，每次3 min。随后使用含有5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水-吐温 20（PBST）溶液，进行室温30 min 的封闭处理。随后，进行一抗孵育，包括NLRP3（1：200 稀释）、caspase-1（1：200 稀释）和GSDMD（1：500 稀释），在4℃环境下置于湿盒内孵育过夜。完成孵育后，使用PBS溶液洗涤3次，每次3 min。随后将组织切片与荧光二抗在室温条件下避光孵育50 min，之后再次使用PBS溶液进行3次洗涤，每次3 min。最后，滴加含有DAPI的抗荧光淬灭剂封片剂进行封片，加固。稍干后，使用激光共聚焦显微镜观察大鼠NLRP3、caspase-1 和GSDMD表达情况。在400×视野下每组随机选取3个胰岛视野，使用ImageJ软件对其相对荧光强度进行半定量分析。
1.AP概述

       急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一种常见的急性腹部疾病，是由于胰腺酶的刺激释放大量的炎症介质和细胞因子进入胰腺和血液循环，导致过强的炎症反应和异常的免疫引起肠粘膜损伤，造成肠道细菌易位，加重全身感染。早期发展阶段难以预测，总发病率逐年攀升[1]。关于诱发AP的病因，中西研究具有一定差异性，在我国主要以胆石症及胆道疾病为主，而西方国家主要与酗酒有关。此外，胰管疾病、滥用药物、缺血损伤、暴饮暴食等也是引起AP的重要原因。在长期探索AP发病机制的研究中形成了诸多假说，如“胰酶异常激活假说”、“自身消化假说”、“胰腺微循环障碍假说”、“炎症介质假说”以及“钙超载假说”[2]等，但具体发病机制尚未完全阐明。临床上主要采用立即禁食水、抑制胃酸和胰液分泌、静脉输液支持以及持续胃肠减压等方式缓解AP的进展，但并不能有效治愈 AP[3]。
       近年来，中药多成分、多靶点、多机制的特点在治疗AP方面展现了突出的优势，不仅能显著改善AP患者的临床症状，如腹痛、恶心等，还有助于降低并发症的发生率[4]。因此，中药治疗AP既能减轻患者的痛苦，又能缩短治疗周期，减轻医疗系统和患者的经济负担。本文旨在探究中药治疗AP的活性物质基础和作用机制，以期为指导AP的治疗提供实验基础和理论依据。

2.AP的中医学理论

       中医学上虽然未明确AP的名称，但根据患者出现的腹痛、腹胀等症状，认为其病位在脾，与肝、胆、胃密切相关，并涉及心、肺、大小肠等[5]。AP的病因包括（1）饮食不节、虫石内积，以致胆道不畅；（2）情志不舒、外邪侵袭致湿、热、瘀内阻于胰，气机不畅[6]。此外，脾胃功能失调，消化功能减弱，营养摄取不足也是诱发A 的病因之一[7]。在AP的急性期，患者常表现出多种证型，如结胸里实证、肝胆湿热证、腑实热结证和内闭外脱证。随着疾病进展，又会出现肝郁脾虚证、气阴两虚证等。治疗上，采用清、下、通法辨证论治，遵循通腑泄浊、清热解毒、活血散瘀、行气止痛的基本原则。通过改善胰腺微循环，抑制体内炎症反应，进而有助于保护肠道粘膜屏障和稳定机体内环境，从而显著改善患者的治疗预后。

3.中药治疗AP的作用机制

（1）中药复方
       

      临床上，中药复方可针对AP的不同证型，提供多种精准治疗策略，如大承气汤具有峻下热结的功效，主要用于治疗腑实热结型AP；柴芩承气汤具有清肝解郁、通腑行气的功效，主治肠痈；大黄牡丹汤泻热破瘀、散结消肿，主治肠痈初起，用于湿热瘀滞证、肝胆湿热型AP；清胰汤功以疏肝理气、泻火攻实为主，用于少阳、阳明合证型AP，尤善于治疗急性出血型AP；清胰陷胸汤具有疏肝理气、通里攻下的功效，主要用于治疗急性水肿型AP；茵陈蒿汤则倾向于治疗肝胆湿热型AP。
       不同中药复方在改善AP方面的作用机制各有异同。如表2 所示，改善肠粘膜屏障功能、调控炎症免疫反应是其共有机制，通过减轻胰腺的炎症反应和肿胀和提高机体免疫力，改善胰腺微循环和肠道菌群失调，以促进胰腺功能的恢复。此外，大承气汤侧重于抑制炎症介质的表达、抑制肺组织毛细血管通透性和肠粘膜 屏障[8,9] 。 也有研究报道大承气汤通过上调肌浆网钙泵蛋白2（ ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ transporting 2，SERCA2）的mRNA表达，增强SERCA活性，降低胰腺腺泡细胞钙离子超载，改善AP[10]；清胰汤则侧重于调节肠道菌群和腺苷酸活化蛋白激酶/核因子-κB/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（AMP-activated protein kinase/nuclear factor-κB/NOD-like receptor thermal proteindomain associated protein 3，AMPK/NF-κB/NLRP3）通路[13]；柴芩承气汤和大黄牡丹汤则能抑制细胞凋亡[10,11]；清胰汤[12]主要作用于NLRP3介导的炎性损伤。大黄牡丹汤能改善胰腺微循环，减轻胰腺的缺血、缺氧状态，从而减轻炎症反应和胰腺损伤[11]。茵陈蒿汤源自张仲景的《伤寒杂病论》，可显著改善患者腹胀、腹痛症状且肠鸣音恢复时间缩短，其作用机制与抑制自噬受体蛋白- Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白 1-核因子E2 相关因子 2（p62-Kelch-like ECH-associatedprotein 1-nuclear factor erythroid 2-related factor 2，p62-keap1-Nrf2）信号通路，减少氧化应激二号炎症反应，从而减轻胰腺损伤，还能抑制病原菌生长和繁殖，减轻胰腺感染和炎症反应[14,15]。
                                                                表2 临床常用中药复方改善AP的组成、功效和作用机制
                                             summernote-img
    
                                                            
注：CRP：C反应蛋白；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-8：白介素-8；NLRP3：NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白 3；IL-6：白介素 6；IL-1β：白介素-1β：p62：自噬受体蛋白；keap1：Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白 1； Nrf2：核因子E2 相关因子2。

（2）中药及其活性成分

       中药大黄中黄酮类、蒽醌类、番泻苷类、大黄多糖等提取成分均具有抗炎作用，是其改善AP的主要物质基础[16]，通过抑制TLR4-MAPK-NF-κB信号传导发挥抗炎作用。白芍中含有白芍苷、牡丹酚、白芍花苷、鞣质、β-谷甾醇等多种化学成分，具有镇痛镇静、抗炎抗溃疡及调节免疫功能等多种生物活性，有助于改善AP。其中，白芍苷通过抑制单核细胞的噬菌作用、前列腺素E2（PGE2）和TNF-α的产生以及HIA-DR和CD80的表达缓解慢性炎症[17]。萜类是由异戊二烯或异戊烷连结而成的天然化合物，三萜类成分能够抑制脂多糖（LPS）诱导的大鼠炎症介质的释放，降低炎症因子的表达。例如，清胰陷胸汤中所含的齐墩果酸、大戟醇、白桦脂酸、柠檬苦素回等三萜类成分是其发挥抗炎和免疫调节作用，改善AP的重要物质基础。此外，α-柏木烯、广藿香烯等倍半萜类化合物通过抑制NF-κB、MAPKs和STAT等信号通路，下调TNF-α、PGE2、NO、IL-1β、IL-6和IL-8等炎性因子的表达，发挥抗炎作用[18]，也是清胰陷胸汤改善AP的关键成分。

参考文献：
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1.从NLRP3/caspase-1/GSDMD通路探究QXD改善大鼠急性胰腺炎的作用机制，国内外未见报道，是本项目的创新之处。
2.采用网络药理学联合动物实验干湿结合的方式，联合通real time RT-PCR-ELISA-Western blotting-免疫荧光染色和等现代分子技术，鉴定胰腺组织中关键靶点的基因和蛋白表达以及信号通路中关键酶的活性，揭示QXD治疗大鼠AP的分子信号通路是本项目的特色。
1.技术路线：

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2.拟解决的问题：
       采用网络药理学联合动物实验研究的形式，通过现代分子生物学技术，揭示QXD的多靶点、多途径治疗作用，并探究QXD改善大鼠AP的作用机制，旨在为指导AP的治疗以及清胰陷胸汤的临床应用提供实验基础和理论依据。
3.预期成果：
①明确清胰陷胸汤对精氨酸诱导大鼠AP的保护作用；
②初步揭示清胰陷胸汤改善大鼠AP的分子机制，尤其关注清胰陷胸汤对NLRP3/caspase-1/GSDMD通路介导的细胞焦亡的影响，阐明其作用机理；
③发表高学术论文1篇。
网络药理学分析和已取得的体内动物实验结果显示清胰陷胸汤抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD通路改善大鼠急性胰腺炎，提示本项目具有可行性，项目团队成员组成合理，具备完成本项目的所有实验技术，可以保证实验的顺利完成以及论文的按期发表。

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与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

（1）QXD干预AP的潜在靶点和分子信号通路分析

       如图1所示，采用网络药理学技术共获取QXD的关键成分158个、对应靶点697个。AP的疾病靶点5466个，其中QXD和AP的共有靶点313个，主要包括AKT1、TNF、CASP3、TP53、IL-6、SRC、BCL2、PPARG、PTGS2、MMP9、FOS等。如图2所示,GO功能富集分析的BP气泡图显示QXD干预AP与程序性细胞死亡的积极调节密切相关,KEGG分析显示QXD改善AP的分子信号通路包括p53、PI3K/AKT、apoptosis和IL-17等分子传导途径，提示QXD主要通过调控炎症、细胞增殖和凋亡等发挥作用。细胞焦亡是一种新型细胞程序性死亡，以NOD样受体蛋白3（NLRP3）为关键靶通路，依赖含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）家族成员为主要生物学特征，调控细胞炎症及免疫反应[7]。当细胞受到刺激后，炎症小体“感受器”识别并结合“危险信号”，激活下游组装形成NLRP3复合物，进而激活下游caspase-1剪切消皮素-D（GSDMD），形成具有活性的N端片段，并在细胞膜上聚集形成膜孔[8]；此外，caspase-1还可以剪切下游的pro-IL-1β和pro-IL-18，合成IL-1β和IL-18，使其从GSDMD-N端片段形成的膜孔释放到细胞外，产生炎症级联反应[9]。因此，从炎症和细胞焦亡角度探索QXD改善AP的作用机制有望为揭示其分子机制提供新视角。
                                               summernote-img                                                                                图1 QXD-AP网络药理学分析
                                    （A）QXD关键成分-靶点图、（B）QXD-AP靶点Venn图、（C）QXD-AP关键靶点图
                                                             
                                       
                   summernote-img                   
                                                                              图2 QXD-AP关键靶点富集分析图
                                                                         (A)GO功能图 、 (B) KEGG信号通路图
（2）QXD对大鼠AP的治疗作用

① QXD降低AP大鼠胰腺指数
       胰腺指数可以反映大鼠胰腺组织的肿胀程度，与炎症反应密切相关。如表3所示，与CTL组比较，AP组大鼠胰腺指数显著升高（P<0.01）；而给予QXD、MCC950或VX-765干预后大鼠胰腺指数显著降低（P<0.05），其中QXD组和MCC950组下降趋势极显著（P<0.01）。结果表明，QXD、NLRP3抑制剂MCC950和caspase-1抑制剂VX-765均可以降低AP大鼠的胰腺指数。
                                                              表3 QXD对大鼠胰腺指数的影响（均值±S.E.M，n=7）
                                          summernote-img
                                                         注：与CTL组比较，##P<0.01；与AP组比较，*P<0.05，**P<0.01。
② QXD改善AP大鼠胰腺组织病理损伤
       AP的发生发展伴随着大量炎症因子的释放，以胰腺局部炎症反应为主要特征，其中胰岛以及胰岛细胞的变化最为直观。如图3所示，CTL组大鼠胰腺组织结构正常，胰岛形状规则，边界清晰。AP组大鼠胰岛形状不规则，变形受损严重，边界模糊，胰岛细胞数量显著减少（P<0.01）。与AP组比较，QXD组、MCC950组和VX-765组大鼠的胰岛形态规则化，且胰岛细胞数量明显增加，其中QXD组的胰岛细胞数目变化极为显著（P<0.01）。综上所述，QXD能明显改善L-精氨酸诱导的AP大鼠胰腺组织结构损伤。
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                                                                         图3 QXD对AP大鼠胰腺组织病理损伤的影响

采用ImageJ软件统计分析，数值表示为均值±S.E.M（n=3，n为400×视野个数）。与CTL组比较，##P < 0.01；与AP组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。

③ QXD抑制IL-18和IL-1β的合成
       IL-1β和IL-18是典型的促炎细胞因子，参与一些炎症和自身免疫性疾病的进展，同时也是细胞焦亡的产物。对大鼠血清和胰腺组织中IL-1β和IL-18蛋白含量检测结果如图4所示，与CTL组相比，AP组大鼠血清和胰腺组织中IL-1β和IL-18的蛋白含量显著增多（P<0.01），说明胰腺组织中发生了严重的炎症反应和焦亡损伤。然而与AP组相比，QXD组、NLRP3抑制剂MCC950组和caspase-1抑制剂VX-765组血清和胰腺组织中IL-1β和IL-18的蛋白含量显著减少（P<0.05，P<0.01），说明QXD具有与NLRP3和caspase-1抑制剂相似的抗炎、抗焦亡作用。

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                                                    图4 QXD对AP大鼠血清和胰腺组织中IL-1β和IL-18蛋白含量的影响

        血清中(A)IL-1β和（B）IL-18以及胰腺组织中（C）IL-1β和（D）IL-18的蛋白含量。与CTL组比较，##P< 0.01；与AP组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

（3）QXD抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路改善AP

      IF结果如图5-7所示，与CTL组比较，AP组大鼠胰腺组织胰岛中NLRP3、caspase-1和GSDMD的免疫荧光强度均显著增强（P<0.05）；与AP组比较，QXD组、MCC950组和VX-765组大鼠胰腺组织内胰岛中NLRP3、caspase-1和GSDMD免疫荧光强度显著减弱，提示药物干预可抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD信号传导（P<0.05，P<0.01）。

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                                                      图5 QXD对胰腺组织中NLRP3原位表达的影响

（A）NLRP3免疫荧光代表图、（B）NLRP3荧光强度分析图。采用ImageJ软件对胰腺组织的免疫荧光强度进行半定量分析，数值表示为均值±S.E.M

（n=3，n为400×视野个数）。与CTL组比较，#P<0.05；与AP组比较，*P<0.05，**P<0.01。

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                                                   图6 QXD对胰腺组织中Caspase-1原位表达的影响

（A）Caspase-1免疫荧光代表图、（B）Caspase-1荧光强度分析图。采用ImageJ软件对胰腺组织的免疫荧光强度进行半定量分析，数值表示为均值±S.E.M

（n=3，n为400×视野个数）。与CTL组比较，#P<0.05；与AP组比较，*P<0.05，**P<0.01。

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                                                     图7 QXD对胰腺组织中GSDMD原位表达的影响

（A）GSDMD免疫荧光代表图、（B）GSDMD荧光强度分析图。采用ImageJ软件对胰腺组织的免疫荧光强度进行半定量分析，数值表示为均值±S.E.M

（n=3，n为400×视野个数）。与CTL组比较，#P<0.05；与AP组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Western blotting检测结果如图8所示，与CTL组比较，AP组大鼠胰腺组织NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白表达水平显著升高（P<0.05，P<0.01）；与AP组比较，QXD组、MCC950组和VX-765组的NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。同样地，我们采用real time RT-PCR实验验证了QXD可抑制NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA表达，其作用效果与NLRP3和caspase-1抑制剂的作用效果相当。综上可知，QXD对AP的改善作用与调控NLRP3/caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡信号通路密切相关。         

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                                       图8 QXD对胰腺组织中NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白和mRNA表达的影响

（A）NLRP3、（B）caspase-1和（C）GSDMD的蛋白表达条带代表图和灰度值分析图；（D）NLRP3、（E）caspase-1和（F）GSDMD的mRNA表达。数值

表示为均值±S.E.M（n=3）。与CTL组比，#P<0.05，##P<0.01；与AP组比，*P<0.05，**P<0.01。


已具备的条件：申请人所在的济宁医学院拥有多个山东省重点实验室，具备病理学、细胞和分子生物学、生物化学和药学等多个研究平台。拥有的主要仪器有：激光共聚焦显微镜、超灵敏多功能成像系统、免疫荧光倒置显微镜和成像系统、荧光定量PCR 仪、PRISM7500PCR扩增仪、多功能检测仪、高速冷冻离心机、动物抑郁行为分析系统和动物轨迹分析系统等。拥有SPF级动物房（SYXK（鲁）2018 0002）可以保障本项目所需要的实验动物的饲养。完备的实验室条件、严谨的科研管理制度以及实验时间的协调合作，保证实验的顺利进行。
尚缺少的条件：无
拟解决途径：无

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 17000.00 3000.00
1. 业务费 6000.00 无 6000.00 0.00
（1）计算、分析、测试费 6000.00 病理检测 6000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 0.00 无 0.00 0.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 14000.00 购买大鼠3500元、药材饲料垫料500元、试剂盒3000元、抗体6000元、其他相关试剂耗材1000元。 11000.00 3000.00
结束

用户单位： 济宁医学院        

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