济宁医学院 大学生创新创业训练计划管理系统

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番茄生长素响应基因SlIAA26的分离及功能研究

申报人：和静蕊 申报日期：2025-03-11

基本情况

2025创新项目
番茄生长素响应基因SlIAA26的分离及功能研究 学生申报
创新训练项目
理学
生物科学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
生长素是重要的植物激素，而IAA基因是生长素早期响应基因，本项目聚焦番茄生长素响应基因SlIAA26，旨在深入解析其功能。通过分子生物学技术，从番茄中分离出SlIAA26基因，明确其序列特征。利用基因编辑技术构建过表达和敲除该基因的番茄株系，系统对比野生型与转基因株系在生长发育各阶段的表型差异，如种子萌发、植株高度、叶片形态、开花时间及果实发育等。同时，借助转录组学和蛋白质组学等手段，分析SlIAA26调控的下游基因和信号通路。预期成果将揭示SlIAA26在番茄生长发育中的作用机制，为通过基因改良提高番茄产量和品质提供理论依据和技术支持，具有重要的科学意义和应用价值。

省级大学生创新创业训练计划：心脏靶向递送miRNA的工程化细胞外囊泡在防治心肌损伤中的作用研究（S202410443046），2024.1-2026，6/6

日照市自然科学基金：番茄SlDREB3转录因子的抗冷性作用机制研究（RZ2021ZR19），2022.1-2024.12，主持

山东省自然科学基金：番茄SlNAC35的抗冷性作用机制研究（ZR2018BC032），2018.3-2020.12，主持

国家自然科学基金：拟南芥硝酸调控基因NRG2.10的功能研究（31700211），2018/01-2020/12，参加 
    本项目设计合理，方法可行，同意申请。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
和静蕊 生命科学学院 生物信息学（本科） 2023 植物材料培养
陈冉冉 生命科学学院 生物信息学（本科） 2023 相关逆境基因分析
尹兆伟 生命科学学院 生物工程（本科） 2023 植物材料处理
高家栋 生命科学学院 生物工程（本科） 2023 功能分析
张沁岚 生命科学学院 生物信息学（本科） 2023 生理指标测定
王路铭 生命科学学院 生物工程（本科） 2023 互作蛋白筛选

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
王国栋 生命科学学院 否

立项依据

    番茄（Solanum lycopersicum），属于茄科茄属，不仅是一种重要的果蔬，口感清爽、风味独特，还是一种重要的模式植物，用于基因和植物器官生长发育的研究。番茄果实营养丰富，既可以当蔬菜烹饪后熟食，也可以直接食用其鲜果。番茄植株属于喜温不耐热作物，通常适宜在白天温度为20 ℃~25 ℃，夜间温度为15 ℃~18 ℃的条件下生长，当温度低于10 ℃时番茄的生长就开始变得缓慢，若温度进一步降低，番茄则会停止生长乃至冻伤冻死[1]。番茄在我国分布范围广泛，富含多种营养物质，是我国重要的果蔬作物之一。
    在植物生长发育过程中，生长素起着至关重要的作用，生长素（auxin，IAA）是最早被人类发现的一类激素，在对植物器官生长发育的影响过程中表现出非常明显的浓度梯度效应，即低浓度的生长素促进生长，高浓度的生长素抑制生长[2]。生长素影响作用广泛，不仅参与了植物细胞，器官的生长发育而且还参与植物许多生理过程的调控，在细胞分化、种子生长、根系侧根发生、顶端优势和果实发育中具有重要作用。
     IAA是一种内源活性生长素，是一种有机化合物，在植物体内只需要很小的剂量变化就可以调节植物生长发育过程，可以识别相关信号，转导信号，响应信号，间接的去调控基因的表达，从而达到对植物细胞生长发育调控的作用。能够响应生长素信号的生长素早期响应基因家族分别为：生长素/吲哚-3-乙酸基因家族（Aux/IAA）、生长素上调小RNA基因家族（SAUR）和生长素酰胺合成酶基因家族（GH3）三大基因家族，它们能够在生长素的信号传导过程中，在很短的时间内响应生长素的诱导[3]。早期生长素反应的响应基因家族中，生长素/吲哚-3-乙酸（Aux/IAA）基因家族对生长素的调节作用极其重要。因此，分离和鉴定IAA响应基因，研究其在番茄生长发育中的作用机制，为通过基因改良提高番茄产量和品质提供理论依据和技术支持，具有重要的科学意义和应用价值。 
（1）SlIAA26基因的生物信息学分析：通过生物信息学分析SlIAA26基因的结构和在染色体定位。对蛋白质的理化性质、保守结构域、定位等预测。
（2）SlIAA26基因的克隆和载体的构建：对番茄SlIAA26基因进行克隆，分别构建定位载体、过表达载体和基因敲除载体。
（3）定位分析: 提取拟南芥原生质体，将pEZS-NL-SlIAA26瞬时转化拟南芥原生质体，进行亚细胞定位。
（4）组织特异性分析：对SlIAA26基因在番茄根、茎、叶、花、果实等组织进行表达分析。
（5）遗传转化：通过叶盘转化法获得转基因番茄材料；通过花絮侵染法获得转基因拟南芥材料。
（6）转基因植株鉴定：通过PCR和qPCR方法鉴定转基因植株。
（7）SlIAA26基因的功能分析：
①诱导表达分析：不同浓度生长素处理下，SlIAA26基因的表达情况；b. 不同胁迫（盐、干旱、高温、低温）处理下，SlIAA26基因的表达情况。②正常条件下，分析过表达SlIAA26基因番茄、敲除突变体和WT的生长表型，改变生长条件（胁迫处理、不同浓度生长素处理），分析不同材料的生长表型；③检测不同材料的生理指标：鲜重、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合参数，ROS的积累、MDA、抗氧化酶活性等；株高、茎粗、叶片形态、开花时间、果实产量和品质等；④利用转录组测序，分析转SlIAA26基因上下游调控基因；⑤通过酵母双杂交、免疫共沉淀等技术，筛选和鉴定与 SlIAA26 蛋白相互作用的其他蛋白，构建蛋白相互作用网络。
    在拟南芥中，Aux/IAA基因家族共有29个成员，命名为AtIAA1-AtIAA29。前人研究证明：Aux/IAA基因家族对于拟南芥的生命活动具有重大意义，如参与调节拟南芥的生长发育，侧根形成，向性运动和耐旱调节[3]。例如：AtIAA28被观察到其在根和花序中显著表达。然而，在侧根形成的过程中，AtIAA28展现出了明显的缺陷，具体表现为侧根发育的受阻。这种受阻不仅体现在侧根数量的减少，还导致了植株整体高度的降低以及顶端优势度的减弱。这些现象暗示着AtIAA28在侧根发育的转录过程中受到了抑制，这种抑制进一步影响了侧根初始基因的功能发挥，最终造成了侧根发育的缺陷[4]。
    水稻是单子叶模式植物，其Aux/IAA基因家族共有31个成员，目前已证明水稻的Aux/IAA基因家族在植物的多个关键生长阶段和生理响应中扮演着至关重要的角色。这些角色包括但不限于根系的构建与扩展、叶片的形态与功能完善、植株整体形态的塑造，以及对抗干旱等非生物胁迫的适应能力。此外，该基因家族还显著影响着水稻的产量性状，为提升水稻产量提供了潜在的遗传资源[5]。例如：当OsIAA1在水稻中过表达时，这一变化显著降低了生长素原本对根系伸长的抑制效果。此外，转基因植株在过表达的情况下，呈现出显著的形态变异。包括植株高度的降低和整体结构的松散。OsIAA3转基因植株出现对生长素和重力刺激的响应变得不敏感，进而表现出叶片缩短、冠状根数量减少以及叶片发育异常的独特表型[6]。
    番茄中有36个Aux/IAA基因，分别命名为SlIAA1-SlIAA36[7]。如SlIAA9基因在叶片形态发生和果实发育中扮演着至关重要的角色。当该基因的表达水平出现下调时，番茄的叶片形态由原本的复叶结构逐渐向单叶转变。此外，这种基因表达的下调还导致转基因番茄植株的萼片出现不对称的现象，而且还影响叶片，花朵和果实的生长发育，证明SlIAA9基因参与番茄果实和叶片的生长发育[8]。前人研究发现SlIAA27基因被敲除后，会导致番茄植株对生长素的敏感度提高，影响植株的根系发育，还会使叶片中叶绿素的含量降低，若将SlIAA27基因进行抑制表达处理，发现番茄胚珠的育性和花粉的育性均呈现出显著的降低趋势，表明SlIAA27基因参与番茄的发育、生殖和根系、叶片发育[9]。SlIAA4基因在所有的组织中都有较高的表达量，说明SlIAA4基因对番茄的生长发育至关重要，尤其是叶片的形态发育和番茄花的发育[9]。
    本研究从番茄中成功克隆得到一个生长素早期响应基因，命名SlIAA26（Solyc08g062340），亚细胞定位预测SlIAA26定位于细胞质。同时，qRT-PCR初步分析表明，该基因受生长素诱导表达。将SlIAA26与含有35S启动子的pCAM1302载体重组，构建过表达拟南芥转基因植株。同时或得过表达番茄材料和敲除突变体材料。在上述研究基础上，探究SlIAA26在番茄生长发育中的作用机制。 
1. 新基因资源挖掘
    在番茄中，虽然已经对部分生长素响应基因有了一定研究，但 SlIAA26 是之前尚未被深入研究的基因。其分离填补了番茄生长素信号传导基因家族研究的空白，为番茄基因组学和分子遗传学研究提供了新的基因资源。
2. 生长素信号途径新机制
    通过对 SlIAA26 基因功能的深入研究，揭示了番茄生长素信号传导途径中一些之前未知的调控机制。可能发现该基因在生长素信号转导中的独特作用模式，如它可能与其他已知的生长素响应因子形成新的调控网络，或者在特定的生长发育阶段发挥关键作用，为理解植物生长素信号传导的精细调控提供了新的视角。
3. 与环境互作的新功能
    首次发现 SlIAA26 基因参与番茄对环境胁迫的响应过程。该基因在番茄应对干旱逆境条件时发挥关键作用，通过调节生长素信号传导来增强番茄的抗逆性。这一发现为培育具有更强环境适应性的番茄品种提供了新的理论依据和基因靶点。 
技术路线：

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拟阐明的关键科学问题为：
1. 解析 SlIAA26 蛋白是否参与生长素受体的识别、信号传递以及下游基因的调控等环节，明确其在生长素信号通路中的具体作用位点和作用方式。
2. 通过酵母双杂交、免疫共沉淀等技术，筛选和鉴定与 SlIAA26 蛋白相互作用的其他蛋白，构建蛋白相互作用网络，进一步揭示 SlIAA26 蛋白发挥功能的分子机制和调控网络。
3. 通过构建 SlIAA26 基因的敲除突变体和过表达植株，观察和分析其在株高、茎粗、叶片形态、开花时间、果实产量和品质等方面与野生型番茄的差异，明确该基因对番茄生长发育的具体调控作用。
预期成果:
1. SlIAA26 基因作为番茄遗传改良的分子靶点，基于对该基因功能的研究，评估其在提高番茄产量、改善果实品质、增强抗逆性等方面的应用潜力，为番茄的分子育种提供理论依据和基因资源。
2. 发表一篇高质量研究论文。 
本课题计划2年完成，研究计划如下 ：
（1）2025年6月-2026年5月
遗传转化：获得转基因番茄阳性植株。
对转基因拟南芥材料进行表型分析：分析萌发，幼苗生长情况，成苗生长表型、株高、茎粗、叶片形态、开花时间等。测定相关生理指标：叶绿素、鲜重、电导率、MDA、ROS及抗氧化酶活性。
（2）2026年6月-2027年5月
对转基因番茄材料进行表性分析：株高、茎粗、叶片形态、开花时间、果实产量和品质等。利用转录组测序，分析转SlIAA26基因上下游调控基因。
通过酵母双杂交、免疫共沉淀等技术，筛选和鉴定与 SlIAA26 蛋白相互作用的其他蛋白，构建蛋白相互作用网络。 
    本项目是在一定的研究基础上申请的：SlIAA26基因生物信息学分析显示，该基因全长1241bp，开放阅读框（ORF）864bp，287个氨基酸，理论等电点为9.05，相对分子量为31.93kD（图1A）；亚细胞定位于细胞核（图1B）；不含跨膜结构域，不属于跨膜蛋白（图1C）；蛋白结构主要由无规则卷曲和 α-螺旋结构构成（图1D）。同时，qRT-PCR分析表明，该基因在番茄根、茎、叶、花和果实中均有表达，其中茎和果实中表达量相对最高（图2A），且受IAA的诱导表达（图2B）。其次，SlIAA26基因已被成功地从番茄中分离克隆，并构建了植物表达重组载体（图3），对拟南芥进行了遗传转化，获得了T0代转基因种子（图4）。这些结果的获得为本项目的开展奠定了初步的实验基础。 
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图1 SlIAA26基因的生物信息学分析
A理论等电点和相对分子量预测；B亚细胞定位预测；C跨膜结构域分析；D蛋白质三维结构预测 
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图2SlIAA26基因组织特异性表达和生长素诱导表达分析
A SlIAA26基因在番茄不同组织中的表达；B SlIAA26基因在番茄根茎叶中受到生长素的诱导表达
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 图3 SlIAA26基因的克隆与植物表达载体的构建
A基因克隆；B pMD19-T-SlIAA26大肠杆菌筛菌；CpMD19-T-SlIAA26与pCAMBIA1302空载双酶切；D pCAMBIA1302-SlIAA26重组大肠杆菌筛菌；E pCAMBIA1302-SlIAA26重组质粒酶切鉴定；F pCAMBIA1302-SlIAA26重组质粒转化农杆菌3101筛菌 
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图4 T0代转基因拟南芥及种子
    生物科学实验教学中心拥有近5000 万元的仪器设备，如植物光照培养箱，紫外分光光度计，PCR仪，荧光定量PCR，激光共聚焦显微镜等仪器，超净工作台，并建有植物组织培养室和植物光照培养室，为该项目的顺利完成提供平台。
    本项目参与者为2023级生物工程、生物信息学专业学生，有基本的植物学、生物化学及分子生物学相关知识和实验技能，能顺利开展本项目。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 10000.00 无 6000.00 4000.00
1. 业务费 4000.00 无 2000.00 2000.00
（1）计算、分析、测试费 2000.00 引物合成、测序 2000.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 2000.00 无 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 6000.00 无 4000.00 2000.00
结束

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