1.金腰乙素属于多甲氧基化黄酮类化合物，此图为多甲氧基化黄酮类化合物分子示意图
主要从以下几个方面开展研究：
① 诱导细胞凋亡：可调节Bcl-2家族蛋白，使促凋亡蛋白Bax等表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2等表达下调，改变二者比例，促使细胞色素C释放，激活caspase级联反应，诱导癌细胞凋亡。接下来，我们将通过流式细胞术检测凋亡率，并利用CRISPR-Cas9技术或shRNA技术敲除/敲低Bax基因验证其特异性调控机制。
② 抑制细胞增殖：前期研究发现金腰乙素能将癌细胞周期阻滞在G0/G1、S或G2/M期，阻止细胞进入分裂期。以及干扰细胞信号通路：阻断PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK等促增殖信号通路，减少增殖相关蛋白表达与活性。本研究我们将结合RNA-seq筛选周期调控核心靶点，并通过EdU染色和Transwell实验量化增殖抑制效果。
③ 抑制肿瘤血管生成：减少血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等血管生成因子的分泌与活性，降低其对血管内皮细胞的刺激。抑制内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。本研究中，本研究中，将建立鸡胚绒毛尿囊膜模型观察血管新生抑制，并采用ELISA检测荷瘤小鼠血清中VEGF浓度动态变化。
2.我们团队已经开展的研究内容：
①利用不同浓度金腰乙素处理多种膀胱癌细胞系（如T24、5637等），通过CCK - 8法、EdU掺入实验等检测细胞增殖能力变化明确了金腰乙素对膀胱癌细胞增殖的抑制效果及浓度 - 效应、时间 - 效应关系。
通过荧光染色和柱状图可以发现，随着金腰乙素浓度的增加，细胞增殖受到明显抑制，且这种抑制作用具有浓度依赖性，且金腰乙素可以成浓度依赖性的方式抑制癌细胞的DNA的复制速率。
② 诱导凋亡作用：借助流式细胞术（Annexin V - FITC/PI双染）区分早期和晚期凋亡细胞，检测Caspase家族蛋白（如Caspase - 3、 - 8、 - 9）活性及相关凋亡调控蛋白（Bcl - 2、Bax等）表达，确定金腰乙素诱导膀胱癌细胞凋亡的作用及分子途径。
③ 迁移侵袭能力：运用Transwell小室实验、划痕愈合实验评估金腰乙素对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响，检测上皮 - 间质转化（EMT）相关蛋白（E - cadherin、N - cadherin、Vimentin等）表达，明确了其对EMT过程的作用。根据实验得到以下图：
从这组结果图我们可以看出，随着金腰乙素浓度的升高，膀胱癌细胞的细胞膜和细胞核的形态逐渐发生显著变化，癌细胞从正常的生理状态逐渐向受损、形态异常的方向发展，提示金腰乙素对细胞具有浓度依赖性的影响，可能干扰了癌细胞的正常结构和功能，因此，金腰乙素可以抑制癌细胞增殖，阻止其正常发挥作用，诱导其凋亡。
通过上述这张KEGG通路富集分析的条形图可以直观地展示了不同KEGG通路的富集情况以及相关蛋白的数量。可以看出，与癌症相关的通路（如“Pathways in cancer”）和细胞生长死亡相关通路（如“Cell cycle”）涉及的蛋白数量相对较多，同时，运用运用Transwell小室，进行细胞迁移与侵袭实验可以判断出金腰乙素处理后，膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力明显下降，表明其能有效抑制癌细胞的转移能力，降低膀胱癌的恶性程度。
3.我们团队进行了动物水平方面的研究和分子机制研究
① 将膀胱癌细胞接种于裸鼠或免疫缺陷小鼠皮下，建立膀胱癌荷瘤模型。给予不同剂量金腰乙素灌胃或腹腔注射，设置对照组（给予等量溶剂），观察小鼠肿瘤生长情况，测量肿瘤体积和重量，绘制肿瘤生长曲线，评估金腰乙素体内抗肿瘤效果。在动物实验过程中，定期检测小鼠体重、血常规、肝肾功能指标（如ALT、AST、BUN、Cr等），观察小鼠行为、饮食等一般状况，判断金腰乙素的体内毒性和安全性。
②信号通路调控：通过Western blot、PCR等技术，检测与膀胱癌发生发展密切相关的信号通路（如PI3K/AKT、MAPK/ERK、Wnt/β - catenin等）中关键蛋白和基因的表达与磷酸化水平，探究金腰乙素是否通过调控这些信号通路发挥抗膀胱癌作用。
③ 基因表达谱分析：运用RNA - seq、基因芯片等技术，分析金腰乙素处理前后膀胱癌细胞的基因表达谱变化，筛选差异表达基因，进行生物信息学分析（如GO富集分析、KEGG通路分析）。靶点验证：采用RNA干扰、过表达技术或小分子抑制剂等方法，对筛选出的潜在靶点基因进行功能验证，观察其对金腰乙素抗膀胱癌作用的影响。实验得到以下图表;
通过转录组测序或基因芯片分析，上述火山图展示，确定金腰乙素处理后膀胱癌细胞中存在大量差异表达基因；qPCR和Western - blot实验证实，部分差异表达基因在mRNA和蛋白水平的表达变化与转录组分析结果一致，表明金腰乙素可在转录和翻译水平调控这些基因的表达；细胞功能实验表明，金腰乙素处理组膀胱癌细胞的增殖能力显著低于对照组，细胞凋亡率明显升高，迁移和侵袭能力下降，说明金腰乙素对膀胱癌细胞具有抑制增殖、诱导凋亡和抑制转移的作用。
上图中所示的一些基因（如MKI67、CDK4、CCNB1、CDC20、CDK2、CDK1、CDK6等）与细胞周期密切相关。MKI67是一种细胞增殖标志物，其表达水平与细胞的增殖活性相关；CDKs（细胞周期蛋白依赖性激酶）是细胞周期调控的核心蛋白激酶，与细胞周期蛋白结合后，调节细胞周期各阶段的进程。从图中可以看出，一些基因在ChrB组和CTL组之间存在明显的表达差异。例如，HMOX1在ChrB组中表达较高（颜色偏青），而在CTL组中表达较低（颜色偏紫）；TOP2A在ChrB组中表达也相对较高。相反，某些基因如KIF20A在CTL组中表达较高，而在ChrB组中表达较低。
本项目的研究背景：抗癌化合物药物的筛选思路
1、细胞周期依赖性抗癌化合物筛选思路
A.确定细胞周期关键靶点：细胞周期由G1期、S期、G2期和M期组成，各时期有相应的关键调控蛋白，如周期蛋白、周期蛋白依赖性激酶（CDK）等，确定这些靶点是筛选的基础。
B.建立细胞周期同步化模型：使用药物或其他方法使细胞群体同步化于特定的细胞周期阶段，然后将待筛选化合物加入同步化细胞中，观察其对细胞周期进程的影响。
C.筛选策略：采用高通量筛选技术，将大量化合物作用于同步化细胞，通过检测细胞周期相关指标，如细胞周期分布、周期蛋白和CDK的表达与活性变化等，筛选出能够特异性阻断或延缓细胞周期进程的化合物。
2.细胞周期非依赖性抗癌化合物筛选思路
细胞周期非依赖性抗癌化合物作用于各期细胞，能直接破坏细胞结构或功能，其筛选思路可从以下多方面展开：
A.基于细胞水平的初筛：选用多种膀胱癌细胞系，如T24、5637等，以及正常细胞系作对照。将细胞接种于96孔板，分别加入不同浓度的化合物库样本，采用CCK - 8、MTT等检测细胞活力，在短时间内（24 - 48h）评估对各期细胞增殖抑制效果，筛选出对癌细胞抑制率高且对正常细胞毒性小的化合物。利用克隆形成实验，观察化合物处理后细胞形成克隆的能力，判断其对细胞长期存活和增殖能力的影响，进一步验证初筛结果。
B.细胞凋亡与坏死检测：运用Annexin V - FITC/PI双染结合流式细胞术，检测化合物处理后的癌细胞凋亡和坏死情况。若化合物能诱导各期癌细胞凋亡或坏死，且不受细胞周期限制，表明其可能具有细胞周期非依赖性抗癌作用。通过检测细胞内凋亡相关蛋白（如Caspase - 3、Bcl - 2家族蛋白）的表达变化，深入探究化合物诱导细胞死亡的机制。
C.DNA损伤与修复评估：采用彗星实验，观察化合物处理后癌细胞DNA的损伤程度，检测不同细胞周期的DNA拖尾现象，判断化合物是否能直接损伤DNA。利用免疫荧光染色检测γ - H2AX焦点形成情况，γ - H2AX是DNA双链断裂的标志物，可反映DNA损伤程度及化合物对各期细胞DNA损伤的影响。通过检测DNA修复相关蛋白（如PARP1、BRCA1等）的表达和活性，分析细胞对DNA损伤的修复能力，确定化合物是否抑制DNA修复过程，从而发挥抗癌作用。
D.作用机制研究：运用蛋白质组学技术，如二维电泳（2 - DE）结合质谱（MS）分析，全面鉴定化合物处理前后癌细胞中蛋白质表达的变化，筛选出差异表达蛋白，构建蛋白质 - 蛋白质相互作用网络，深入探究化合物的作用机制，确定其是否通过不依赖细胞周期的信号通路发挥抗癌作用。利用基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）敲除或过表达潜在作用靶点基因，观察细胞对化合物敏感性的变化，验证靶点基因与化合物抗癌作用的相关性，明确化合物的作用靶点。
经过我们实验团队的验证可以初步证明金腰乙素属于细胞周期非依赖性抗癌化合物。
