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基于UPLC-QTOF-MS技术解析徐长卿中C21甾苷类成分代谢规律及其抗肿瘤作用机制研究

申报人：谢鹏霖 申报日期：2025-02-28

基本情况

2025创新项目
基于UPLC-QTOF-MS技术解析徐长卿中C21甾苷类成分代谢规律及其抗肿瘤作用机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
中药学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
目前，关于徐长卿的抗肿瘤研究主要集中于挥发油（以丹皮酚为代表）、糖类和菲并吲哚里西啶类生物碱等化合物。我们课题组前期研究发现徐长卿中的C21甾苷类化合物对HeLa、HepG2等肿瘤细胞表现出中等程度的细胞毒性，其效果并不显著。因此，我们推测C21甾苷类成分在体内可能并非直接发挥作用，而是其代谢产物在起作用。且徐长卿的体内抗肿瘤效果及其作用机制尚不明确，系统性的深入研究和报道相对较少。为此，我们将开展进一步的研究工作。采用UPLC-QTOF-MS，将对不同生理状态下的内源性代谢物进行定性与定量分析，以阐明药效物质，并通过体内外实验，评价C21甾苷类抗肿瘤效果及其作用机制。
  1. 参与第十一届山东省大学生医药生物技术技能大赛并获一等奖。
  2. 参与指导老师课题：基于“成分-靶点-活性”网络的瓜木抗宫颈癌化学成分及作用机制研究。
  3. 参与指导老师课题：基于PI3K/Akt/mTOR通路调控的徐长卿治疗宫颈癌药效物质基础及作用机制研究。
  1. 主持山东省自然科学基金面上项目：基于“成分-靶点-活性”网络的瓜木抗宫颈癌化学成分及作用机制研究（NO.ZR2023MC009），2024.01-2026.12，在研。
  2. 主持国家自然科学基金青年基金项目：基于C-myc G4靶点的博落回属植物抗肿瘤生物碱的发现及机制研究（NO.31800282）， 2019.01-2021.12，结题。
  3. 主持山东省自然科学基金(联合专项)：基于C-myc G-四链体靶点的小果博落回中抗肿瘤生物碱及机制研究（NO.ZR2017LC003）， 2017.08-2019.12，结题。
    4. 主持济宁医学院贺林院士新医学临床转化工作站科研基金项目：基于PI3K/AKT/mTOR通路调控的徐长卿治疗宫颈癌药效物质基础
 及作用机制研究（JYHL2022ZD03），2023.01-2025.12，在研。
指导教师赛春梅的贺林院士基金的经费支持本项目的研究。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
谢鹏霖 药学院 中药学（3+4贯通培养） 2023 负责人，实验全部
王蕾 药学院 中药学（本科） 2022 抗肿瘤活性测试
梁玄开 药学院 中药学（3+4贯通培养） 2022 代谢规律研究
胡翔越 药学院 中药学（3+4贯通培养） 2022 网络药理学，分子对接
邓茜 药学院 中药学（本科） 2022 体内抗肿瘤药效实验
张斌 药学院 药学（临床研究与应用方向） 2022 抗肿瘤作用机制研究

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
赛春梅 药学院 否

立项依据

        本项目拟采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术（UPLC-QTOF-MS），结合多元统计分析，对徐长卿中C21甾苷类成分的体内代谢规律进行系统研究，并探讨其抗肿瘤作用机制，为徐长卿的临床应用和新药研发提供科学依据。
  1. C21甾苷类成分的分离、纯化及结构鉴定
  徐长卿的干燥根及根茎的95%乙醇提取物，利用硅胶、ODS、Sephadex LH-20等柱色谱和制备HPLC等方法分离、纯化、制备C21甾苷类化合物，并根据其理化性质和波谱数据（NMR、MS、UV、IR）鉴定其结构（已完成）。
  2. 原型成分及代谢产物的鉴定，初步确定体内药效物质
  运用UPLC-QTOF-MS技术，并结合UNIFI软件与人工分析手段解析代谢规律。首先，将原型药物的结构式导入UNIFI代谢产物分析平台。随后，建立针对体内生物转化产物的分析方法，对空白样本、血浆、尿液及粪便进行处理，并在扣除相应空白后，结合原型药物的分子结构，根据代谢物的分子量及典型碎片，对给药样本中普遍存在的代谢物进行系统分析和鉴定。基于所鉴定的代谢物结构，推测化合物在正常大鼠体内的转化类型及主要转化途径等信息。
  3. 体外抗肿瘤活性研究
  采用细胞活力测试（Cell Counting Kit-8），评估乙醇粗提物及单体化合物及代谢产物对肿瘤细胞的生长抑制活性。
  4. 体内动物实验和代谢组学探究醇提物干预肿瘤的作用及机制
  建立荷瘤小鼠模型，以小鼠体重、摄食量、肿瘤体积和瘤重，肿瘤组织的HE染色等为评价指标，评价徐长卿对肿瘤生长的抑制作用；采用Western-blot技术，检测徐长卿对肿瘤组织中相关蛋白的影响，探讨其抗肿瘤作用通路；应用UPLC-Q-TOF-MS/MS代谢组学技术，对徐长卿醇提物干预后的小鼠血清和肿瘤组织样本进行分析，探讨对肿瘤小鼠代谢物的影响以及可能调控的代谢途径，从内源性代谢物的差异性表达方面探讨抗肿瘤作用及作用机制。
  1. 徐长卿研究现状
  徐长卿为我国传统的常用中草药，具有极大的药用价值，为萝摩科鹅绒藤属植物徐长卿Cynanchum paniculatum (Bge.) Kitag.的干燥根和根茎，性辛、温，主要分布于中国、韩国、日本的大部分地区[1]。中国药典记载徐长卿通常被用作治疗风湿性关节炎、胃痛、牙痛、腰痛、软组织损伤、风疹、湿疹的传统药[2-3]，在《神农本草经》、《本草纲目》中，有徐长卿作为草药治疗瘟疫、疟疾、精神分裂症的记载。由于其广泛的临床疗效，在许多中医方剂中可与其他中药合用，治疗各种疾病，旨在达到更好的治疗效果[4-5]。徐长卿不仅具有广泛的传统用途，而且现代药理实验也发现了新的药理活性[6]，如抗炎[7]、止痛[8]、抗病毒[9-10]、神经保护[2,11]、抗肿瘤的活性[12-14]。
  徐长卿作为经典抗炎药，常用来治疗关节炎、软组织损伤、内皮细胞损伤、结肠炎[7,15]，而炎症在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，控制炎症通路是发挥抗癌作用的分子机制之一。抗癌的分子的重要机制。文献报道多酚等天然产物的抗癌活性与抑制NF-κB、MAPK、PI3K/AKT/mTOR、Wnt/β-catenin、COX-2和JAK2/STAT3炎症相关信号通路相关[16-17]。徐长卿中的丹皮酚通过TGF-β1/Smad通路抑制胰腺癌细胞的迁移侵袭，可以通过影响Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2的表达而抑制前列腺癌细胞增殖[18]，徐长卿中的生物碱类化合物antofine可以通过抑制Cyclin D1的表达而抑制HCT 116结肠癌细胞的增殖[19]。
  目前，围绕徐长卿的抗肿瘤研究，大多集中在挥发油（以丹皮酚为代表）、糖类和菲并吲哚里西啶类生物碱这几类化合物，虽然文献报道徐长卿中C21甾苷类化合物对一些肿瘤细胞有中等的细胞毒活性[20-22]，但作用不是特别强。因此我们推测是否是C21甾苷进入体内后，发挥作用的是代谢产物而不是原型成分。徐长卿体内抗肿瘤作用是否明显，其作用机制是什么？系统深入研究和报道的较少。接下来，我们将对此进行深入研究。
  2. 代谢组学研究进展
  生物体代谢的变化是一个动态过程，代谢组学能够全面反映机体整个代谢途径的变化。借助液质联用技术（UPLC-QTOF-MS）对不同生理状态下的内源性代谢物进行定性、定量分析，用于评价中药治疗效果，了解药物药理作用、药效和作用机制。
  LC-MS是通过现代分析技术定量测定生物体的内源性代谢物，考察生物体在不同状态下代谢产物的变化，利用对代谢物图谱的整体分析直接认识生理、病理状态，结合化学信息学分析方法确定内源性小分子代谢物成分的变化模式，获得相应的生物标志物群，表征或揭示生物体在特定时间和环境下的整体功能状态[23]。代谢组学可作为一种强有力的工具来全面评估生物系统对外部刺激的分子响应，基于不同生物样品（如尿液、血清、组织）中的总体代谢物谱。苏联磷[24]采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）分析生、醋五味子干预后急性酒精性肝损伤大鼠血浆及胆汁代谢物的变化，阐明五味子的体内代谢规律和药效作用机制。Liu[25]等利用高效液相色谱-质谱联用进行非靶向代谢组学分析，比较肝癌患者和健康受试者的血清、肝组织及粪便代谢物的变化，结果显示肝癌患者血清和组织代谢产物DL-3-苯乳酸、L-色氨酸、甘氨胆酸和1-甲基烟酰胺水平显著高于健康对照组，血清和粪便中的亚油酸和苯酚水平低于健康对照组，推测这些代谢物可能在肝癌的发展中发挥作用。Li[26]等利用LC-MS结合非靶向代谢组学研究细梗香草皂苷A体内代谢和抗结直肠癌作用机制，结果表明细梗香草皂苷A能有效抑制结直肠癌小鼠模型中的肿瘤生长和转移，并调节代谢和免疫。
  3. 研究意义
  徐长卿为我国常用传统中药，长期临床实践和现代药理研究证实，徐长卿有明显的抗炎、抗肿瘤作用，但其药效物质基础及作用机制尚不完全清楚。为突破这一瓶颈问题，本项目采用UPLC-QTOF-MS，结合多种色谱分离手段，快速、定向、高效地分离纯化徐长卿中C21甾类活性成分，并采用大鼠转化模型，结合质谱共性特征快速筛选匹配徐长卿原型与代谢产物，阐明徐长卿抗肿瘤体内外药效物质基础。在细胞和动物水平，验证徐长卿是通过调控PIK3CA、STAT3、AKT1等关键靶点和PI3K-AKT、JAK-STAT、MAPK信号通路，发挥抗肿瘤作用，阐明其作用机理。本项目探索徐长卿抗肿瘤体内外药效物质基础，为徐长卿临床用药及抗肿瘤靶向药物的设计提供了理论依据，且在抗肿瘤中药创新药物研究开发方面具有重要的科学意义。
   参考文献:
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[24] 苏联麟. 基于UPLC-Q-TOF/MS技术的生､醋五味子抗肝损伤效应物质基础及代谢组学研究[D]. 南京中医药大学, 2017.
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针对中药多成分协同作用的复杂性，本项目创新性构建"化学-代谢-机制"三维解析体系：
  化学维度：突破同分异构体辨识瓶颈，实现C21甾类成分群的高效注释与结构多样性谱库构建；
  代谢维度：以大鼠模型动态代谢追踪技术，分析量化原型成分与代谢产物的药效贡献度，破解"体内药效物质形式不明"的难题；
  机制维度：揭示C21甾类对PI3K-AKT/JAK-STAT/MAPK通路的协同调控网络，建立"多靶点信号级联效应"定量评价模型。
这种技术集成策略突破了传统单一研究方法的局限性，为中药复杂体系研究提供了系统性解决方案。
技术路线
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拟解决的关键问题
  ①如何快速筛选徐长卿在体内发挥抗宫颈癌作用的是原型成分还是代谢产物，明确徐长卿抗宫颈癌的药效物质是什么，是本项目需要解决的首要关键科学问题。
以大鼠为转化模型，采用UPLC-QTOF-MS技术并结合UNIFI软件和人工分析，对徐长卿C21甾苷类化合物原型成分及代谢产物进行全面表征，初步探索徐长卿在体内的药效物质。
  ②阐明徐长卿是否通过调控炎症相关因子或信号通路发挥抗肿瘤作用，是本项目需要解决的第二个关键科学问题。
建立荷瘤小鼠模型，测量小鼠体重、摄食量、肿瘤体积和瘤重，对肿瘤组织进行HE染色，检测其形态学变化，明确徐长卿对肿瘤生长的影响；应用UPLC-Q-TOF-MS技术对小鼠血清和肿瘤组织样品进行代谢组学分析，采用Western-blot技术，检测徐长卿对肿瘤组织中相关蛋白的影响，探讨其抗肿瘤作用通路，进一步明确徐长卿的抗肿瘤作用机制。
预期研究成果
  ①明确徐长卿的体内外药效物质是C21甾苷的原型成分还是其代谢产物。
  ②阐明徐长卿干预肿瘤的作用及作用机制。
  ③发表论文1篇。
  2025.05-2026.01，C21甾苷类成分的代谢规律研究。
   2026.03-2026.12，抗肿瘤药效及作用机制研究。
  2027.01-2027.05，全面总结，整理数据，撰写报告及论文。
  1. 徐长卿根中化学成分的分离纯化
  徐长卿根20 Kg，采用95%乙醇浸泡12小时后回流提取2次，每次2小时，减压回收乙醇至干膏，即获得总提取物，加水混匀，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。利用Silica gel，MCI gel，Al2O3，Sephadex LH-20，ODS等分离材料，采用常压、中低压、高效液相色谱系统对徐长卿根中的化学成分进行深入系统的分离纯化，得到C21甾苷类目标化合物。
  分离流程图如下：

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  2. 利用现代波谱技术对所有单体化合物的结构进行鉴定
  单体化合物绝对构型的确定一直是天然产物结构鉴定的一个重点和难点。借助前期化合物结构解析经验，以单体化合物的核磁共振（1HNMR、13CNMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY）为基础，综合运用UV、IR、MS、HRESIMS等多种波谱学方法，解析并确定化合物的平面结构和相对构型。对于结构复杂、新颖的天然产物，借助计算化学（如计算碳谱、ECD、VCD）、X-单晶衍射测试等手段，确定其精确结构，结构式见图1。

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图1  已分离鉴定化合物的结构式

  3. 采用CCK-8法检测徐长卿乙醇提取物及单体化合物对肿瘤细胞生长抑制活性
  CCK-8法检测肿瘤细胞生长抑制活性：肿瘤细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液；将96孔细胞培养板置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100 μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；将96孔细胞培养板置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养72 h；将96孔板进行CCK-8染色，λ=450 nm，测定OD值；每孔加入10 μL CCK-8，在培养箱继续培养3 h；摇床10 min轻轻混匀；λ=450 nm，酶标仪读出每孔的OD值，计数各组别抑制率。实验结果见图2、图3。

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图2 徐长卿乙醇粗提物对肿瘤细胞的抑制率
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图3 C21甾苷类化合物对肿瘤细胞的抑制率
A 24 h抑制率，B 72 h抑制率




  已具备条件：济宁医学院药学院生物医药平台具有进行中药、天然产物分离鉴定所需的多种仪器设备，主要包括多种分析型高效液相色谱仪、半制备高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、冷冻干燥机、真空干燥箱、电子分析天平、400 M核磁共振波谱仪、傅里叶变换红外光谱仪、紫外-可见分光光度计、HPLC-MS色谱仪等；具有药理药效评价及作用机制研究所需的平台及设备，主要包括细胞培养室、SPF级动物房、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、小动物成像、蛋白质电泳及转印系统、各种离心机等，可以满足本项目研究的需要。
  尚缺少条件：无

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 无 7500.00 12500.00
1. 业务费 8000.00 NMR光谱测试费，论文版面费 2500.00 5500.00
（1）计算、分析、测试费 6000.00 NMR测光谱试费 2500.00 3500.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 2000.00 论文版面费 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 12000.00 徐长卿药材；CCK8等试剂盒；大鼠；小鼠；细胞耗材等等 5000.00 7000.00
结束

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