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小豆蔻明通过AHR/GPX4信号通路抑制肝细胞铁死亡的机制研究

申报人：薛诗琪 申报日期：2025-02-21

基本情况

2025创新项目
小豆蔻明通过AHR/GPX4信号通路抑制肝细胞铁死亡的机制研究 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目通过体外实验探讨中药草豆蔻提取物小豆蔻明激活 AHGPX4 信号通路改善线粒体功能提高肝细胞的抗氧化能力并抑制肝细胞铁死亡。
无

主持山东省医药卫生科技项目一项
对本项目提供平台和技术支持，监督课题的实施及方案设计，促进课题的顺利实施。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
薛诗琪 护理学院 护理学（四年制本） 2024 肝细胞铁死亡模型的建立
韩雨 护理学院 护理学（四年制本） 2024 分子指标检测
赵宸嘉 护理学院 护理学（四年制本） 2024 分子指标检测
李月 护理学院 护理学（四年制本） 2024 分子指标检测
韩宇 护理学院 护理学（四年制本） 2024 基因表达检测
陶思源 护理学院 护理学（四年制本） 2024 分子指标检测

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
刘圣辉 科研处 否

立项依据

本项目计划通过体内外实验探讨中药草豆蔻提取物小豆蔻明是否通过 AHR/GPX4 信号通路改善线粒体功能并提高肝细胞的抗氧化能力抑制铁死亡。旨在阐明小豆蔻明抑制肝细胞铁死亡的分子机制，为抑制肝细胞铁死亡提供新的可能药物靶点。
（1）分析在小鼠肝细胞中，小豆蔻明通过激活AHR对GPX4的调控作用，明确GPX4是否为AHR的靶基因。
1）分析小豆蔻明激活AHR对GPX4的调控作用。
前期实验结果发现在小鼠肝细胞中小豆蔻明可以激活AHR并调控GPX4的表达。拟进一步探究AHR对GPX4的调控方式。
2）探究AHR对GPX4的调控方式，明确GPX4是否为AHR的靶基因。
通过分析发现GPX4启动子序列上存在潜在的AHR外源性反应元件(Xenobiotic response element，XRE)（核心序列为：5′－GCGTG－3′)，将包含XREL1(Xenobiotic response element like element 1)和XREL2(Xenobiotic response element like element 2)的启动子序列（-349bp—+84bp）克隆到PGL3质粒上，同时构建突变质粒。为了分析GPX4是否为AHR的靶基因，我们前期通过双荧光素酶实验证明AHR直接调控GPX4的转录。为了探究GPX4启动子上的特异性元件XREL1和XREL2可以作为AHR反应元件，前期通过EMSA实验证明GPX4启动子上的特异性元件XREL1和XREL2可以作为AHR反应元件。为了进一步确定AHR与GPX4启动子中XREL1和XREL2元件的相互作用，前期通过ChIP实验进一步确定了AHR对GPX4有直接调控作用，GPX4是AHR的靶基因。
（2）在小鼠肝细胞中，确定小豆蔻明是否通过激活AHR促进GPX4的表达改善线粒体功能并提高肝细胞的抗氧化抑制铁死亡。
前期实验用铁死亡诱导剂(Erastin)处理小鼠肝细胞，并用小豆蔻明孵育小鼠肝细胞。检测铁死亡相关指标。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、铁含量、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量均降低。检测铁死亡相关基因GPX4, COX-2, ACSL4, PTGS2, NOX1, FTH1表达变化。小豆蔻明处理小鼠肝细胞后，以叔丁基过氧化氢(tBuOOH)为底物，通过监测NADPH氧化速率，检测GPXs在小鼠肝细胞中的总活性。通过以上结果可以证明，小豆蔻明通过激活AHR促进GPX4的表达，提高了小鼠肝细胞的抗氧化能力。
铁死亡诱导剂(Erastin)处理小鼠肝细胞，并用小豆蔻明孵育小鼠肝细胞。检测小鼠肝细胞死亡率。结果显示小豆蔻明降低了小鼠肝细胞死亡率。小豆蔻明处理小鼠肝细胞后，使用CCK8和MTT对细胞活性检测；使用PGSK、Iron Assay Kit探针检测细胞中的铁水平；检测脂质活性氧；检测线粒体形态变化，检测线粒体膜电位变化。通过以上实验检测铁死亡相关指标是否发生变化，确定小豆蔻明通过激活AHR提高小鼠肝细胞抗氧化能力，抑制小鼠肝细胞铁死亡。

小豆蔻明(Cardamonin，CAR)是姜科山姜属植物草豆蔻种子提取的主要黄酮类化合物[1]。多项研究表明，CAR具有抗肿瘤、治疗肥胖、保护肝脏功能、抗炎、抗氧化、改善胰岛素抵抗等多种药理学活性[2-4]。研究发现，CAR可提高超氧化物歧化酶活性、降低丙二醛含量，缓解顺铂对肾脏的毒性[5]。CAR还可明显抑制脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的P38MAPK磷酸化[6]，且可明显降低ROS含量[7]，但是否可保护氧化损伤精子有待进一步证实。在细胞内氧化应激的调控中，CAR也发挥着重要的作用。CAR通常被认为是一种具有良好抗氧化活性的物质，但在近年来的研究中发现，CAR不仅具有抗氧化活性，在肿瘤细胞中也具有促氧化活性。在心肌细胞中，CAR 被发现具有抗氧化作用，能够避免细胞遭受氧化应激从而保护心肌细胞[8]。但有另一项研究表明在肿瘤细胞中，CAR具有促氧化应激的作用[9]。在不同的细胞中，CAR对氧化应激具有不同的调控作用，但目前探明的调控机制较少。探明CAR调控机制或许可以为氧化应激类疾病提供新策略。
小豆蔻明在THP-1细胞和骨髓源性巨噬细胞中可以显著抑制炎性小体NLRP3 (NOD-like receptor protein 3)信号通路，激活核因子红细胞相关因子2(Nuclearfactor erythroidderived 2-like 2, Nrf2)，促进抗氧化相关蛋白和基因的表达。这种效应可能与芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)的激活、促进AHR/热休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)复合物的分离以及AHR核进入有关。此外，发现AHR拮抗剂可显著降低香豆素对葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium Salt, DSS)诱导的溃疡性结肠炎的保护作用，表明小豆蔻明的抗炎作用是AHR依赖性的[10]。
铁死亡为细胞内铁代谢异常介导的脂质过氧化物和 ROS 堆积而引起的调节性细胞死亡[11]。与凋亡、坏死、自噬和焦亡等其他死亡形式不同的是，铁死亡可以被脂质过氧化物抑制剂和铁螯合剂抑制，但不能被上述其他细胞死亡形式的特异性抑制剂所抑制。细胞铁死亡的正常生理性机制尚不明确，病理性机制主要涉及细胞内铁超载、ROS 积累与抗氧化系统活性降低、脂质过氧化物积累与清除系统失活[11]。ROS 主要来源于线粒体，当铁超载时，细胞可产生大量活性氧ROS(包括超氧阴离子、过氧化氢、基自由基和一氧化氮等)，即二价铁使过氧化氢歧化并氧化成三价铁[12]。铁死亡的核心是细胞膜的双层磷脂过氧化，导致膜破裂解体、细胞死亡。长链脂酰辅酶A合成酶4(long-chain acyl-CoA synthetase4, ACSL4)能催化整合不饱和脂肪酸，后者被ROS氧化生成具有细胞毒性的脂质过氧化物, 从而促进铁死亡发生[13]。Cyst(e)ine/GSH/GPX4轴被认为是调控限制铁死亡的重要途径，通过 system Xc-运载蛋白，细胞外胱氨酸与细胞内谷氨酸进行 1：1 交换进入细胞内，胱氨酸随后在细胞内消耗NADPH还原为半胱氨酸(Cysteine)参与合成谷胱甘肽(GSH)[13]。GSH是哺乳动物细胞中主要的抗氧化剂，缺乏会导致细胞内的过氧化物不能被还原清除。在GSH协同作用下，谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4，GPX4)能将细胞膜上的脂质过氧化物转化成无毒的脂质醇，进而抑制铁死亡的发生[14]。GPX4是谷胱甘肽过氧化物酶家族中极为重要的一员，是哺中乳动物中唯一能在细胞膜范围内解毒脂质过氧化物的酶，细胞内GPX4有三种存在方式(线粒体、细胞核以及细胞质中)，其中细胞质GPX4被认为是一种管家酶，是铁死亡的核心调控因子[15]。
参考文献
[1].Jin J, Qiu S, Wang P, Liang X, Huang F, Wu H, Zhang B, et al. Cardamonin inhibits breast cancer growth by repressing HIF-1α-dependent metabolic reprogramming. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38:377.
[2].Zhang B, Chen ZY, Jiang Z, Huang S, Liu XH, Wang L. Nephroprotective Effects of Cardamonin on Renal Ischemia Reperfusion Injury/UUO-Induced Renal Fibrosis. J Agric Food Chem. 2023;71:13284-13303.
[3].Gong Z, Wang Y, Li L, Li X, Qiu B, Hu Y. Cardamonin alleviates chondrocytes inflammation and cartilage degradation of osteoarthritis by inhibiting ferroptosis via p53 pathway. Food Chem Toxicol. 2023;174:113644.
[4].Nawaz J, Rasul A, Shah MA, Hussain G, Riaz A, Sarfraz I, Zafar S, et al. Cardamonin: A new player to fight cancer via multiple cancer signaling pathways. Life Sci. 2020;250:117591.
[5].Hobbs RM, Seandel M, Falciatori I, Rafii S, Pandolfi PP. Plzf regulates germline progenitor self-renewal by opposing mTORC1. Cell. 2010;142:468-479.
[6].Lamberti D, Vicini E. Promoter analysis of the gene encoding GDNF in murine Sertoli cells. Mol Cell Endocrinol. 2014;394:105-114.
[7].Huang YH, Lin MH, Wang PC, Wu YC, Chiang HL, Wang YL, Chang JH, et al. Hypoxia inducible factor 2α/insulin-like growth factor receptor signal loop supports the proliferation and Oct-4 maintenance of mouse germline stem cells. Mol Hum Reprod. 2014;20:526-537.
[8].Qi W, Boliang W, Xiaoxi T, Guoqiang F, Jianbo X, Gang W. Cardamonin protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity in mice by restraining oxidative stress and inflammation associated with Nrf2 signaling. Biomed Pharmacother. 2020;122:109547.
[9].Ramchandani S, Naz I, Dhudha N, Garg M. An overview of the potential anticancer properties of cardamonin. Explor Target Antitumor Ther. 2020;1:413-426.
[10].Wang K, Lv Q, Miao YM, Qiao SM, Dai Y, Wei ZF. Cardamonin, a natural flavone, alleviates inflammatory bowel disease by the inhibition of NLRP3 inflammasome activation via an AhR/Nrf2/NQO1 pathway. Biochem Pharmacol. 2018;155:494-509.
[11].Yang WS, SriRamaratnam R, Welsch ME, Shimada K, Skouta R, Viswanathan VS, Cheah JH, et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 2014;156:317-331.
[12].Doll S, Proneth B, Tyurina YY, Panzilius E, Kobayashi S, Ingold I, Irmler M. ACSL4 dictates ferroptosis sensitivity by shaping cellular lipid composition. Nat Chem Biol. 2017;13:91-98.
[13].Yu Y, Jiang L, Wang H, Shen Z, Cheng Q, Zhang P, Wang J, et al. Hepatic transferrin plays a role in systemic iron homeostasis and liver ferroptosis. Blood. 2020;136:726-739.
[14].Hou W, Xie Y, Song X, Sun X, Lotze MT, Zeh HJ, 3rd, Kang R, et al. Autophagy promotes ferroptosis by degradation of ferritin. Autophagy. 2016;12:1425-1428.
[15].Xue Q, Yan D, Chen X, Li X, Kang R, Klionsky DJ. Copper-dependent autophagic degradation of GPX4 drives ferroptosis. Autophagy. 2023;19:1982-1996.
选题新颖：本研究预实验首次发现AHR对GPX4的调控作用及分子机制。本课题是结合国内研究的最新进展和我们课题组前期研究结果的提示，凝练科学问题并提出了自己的假说，着重于探讨小豆蔻明通过激活AHR/GPX4调控线粒体功能降低铁死亡对肝细胞的影响，具有很强的创新性。
理论创新：小豆蔻明通过激活AHR直接调控GXP4的表达，促进线粒体生物发生、线粒体融合，提高肝细胞的抗氧化能力，抑制铁死亡。阐明了小豆蔻明通过激活AHR/GPX4信号通路抑制肝细胞铁死亡的分子机制，为治疗肝细胞铁死亡提供了新策略。

技术路线

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拟解决的问题
铁死亡是一种非凋亡的调节性细胞死亡形式，在肝脏损伤中起着重要的作用。阻断铁死亡可显著减轻肝细胞铁死亡造成的组织损伤，但精确调控机制仍不清楚。基于前期文献报道及我们预实验结果我们提出以下科学问题：
科学问题1：小豆蔻明是否通过激活AHR直接调控GPX4影响线粒体功能。
科学问题2：小豆蔻明是否通过激活AHR增强线粒体功能抑制肝细胞铁死亡

预期成果
本项目将阐明小豆蔻明通过激活AHR/GPX4信号通路抑制肝细胞铁死亡的分子机制，为抑制肝细胞铁死亡提供新的可能药物靶点。
2025.06-2026.05
(1)、分析在小鼠肝细胞中，小豆蔻明通过激活AHR对GPX4的调控作用，明确GPX4是否为AHR的靶基因。
2026.06-2027.05
(2)、分析在小鼠肝细胞中，确定小豆蔻明是否通过激活AHR促进GPX4的表达改善线粒体功能提高肝细胞的抗氧化能力并抑制铁死亡。
(1)、小豆蔻明激活AHR促进Gpx4的表达。
为了确定小豆蔻明激活AHR促进Gpx4的表达，用小豆蔻明处理小鼠肝细胞，提取RNA，用实时荧光定量PCR检测Gpx4表达变化。Cyp1a1是AHR的靶基因。结果发现，小豆蔻明处理后Cyp1a1和 Gpx4表达上调，表明小豆蔻明激活AHR促进Gpx4（图1.A）。使用小豆蔻明和AHR拮抗剂CH-223191处理小鼠肝细胞。结果发现小豆蔻明促进Cyp1a1和 Gpx4的表达，CH-223191抑制Cyp1a1和 Gpx4的表达（图1.B）。使用siAHR沉默小鼠肝细胞中AHR的表达，然后再用小豆蔻明处理小鼠肝细胞。结果发现对照组激活AHR后，Cyp1a1和Gpx4表达上调。沉默AHR后，Cyp1a1和Gpx4表达没有变化（图1.C）。以上结果说明说小豆蔻明通过激活AHR促进Gpx4的表达。summernote-img
图1. 小豆蔻明激活AHR促进Gpx4的表达。A-C. QPCR检测Cyp1a1和Gpx4的表达。
(2)、Gpx4是AHR的靶基因。
通过分析发现Gpx4启动子序列上存在两个潜在的AHR外源性反应元件（核心序列为：5′－GCGTG－3′)（图2.A），包含XREL1和XREL2的启动子序列（-349bp—+84bp）克隆到PGL3质粒上，同时构建突变质粒（图2.B）。通过双荧光素酶实验表明，小豆蔻明激活AHR后，XREL1和XREL2两个结合位点均能增加荧光素酶活性（图2.C），说明AHR通过与Gpx4启动子区域的反应元件结合，直接调控Gpx4的转录。为了进一步确定Gpx4启动子上的特异性元件XREL1和XREL2可以作为AHR反应元件，我们用小豆蔻明处理小鼠肝细胞，抽提mHSC核蛋白并进行EMSA。EMSA显示标记的XREL1和XREL2探针与小豆蔻明处理的小鼠肝细胞核提取物相互作用产生了预期的DNA/蛋白质迁移带。 加入未标记（冷）探针后 DNA/蛋白质迁移带明显变弱而添加突变探针组DNA/蛋白质迁移带没有发生变化（图2.D）。结果说明Gpx4启动子上的特异性元件XREL1和XREL2可以作为AHR反应元件。为了进一步证实AHR与Gpx4启动子中XREL1和XREL2元件的相互作用，我们进行了ChIP实验。在小豆蔻明处理的小鼠肝细胞中，AHR抗体组可以扩增出含有XREL1和XREL2的DNA片段（图2.E），从而确定AHR对Gpx4有直接调控作用，Gpx4是AHR的靶基因。

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图2. AHR直接调控Gpx4转录。（A）Gpx4启动子序列上存在两个潜在的AHR外源性反应元件。（B）包含XREL1和XREL2的启动子序列克隆到PGL3质粒上，同时构建突变质粒。（C）双荧光素酶实验检测荧光素酶活性。（A）EMSA检测AHR与特异性元件XREL1和XREL2结合。（B）CHIP检测AHR与特异性元件XREL1和XREL2结合。
(3) 小豆蔻明通过激活AHR抑制小鼠肝细胞铁死亡。
我们使用铁死亡诱导剂Erastin和小豆蔻明处理小鼠肝细胞。结果发现Erastin处理使小鼠肝细胞内Fe2+水平、ROS水平、MDA水平均升高，MMP水平降低（图3.A-D）。而在小豆蔻明处理后Fe2+水平、ROS水平、MDA水平降低，MMP水平增加（图3.A-D）。说明小豆蔻明提高了小鼠肝细胞的抗氧化能力。
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图3. 小豆蔻明增加小鼠肝细胞的抗氧化能力。（A）检测小鼠肝细胞内Fe2+水平。（B）检测小鼠肝细胞内ROS水平。（C）检测小鼠肝细胞内MDA水平。（D）检测小鼠肝细胞内MMP水平。
接着我们使用铁死亡诱导剂Erastin和小豆蔻明处理小鼠肝细胞。检测铁死亡相关基因Gpx4, Acls4, Ptgs2, Nox1。Erastin处理后铁死亡相关基因Acls4, Ptgs2, Nox1表达升高。小豆蔻明处理后Gpx4表达上调, Acls4, Ptgs2, Nox1表达降低（图4.A）。铁死亡诱导剂Erastin和小豆蔻明处理小鼠肝细胞，检测GPXs在小鼠肝细胞中的总活性。小豆蔻明处理后细胞裂解液进行GPXs活性测定时，我们观察到NADPH的含量比对照组和Erastin组更低，表明细胞裂解液中的高表达的GPXs减少tBuOOH更快（图4.B），高表达的GPXs抗氧化活性更高。通过以上结果可以证明，AHR通过促进Gpx4的表达，提高了小鼠原代肝细胞的抗氧化能力。铁死亡诱导剂Erastin和小豆蔻明处理小鼠肝细胞，检测小鼠原代肝细胞死亡率。结果显示，Erastin促进小鼠肝细胞死亡率，小豆蔻明降低了小鼠肝细胞死亡率（图4.C）。通过以上结果初步确定小豆蔻明通过激活AHR促进Gpx4的表达提高了小鼠肝细胞抗氧化能力，抑制小鼠原代肝细胞铁死亡。
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图4. 小豆蔻明抑制小鼠肝细胞铁死亡。（A）QPCR检测Gpx4, Acls4, Ptgs2, Nox1表达变化。（B）检测细胞内GPXs活性。（C）检测细胞死亡率。
(4) 小豆蔻明通过激活AHR增强线粒体功能。
接着我们使用铁死亡诱导剂Erastin和小豆蔻明处理小鼠肝细胞。线粒体融合-分裂相关蛋白MFN1、OPA1、MFN2表达升高，DRP1表达降低（图5.A）。线粒体生物发生相关蛋白Pgc1α、Nrf1表达升高（图5. B）。电镜结果发现Erastin促进线粒体损伤，小豆蔻明促进线粒体融合（图5. C）。以上结果说明小豆蔻明通过激活AHR增强线粒体功能。

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图5.小豆蔻明通过激活AHR促进线粒体融合、线粒体生物发生增强线粒体功能。（A）QPCR检测线粒体融合相关基因的表达。（B）QPCR检测线粒体生物发生相关基因的表达。（C）透射电镜检测线粒体融合情况。比例尺为1um。
课题组成员长期从事肝再生、肝纤维化、铁死亡发生发展机制研究，在免疫组化、免疫印迹、实时荧光定量PCR、RNA 干扰、慢病毒包装、分离肝细胞、肝星形细胞、各种肝损伤模型等各个方面积累了大量的经验，本项目中所用到的实验技术以前均有所涉及，为本项目的实施提供了技术保障。本项目所需的主要仪器设备目前均已经具备，为本项目的实施提供了物质保障。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 实验耗材 17000.00 3000.00
1. 业务费 3000.00 无 0.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 润色 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 17000.00 实验小鼠，试剂耗材 17000.00 0.00
结束

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