PPARα通过调控Mfn1促进线粒体融合改善线粒体功能的机制研究

申报人：朱文慧申报日期：2025-02-21

基本情况

所属批次:

2025创新项目

项目名称:

PPARα通过调控Mfn1促进线粒体融合改善线粒体功能的机制研究学生申报

项目类型:

创新训练项目

所属学科门类:

医学

所属专业类:

基础医学类

项目来源名称:

学生来源于教师科研项目选题

项目归属学院:

项目期限:

二年期

项目简介:

丁酸激活PPARα调控线粒体融合蛋1(Mitochondrial fusion protein 1, Mfn1)的表达促进肝细胞线粒体融合改善线粒体功能。本项目将阐明丁酸通过激活PPARα可通过直接调控Mfn1促进肝细胞线粒体融合的分子机制。

负责人曾经参与科研的情况:

无

指导教师承担科研课题情况:

主持山东省医药卫生科技项目一项

指导教师对本项目的支持情况:

对本项目提供平台和技术支持，监督课题的实施及方案设计，促进课题的顺利实施。

项目级别:

校级

项目成员

序号	学生	所属学院	专业	年级	项目中的分工	成员类型
1	朱文慧	护理学院	护理学（四年制本）	2024	肝细胞脂肪堆积模型建立	第一主持人
2	杨欣怡	护理学院	护理学（四年制本）	2024	分子指标检测	成员
3	郭蕊	护理学院	护理学（四年制本）	2024	分子指标检测	成员
4	王鲁豫	护理学院	护理学（四年制本）	2024	分子指标检测	成员
5	李佳蒋	护理学院	护理学（四年制本）	2024	分子指标检测	成员
6	马紫凡	护理学院	护理学（四年制本）	2024	基因表达检测	成员

指导教师

序号	教师姓名	所属学院	是否企业导师	教师类型
1	刘圣辉	科研处	否	第一指导教师

立项依据

研究目的:

研究发现PPARα可以通过促进肝细胞线粒体融合，但是PPARα促进肝细胞线粒体融合的机制尚不清楚。我们前期实验结果发现丁酸通过激活PPARα可促进肝细胞脂质代谢，并提高肝细胞抗氧化能力，有效缓解脂质积累诱导的肝细胞损伤。丁酸激活PPARα调控线粒体融合蛋1(Mitochondrial fusion protein 1, Mfn1)的表达促进肝细胞线粒体融合改善线粒体功能。本项目将阐明丁酸通过激活PPARα可通过直接调控Mfn1促进肝细胞线粒体融合的分子机制。

研究内容:

明确PPARα是否通过直接调控Mfn1促进线粒体融合改善线粒体功能。

我们前期实验结果发现丁酸梭菌代谢产物丁酸可通过激活PPARα信号通路促进脂代谢，并可能通过促进Mfn1的表达促进线粒体融合。为了探究PPARα是否对线粒体融合相关蛋白Mfn1有直接调控作用，我们分析了线粒体融合相关蛋白Mfn1启动子区域，我们通过软件分析在Mfn1启动子区域存在PPARα结合元件PPRE,说明PPARα可能对Mfn1的表达存在直接调控的作用。通过双荧光素酶实验，EMSA，CHIP实验证明PPARα是否存在对Mfn1的直接调控。使用小鼠原代肝细胞脂肪堆积模型:取油酸和棕榈酸按照 2∶ 1混合制成游离脂肪酸 ( free fattyacid，FFA)。分为对照组、FFA模型组、FFA模型组+丁酸梭菌代谢产物(丁酸孵育)。检测线粒体脂肪酸β氧化和线粒体氧化磷酸化水平，检测Cpt1a、Acox1、长链酰基辅酶A脱氢酶（Long chain acyl-CoAdehydrogenase, Lcad）、中链酰基辅酶 A 脱氢酶（Medium chain acyl-CoA dehydrogenase, Mcad）的表达变化。检测ATP含量变化。检测耗氧量水平变化。检测肝细胞抗氧化能力，检测Gpx4的表达。检测肝损伤指标和细胞内氧化应激指标ALT、AST、ROS、超氧化物歧化酶 ( Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶( Glutathione peroxidase，GSH)、丙二醛( Malondialdehyde，MDA)、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP)的变化。通过以上实验确定PPARα直接调控Mfn1促进线粒体融合并影响线粒体功能。

国、内外研究现状和发展动态:

PPARα在调节糖脂代谢中起重要作用，近年来研究发现，除代谢调节作用外，PPARα及其配体对氧化应激具有重要的调控作用，在多种疾病模型中均有治疗作用。PPARα可通过促进脂肪酸氧化酶的表达促进脂质氧化[1]。PPARα调控肝脏编码过氧化物酶体、线粒体和细胞色素 P450中某些脂肪酸代谢酶的基因的转录，增加脂肪酸分解，促进线粒体脂肪酸β-氧化和氧化磷酸化水平[2]。我们前期研究发现激活PPARα将Sox9阳性肝细胞从糖酵解为主的代谢方式转变为线粒体氧化磷酸化为主，并且促进了线粒体的融合[3]，但是PPARα促进肝脏细胞线粒体融合的机制尚不清楚，还需要进一步探索。线粒体为保持正常生理功能，不断进行动态变化，称为线粒体动力学，主要包括线粒体融合与分裂两个过程[4]。线粒体融合有内膜融合和外膜融合两部分,这两个过程相互协调几乎同时发生。目前已发现三种与线粒体融合相关的蛋白质：Mfn1和线粒体融合蛋白2（Mitochondrial fusion protein 2，Mfn2）以及线粒体内膜融合蛋白视神经萎缩蛋白1(Optic Atrophy 1, Opa1)。Mfn1和Mfn2是介导外膜融合的蛋白质，这两个蛋白在结构和功能上相似度非常高。细胞中缺失Mfn1、Mfn2二者之一均会导致线粒体碎片化，呈现颗粒状；如果同时缺失两者的线粒体就会无融合功能,导致更严重的线粒体片段化现象,而且线粒体功能也会严重受损[5]。大量研究表明线粒体融合增强可提高线粒体脂肪酸β-氧化和氧化磷酸化水平，线粒体融合障碍不利于脂肪酸β-氧化和氧化磷酸化[6]。我们前期实验结果发现丁酸梭菌代谢产物丁酸可通过激活PPARα直接调控Mfn1的表达，促进线粒体融合改善线粒体功能，缓解脂质积累诱导的肝细胞损伤。

创新点与项目特色:

丁酸通过激活PPARα直接调控Mfn1促进线粒体融合改善线粒体功能。

技术路线、拟解决的问题及预期成果:

技术路线

拟解决的问题

丁酸是否通过激活PPARα直接调控Mfn1促进线粒体融合改善线粒体功能。

预期成果

阐明丁酸通过激活PPARα直接调控Mfn1促进线粒体融合改善线粒体功能的分子机制。

项目研究进度安排:

2025.6－2026.5

1）探究PPARα对Mfn1的调控方式，明确Mfn1是否为PPARα的靶基因。

2026.6－2027.5

2）探究PPARα改善线粒体功能，促进脂质代谢并提高线粒体抗氧化能力。

已有基础:

与本项目有关的研究积累和已取得的成绩:

为了探究PPARα是否对线粒体融合相关蛋白Mfn1有直接调控作用，我们对Mfn1启动子区域序列进行分析，我们通过软件分析发现在Mfn1启动子区域存在疑似PPARα结合元件PPRE（图1.A）,说明PPARα可能对Mfn1的表达存在直接调控的作用。我们将小鼠Mfn1中包含PPRE的启动子序列克隆到PGL3质粒上，同时构建突变质粒（图1.B）。通过双荧光素酶实验表明，激活PPARα后，PPRE结合位点能增加荧光素酶活性（图1.C），说明PPARα通过与Mfn1启动子区域的反应元件结合，直接调控Mfn1的转录。为了进一步确定Mfn1启动子上的特异性元件PPRE可以作为PPARα反应元件，我们用GW7647处理小鼠肝细胞，抽提核蛋白并进行EMSA。EMSA显示标记的PPRE探针与GW7647处理的小鼠肝细胞核提取物相互作用产生了预期的DNA/蛋白质迁移带。加入未标记（冷）探针后 DNA/蛋白质迁移带明显变弱而添加突变探针组DNA/蛋白质迁移带没有发生变化（图1.D）。结果说明Mfn1启动子上的特异性元件PPRE可以作为PPARα反应元件。为了进一步证实PPARα与Mfn1启动子中PPRE元件的相互作用，我们进行了ChIP实验。在GW7647处理的小鼠肝细胞中，PPARα抗体组可以扩增出含有PPRE的DNA片段（图1.E）。以上实验证明PPARα通过与Mfn1启动子区域PPRE结合直接调控Mfn1的表达，Mfn1是PPARα的靶基因。

图1. PPARα直接调控Mfn1转录。（A）Mfn1启动子序列上存在潜在的PPARα结合反应元件PPRE。（B）包含PPRE启动子序列克隆到PGL3质粒上，同时构建突变质粒。（C）双荧光素酶实验检测PPARα可以与潜在的结合反应元件PPRE结合促进Mfn1转录。（D）EMSA检测PPARα可以与潜在的结合反应元件PPRE结合。（E）ChIP检测PPARα可以与潜在的结合反应元件PPRE结合。

为了探究丁酸梭菌代谢物SCFA通过激活PPARα信号通路靶向肝细胞线粒体融合对线粒体功能的影响，使用小鼠原代肝细胞建立脂肪堆积模型并分组:取油酸和棕榈酸按照 2∶ 1(浓度 0． 66mol /L∶ 0． 33mol /L)的比例用DMSO分别溶解，混合制成游离脂肪酸 ( free fattyacid，FFA)。10%胎牛血清溶于 DMEM高糖培养基，置于 CO2细胞培养箱培养。分为对照组、FFA模型组(1.5mmol /L FFA孵育 24h)、FFA (1.5mmol /L FFA孵育 24h)+ Butyrate组 (1.5mmol /L 丁酸孵育 24h)。QPCR检测发现FFA + Butyrate组PPARα下游靶基因Cpt1a、Acox1表达显著升高（图2.A-B），表明Butyrate可有效激活PPARα信号通路，并促进脂质代谢。QPCR检测发现FFA + Butyrate组线粒体融合相关蛋白Mfn1表达显著升高（图2.C）。另外FFA + Butyrate组抗氧化因子Gpx4的表达显著升高（图2.D），表明Butyrate可有效提高肝细胞抗氧化能力。FFA组mtDNA拷贝数显著降低，而FFA + Butyrate组线粒体mtDNA拷贝数显著增加（图2.E）。FFA + Butyrate组ATP含量显著增加（图2.F）。肝细胞中TG、TC、AST、ALT指标在FFA组中显著增加，而FFA + Butyrate组中Butyrate干预后TG、TC、AST、ALT指标显著降低（图2.G-J），表明Butyrate可有效缓解肝脂质积累和肝损伤。FFA + Butyrate组中Butyrate干预后GSH、SOD水平显著增加（图2.K-L），表明Butyrate可有效提高肝细胞抗氧化能力。

图2.丁酸激活PPARα信号通路通过改善线粒体功能缓解脂质积累诱导的肝细胞损伤。（A-D）QPCR检测Cpt1a、Acox1、Mfn1、Gpx4表达变化。（E）检测mtDNA拷贝数变化。（F）检测细胞 ATP含量。（G-H）检测细胞中TG和TC水平变化。（I-J）检测细胞中ALT和AST水平变化。(K-L)检测细胞中GSH、SOD水平变化。

FFA模型组中MDA和ROS水平显著增加，而FFA + Butyrate组中Butyrate干预后MDA和ROS水平显著降低（图3.A，B，D）。FFA模型组中MMP水平显著降低，而FFA + Butyrate组中Butyrate干预后MMP水平显著升高（图3.C-D），以上实验结果说明丁酸激活PPARα可促进脂质代谢，并提高肝细胞抗氧化能力，有效缓解脂质积累诱导的肝细胞损伤。

图3.丁酸降低脂质积累诱导的肝细胞氧化应激。（A-C）荧光探针检测细胞中MDA、ROS、MMP水平变化，比例尺为50μm。（D）细胞中MDA、ROS、MMP水平定量图。

通过电镜观测肝细胞线粒体形态变化，发现FFA + Butyrate组中Butyrate干预后肝细胞线粒体融合显著增加（图4）。以上实验说明PPARα直接调控Mfn1促进线粒体融合并改善线粒体功能。

图4.丁酸对细胞线粒体形态变化的影响。电镜检测细胞线粒体形态变化，箭头指示发生融合的线粒体。比例尺为1μm。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法:

课题组成员长期从事肝再生、肝纤维化、铁死亡发生发展机制研究，在免疫组化、免疫印迹、实时荧光定量PCR、RNA 干扰、慢病毒包装、分离肝细胞、肝星形细胞、各种肝损伤模型等各个方面积累了大量的经验，本项目中所用到的实验技术以前均有所涉及，为本项目的实施提供了技术保障。本项目所需的主要仪器设备目前均已经具备，本项目所需的条件敲除小鼠及主要试剂已准备完毕，为本项目的实施提供了物质保障。

经费预算

开支科目	预算经费（元）	主要用途	阶段下达经费计划（元）
开支科目	预算经费（元）	主要用途	前半阶段	后半阶段
预算经费总额	20000.00	实材消耗	17000.00	3000.00
1. 业务费	3000.00	无	0.00	3000.00
（1）计算、分析、测试费	0.00	无	0.00	0.00
（2）能源动力费	0.00	无	0.00	0.00
（3）会议、差旅费	0.00	无	0.00	0.00
（4）文献检索费	0.00	无	0.00	0.00
（5）论文出版费	3000.00	润色	0.00	3000.00
2. 仪器设备购置费	0.00	无	0.00	0.00
3. 实验装置试制费	0.00	无	0.00	0.00
4. 材料费	17000.00	实验小鼠、试剂消耗	17000.00	0.00

结束

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