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丁酸梭菌代谢物SCFA通过激活PPARα缓解小鼠非酒精性脂肪肝

申报人：周博文 申报日期：2025-02-21

基本情况

2025创新项目
丁酸梭菌代谢物SCFA通过激活PPARα缓解小鼠非酒精性脂肪肝 学生申报
创新训练项目
医学
基础医学类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目将阐明丁酸梭菌代谢产物通过激活PPARα信号通路缓解小鼠非酒精性脂肪肝的分子机制，对预防或治疗小鼠非酒精性脂肪肝提供了理论依据。同时对丁酸梭菌预防和治疗小鼠非酒精性脂肪肝的临床应用前景提供理论依据。
曾经在实验室帮助老师科研
主持山东省医药卫生科技项目一项
对本项目提供平台和技术支持，监督课题的实施及方案设计，促进课题的顺利实施。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
周博文 护理学院 护理学（四年制本） 2024 肝增殖指标检测
孟小爽 护理学院 护理学（四年制本） 2024 小鼠模型建立
解琬昕 护理学院 护理学（四年制本） 2024 肝损伤指标检测
苑兆京 护理学院 护理学（四年制本） 2024 基因表达检测
吕淑棋 护理学院 护理学（四年制本） 2024 肝损伤指标检测
梁明昊 护理学院 护理学（四年制本） 2024 肝增殖指标检测

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
刘圣辉 科研处 否

立项依据

肠道微生物通过产生代谢物在人类和动物健康中发挥关键作用，这些代谢物在局部和系统上影响宿主生理和疾病。宿主-肠道微生物群相互作用代谢物主要包括短链脂肪酸(Short-chain fatty acids, SCFAs)，胆汁酸，以及色氨酸衍生的代谢物等，这类代谢物的生物学功能仍在不断完善。研究发现丁酸梭菌通过其代谢产物丁酸抑制脂肪沉积，改善肥胖及相关代谢性疾病。据报道肠道微生物群代谢物SCFAs可以通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α (Peroxisome proliferators-activated receptor alpha PPARα)抑制心肌细胞凋亡。PPARα主要调节机体的脂类代谢、炎症、细胞增生、分化、凋亡、衰老，免疫调节及氧化应激等。我们前期结果发现丁酸梭菌通过其代谢产物丁酸激活PPARα缓解小鼠非酒精性脂肪肝。本项目将阐明丁酸梭菌代谢产物通过激活PPARα信号通路缓解小鼠非酒精性脂肪肝的分子机制，对预防或治疗小鼠非酒精性脂肪肝提供了理论依据。同时对丁酸梭菌预防和治疗小鼠非酒精性脂肪肝的临床应用前景提供理论依据。
(1)分析丁酸梭菌对小鼠非酒精性脂肪肝的影响。
为了研究丁酸梭菌对小鼠非酒精性脂肪肝影响，使用野生小鼠高脂饲料连续喂养12周并联和丁酸梭菌建立NAFLD小鼠模型（设置对照组、高脂组、高脂+丁酸梭菌组）。以小鼠肝脏和脂肪组织病理特征、血脂代谢、胰岛素抵抗等各项指标,评价丁酸梭菌对NAFLD的缓解效果,并检测分析肠道菌群多样性和结构组成的变化。检测各组小鼠体重、肝指数、血糖、血清脂代谢(甘油三酯(Triglyceride，TG)、总胆固醇(Total cholesterol，TC))、肝脏脂代谢(TG、TC)及肝损伤(丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotrans-ferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST))指标的变化。进行H&E染色、油红O染色、天狼星红染色评估小鼠肝脏病理变化。检测对线粒体脂肪酸β氧化和线粒体氧化磷酸化水平的影响。通过以上实验确定丁酸梭菌对非酒精性脂肪肝的影响。
(2)探讨丁酸梭菌代谢物SCFA激活PPARα对小鼠非酒精性脂肪肝的作用。
由于己有大量研究表明丁酸梭菌能参与肠道内物质代谢，并通过影响代谢产物及其转运入体而调控宿主健康，因此我们需要对NAFLD小鼠模型的肠道微生物的差异进行分析，还需要对收集到的粪便和血清中的代谢产物进行质谱分析及测序。分析代谢产物SCFA是否存在差异。检测肝脏组织形态及基因表达变化，并检测PPARα信号通路是否激活。为了研究丁酸梭菌代谢产物SCFA是否通过激活PPARα影响小鼠非酒精性脂肪肝。将差异代谢产物灌胃NAFLD小鼠模型（利用高脂饲料连续喂养12周并联和灌胃差异代谢产物（设置对照组、高脂组、高脂+差异代谢产物）。以小鼠肝脏病理特征、血脂代谢、胰岛素抵抗等各项指标,评价差异代谢产物对NAFLD的缓解效果。检测各组小鼠体重、肝指数、血糖、血清脂代谢(TG、TC)、肝脏脂代谢(TG、TC)及肝损伤(ALT、AST)指标的变化。进行H&E染色、油红O染色、天狼星红染色评估小鼠肝脏病理变化。检测肝脏组织形态及脂代谢相关基因表达变化，并检测PPARα信号通路是否激活。检测对线粒体脂肪酸β氧化和线粒体氧化磷酸化水平的影响。通过以上实验确定丁酸梭菌代谢物SCFAs激活PPARα对小鼠非酒精性脂肪肝的作用。
使用PPARα敲除小鼠高脂饲料连续喂养12周并联和丁酸梭菌建立NAFLD小鼠模型（设置对照组、高脂组、高脂+丁酸梭菌组）。以小鼠肝脏和脂肪组织病理特征、血脂代谢、胰岛素抵抗等各项指标,评价丁酸梭菌对NAFLD的缓解效果,并分析肠道菌群多样性和结构组成的变化。动态监测各组小鼠体重、肝指数、血糖、血清脂代谢(TG、TC)、肝脏脂代谢(TG、TC)及肝损伤(ALT、AST)指标的变化。进行H&E染色、油红O染色、天狼星红染色评估小鼠肝脏病理变化。检测肝脏组织形态及脂代谢相关基因表达变化，并检测PPARα信号通路是否激活。检测对线粒体脂肪酸β氧化和线粒体氧化磷酸化水平的影响。通过以上实验进一步确定丁酸梭菌代谢物SCFAs激活PPARα对小鼠非酒精性脂肪肝的作用。

（3）国、内外研究现状和发展动态
3.1非酒精性脂肪肝
非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是除外酒精和其他一系列明确损肝因素所致，以肝实质细胞脂肪堆积为主要特征的疾病[1]。在全球范围内NAFLD被认为是引起肝功能异常、慢性肝脏疾病最常见的原因，与肥胖、胰岛素抵抗、高血压、高甘油三酯血症紧密联系在一起，构成代谢综合征，胰岛素抵抗被视为其重要的病理生理特点[2]。遗传因素、表观遗传、日夜节律紊乱及肠道菌群紊乱会影响宿主对NAFLD的易感性[1]。近年，NAFLD的治疗研究已成为脂肪肝研究领域的热点之一并取得了一些进展。肠道菌群紊乱、小肠细菌过度生长、肠黏膜通透性增加，通过影响营养物质的吸收、代谢性内毒素血症、内生性乙醇、胆碱代谢、胆汁酸的肠肝循环等途径，促进肥胖和NAFLD的发病。某些特定肠道微生物群及其代谢产物变化参与了肝脂肪变、炎症损伤、肝纤维化和肝癌的发病，但是目前还没有因果关系的定论[2]。我们前期实验结果发现丁酸梭菌可缓解小鼠非酒精性脂肪肝，继续探讨其作用机制对预防或治疗非酒精性脂肪肝疾病具有重要意义。
3.2肠道菌群对非酒精性脂肪肝的影响
肠道菌群是胃肠道不可分可的一部分，可以调控许多生理过程。越来越多的证据表明，它对许多器官有各种影响，包括哺乳动物的肝脏[3]。肠道微生物群被认为是攻克 NAFLD的重要切入点，肠道微生物群及其代谢物与肝相互作用的机构基础为肠-肝轴。来自肠道的血液通过门静脉使肝暴露于肠道微生物代谢产物，是造成肝细胞代谢紊乱及变性坏死的直接诱因[4]。SCFAs是肠道中初级多糖降解物分解复杂的多糖骨架释放出的代谢产物，是肠道微生物与宿主信息沟通的桥梁，只有极少部分的 SCFAs来自蛋白质分解[5]。肠道中微生物通过特定肠道菌群的降解系统和转运系统将复杂多糖转化为单糖，SCFAs是发酵形成的最终产物，SCFAs是指碳原子数为1~6的溶于水的游离脂肪酸，其中乙酸、丙酸和丁酸含量最高。SCFAs可有效降低肝脂沉积和脂滴积累，也可作为调节因子参与调节肝脂质代谢[5]。SCFAs尤其是丁酸可通过抑制结肠上皮释放趋化因子和促炎因子，改善胰岛素抵抗引起的脂肪堆积[6]。SCFAs的含量和丰度与 NAFLD的发生密切相关，但其作用机制还需要进一步探讨。我们前期实验结果发现在小鼠非酒精性脂肪肝模型，丁酸梭菌干预后粪便和血清中丁酸含量升高，并且有效缓解脂肪肝。另外在小鼠原代肝细胞脂肪堆积模型中，丁酸可促进肝细胞内脂质代谢，有效缓解脂质积累引起的肝细胞损伤。
3.3肠道菌群代谢产物SCFAs激活PPARα影响脂质代谢和非酒精性脂肪肝
肠道菌群影响机体的主要方式之一是产生SCFAs。SCFAs可以通过调节产热相关蛋白的表达影响能量代谢[7]。丁酸梭菌通过其代谢产物丁酸抑制脂肪沉积，改善肥胖及相关代谢性疾病[8]。肠道菌群代谢产物SCFAs可通过激活PPARα促进脂质代谢，给高脂饮食的小鼠喂乙酸可以促进过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1（Acyl-CoA oxidase 1, Acox1）、肉碱棕榈酰转移酶1A（Carnitine O-palmitoyltransferase 1A, Cpt1a），其中Acox1和Cpt1a均为PPARα的靶基因[16]。PPARα可促进肝脏脂质代谢并改善胰岛素抵抗，延缓或控制NAFLD的发生[9]。肠道菌群代谢物 SCFAs是通过促进脂质代谢改善 NAFLD的有效作用靶点之一。通过特殊饮食或益生菌的干预选择性提高有益菌群及代谢物 SCFA的含量，对恢复肝代谢及改善 NAFLD具有有益作用。我们前期实验结果发现丁酸梭菌代谢产物丁酸可以激活PPARα信号通路，促进Acox1和Cpt1a的表达，并促进肝细胞质代谢，缓解脂质积累诱导的肝细胞损伤。
参考文献
[1]Younossi Z, Tacke F, Arrese M, Chander Sharma B, Mostafa I, Bugianesi E, Wai-Sun Wong V, Yilmaz Y, George J, Fan J, Vos MB. Global Perspectives on Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Nonalcoholic Steatohepatitis. Hepatology 2019;69:2672-2682.
[2]Fang J, Yu CH, Li XJ, Yao JM, Fang ZY, Yoon SH, Yu WY. Gut dysbiosis in nonalcoholic fatty liver disease: pathogenesis, diagnosis, and therapeutic implications. Front Cell Infect Microbiol 2022;12:997018.
[3]Albillos A, de Gottardi A, Rescigno M. The gut-liver axis in liver disease: Pathophysiological basis for therapy. J Hepatol 2020;72:558-577.
[4]Tilg H, Adolph TE. Non-alcoholic fatty liver disease: the interplay between metabolism, microbes and immunity. Nat Metab 2021;3:1596-1607.
[5]Ralli T, Saifi Z, Tyagi N, Vidyadhari A, Aeri V, Kohli K. Deciphering the role of gut metabolites in non-alcoholic fatty liver disease. Crit Rev Microbiol 2023;49:815-833.
[6]López-Méndez I, Méndez-Maldonado K, Manzo-Francisco LA, Juárez-Hernández E, Uribe M, Barbero-Becerra VJ. G protein-coupled receptors: Key molecules in metabolic associated fatty liver disease development. Nutr Res 2021;87:70-79.
[7]Blaak EE, Canfora EE, Theis S, Frost G, Groen AK, Mithieux G, Nauta A, Scott K, Stahl B, van Harsselaar J, van Tol R, Vaughan EE, Verbeke K. Short chain fatty acids in human gut and metabolic health. Benef Microbes 2020;11:411-455.
[8]Stoeva MK, Garcia-So J. Butyrate-producing human gut symbiont, Clostridium butyricum, and its role in health and disease. Gut Microbes 2021;13:1-28.
Kondo T, Kishi M, Fushimi T, Kaga T. Acetic acid upregulates the expression of genes for fatty acid oxidation enzymes in liver to suppress body fat accumulation. J Agric Food Chem 2009;57:5982-5986.
[9]Qiu YY, Zhang J, Zeng FY, Zhu YZ. Roles of the peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Pharmacol Res 2023;192:106786.
本项目阐明了丁酸梭菌代谢产物通过激活PPARα信号通路缓解小鼠非酒精性脂肪肝的分子机制，为治疗非酒精性脂肪肝提供了新策略。
技术路线
拟解决的问题
本项目将阐明丁酸梭菌代谢产物通过激活PPARα信号通路缓解小鼠非酒精性脂肪肝的分子机制。
预期成果
本项目阐明了丁酸梭菌代谢产物通过激活PPARα信号通路缓解小鼠非酒精性脂肪肝的分子机制，为治疗非酒精性脂肪肝提供了新策略。
项目研究进度安排
2025.6－2026.5：
(1)分析丁酸梭菌对小鼠非酒精性脂肪肝的影响。
通过小鼠非酒精性脂肪肝模型，分析丁酸梭菌对小鼠非酒精性脂肪肝的影响。
2026.6－2027.5：
(2)探讨丁酸梭菌代谢物SCFA激活PPARα对小鼠非酒精性脂肪肝的作用。
1）野生小鼠非酒精性脂肪肝模型，探讨丁酸梭菌代谢物SCFA激活PPARα对小鼠非酒精性脂肪肝的影响。
2）PPARα敲除小鼠非酒精性脂肪肝模型，探讨丁酸梭菌代谢物SCFA激活PPARα对小鼠非酒精性脂肪肝的作用。
与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
(1)丁酸梭菌缓解小鼠非酒精性脂肪肝。
为探究丁酸梭菌对小鼠脂肪肝的影响，本实验建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，8周龄雄性C57BL/6小鼠将其随机分为对照组(Control)、模型组（高脂饲料HFD）、实验组(高脂饲料+丁酸梭菌HFD+CB)，每组10只，饲喂12周，同时实验组每天灌胃丁酸梭菌108CFU/只/天，持续灌胃4周 。对照组、模型组给予每天灌胃等量蒸馏水。动态检测各组小鼠体重、肝/体重比、血清脂代谢(TG、TC)指标。进行末次灌胃后 30 min，处死小鼠，保存肝脏组织，称重后进行相关指标检测。我们发现HFD组与Control相比小鼠体重显著升高，HFD+CB组中丁酸梭菌干预后小鼠体重显著降低（图1.A）。HFD组肝/体重比显著升高，而HFD+CB组中丁酸梭菌干预后肝/体重显著降低（图1.B）。通过肝损伤(ALT、AST)、脂代谢(TG、TC)、HE染色、油红O染色指标评估小鼠肝脏病理变化。肝脏ALT和AST水平在HFD组中显著升高，在HFD+CB组中丁酸梭菌干预后显著降低（图1.C-D）。血清脂代谢指标TG和TC在HFD组中显著升高，在HFD+CB组中丁酸梭菌干预后中显著降低（图1.E-F）。肝脏脂代谢指标TG和TC在HFD组中显著升高，在HFD+CB组中丁酸梭菌干预后显著降低（图1.G-H）。以上结果表明，在丁酸梭菌可以缓解小鼠高脂饮食诱导的肝损伤，并促进肝脏脂质代谢。
图1. 小鼠体重、血清及肝脏指标变化。 (A)小鼠体重增长情况。(B)小鼠肝/体重比。(C-D)小鼠血清中ALT和AST水平。（E-F）小鼠血清中TG和TC水平。（G-H）小鼠肝脏TG和TC水平。
HE染色发现，HFD组小鼠的肝脏中可见大量脂滴，提示肝脏脂肪变性（图2）。使用油红 O染色在 HFD组小鼠肝脏中观察到了较大面积的油红O着色，也证实了肝细胞脂质堆积（图2）。相比之下，HFD+CB组中丁酸梭菌干预后，肝脏组织病理损伤明显减轻，尤其是脂滴更小更少，油红O染色更浅（图2）。通过以上实验证实丁酸梭菌缓解高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝。
图2.小鼠肝脏组织学变化。肝脏组织HE染色和油红O染色。比例尺为100μm。
（2）丁酸梭菌代谢物SCFA通过激活PPARα缓解小鼠非酒精性脂肪肝。
是肠道菌群主要代谢产物。对小鼠非酒精性脂肪肝模型中小鼠的粪便和血清中的SCFAs进行质谱分析，检测丁酸梭菌处理后SCFAs是否存在差异。我们发现肠道中乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸和异戊酸在HFD组和HFD+CB组中显著升高，其中HFD+CB组中丁酸含量与HFD组相比显著上升（图3.A）。另外发现，在HFD组和HFD+CB组血清中乙酸、丙酸、正戊酸和异戊酸均显著升高，其中HFD+CB组丁酸含量与HFD组相比显著上升（图3.B）。我们发现丁酸是显著差异代谢产物。以上结果表明，给小鼠饲喂丁酸梭菌后，导致了粪便和血清中丁酸含量增加。
图3.丁酸梭菌处理对小鼠SCFAs的影响。(A) 粪便乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、异戊酸含量；(B) 血清乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、异戊酸含量。
另外短链脂肪酸可有效激活PPARα信号通路，我们检测了PPARα靶基因Cpt1a 和Acox1基因表达变化，Cpt1a 和Acox1还是脂代谢相关基因，发现HFD+CB组丁酸梭菌干预后与HFD组相比Cpt1a 和Acox1表达显著升高（图4.A-B）。我们推测丁酸梭菌代谢产物丁酸通过激活PPARα促进肝脏脂质代谢从而缓解小鼠脂肪肝。以上结果表明，丁酸梭菌代谢产物丁酸可通过激活PPARα信号通路促进脂代谢。
图4.丁酸梭菌处理对小鼠肝脏PPARα信号通路下游靶基因。（A-B）QPCR检测Cpt1a、Acox1表达变化。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法
课题组成员长期从事肝再生、肝纤维化、铁死亡发生发展机制研究，在免疫组化、免疫印迹、实时荧光定量PCR、RNA 干扰、慢病毒包装、分离肝细胞、肝星形细胞、各种肝损伤模型等各个方面积累了大量的经验，本项目中所用到的实验技术以前均有所涉及，为本项目的实施提供了技术保障。本项目所需的主要仪器设备目前均已经具备，本项目所需的条件敲除小鼠及主要试剂已准备完毕，为本项目的实施提供了物质保障。 

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 实验耗材 17000.00 3000.00
1. 业务费 3000.00 无 0.00 3000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 3000.00 润色 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 17000.00 实验小鼠、试剂耗材 17000.00 0.00
结束

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